腦膠質(zhì)瘤的MRI診斷及晝夜節(jié)律基因CRY1對腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)特性研究?

吳 娟 王 棒 陳碩碩 王大巍

蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 (安徽 蚌埠 233000)

眾所周知，人體的身體遵循著一定的晝夜節(jié)律進(jìn)行正常的生理機(jī)能活動(dòng)，這一由24小時(shí)的晝夜節(jié)律形成的內(nèi)源性時(shí)鐘系統(tǒng)被轉(zhuǎn)化為新陳代謝和行為的節(jié)律。晝夜節(jié)律來源于拉丁語詞根“circa”(about)和“diem”(day)，并作為廣泛的生理功能的重要調(diào)節(jié)器，包括新陳代謝，睡眠，體溫，血壓，內(nèi)分泌，免疫，心血管和腎功能，對人類更好的適應(yīng)生活，學(xué)習(xí)，工作，維持健康發(fā)揮著十分重要的作用[1-2]。晝夜節(jié)律使人體通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)達(dá)到分子水平的時(shí)間穩(wěn)態(tài)，每24小時(shí)產(chǎn)生一次蛋白質(zhì)表達(dá)的峰值，以控制特定生物過程對太陽日最活躍的時(shí)間。核心時(shí)鐘成分(CLOCK，NPAS2，ARNTL/BMAL1，ARNTL2/BMAL2，PER1，PER2，PER3，CRY1和 CRY2)的轉(zhuǎn)錄和翻譯在節(jié)奏產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用，晝夜節(jié)律與晝夜周期同步，晝夜節(jié)律的破壞有助于心血管疾病、癌癥、代謝綜合征和衰老的病理學(xué)[3]。作為轉(zhuǎn)錄阻遏物的核心時(shí)鐘基因: CRY1形成反饋環(huán)的負(fù)肢，并與 CLOCK |NPAS2-ARNTL/BMAL1 | ARNTL2/BMAL2異二聚體相互作用抑制其活性，從而負(fù)調(diào)節(jié)其自身的表達(dá)。CRY1 作為分子守門人以維持 CLOCK-ARNTL/BMAL1處于平衡和抑制狀態(tài)，直到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄激活時(shí)間然后抑制 CLOCK-ARNTL/BMAL1誘導(dǎo)的 BHLHE40/DEC1轉(zhuǎn)錄[4]。

CRY1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，編碼一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合蛋白，是晝夜節(jié)律核心振蕩復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律時(shí)鐘，它的失調(diào)有助于腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展。且研究證明小鼠相關(guān)基因的缺失就導(dǎo)致完全黑暗的晝夜節(jié)律周期縮短。

腦膠質(zhì)瘤是最常見的腦癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)最多見的惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國家癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的2022年全國癌癥報(bào)告的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，腦癌的發(fā)病率達(dá)到10.9%，死亡率達(dá)到5.9%，中位總生存期僅為12-15個(gè)月[5]，其具有極高的發(fā)病率和病死率，總體生存率和預(yù)后極差，手術(shù)切除，術(shù)后放療和替莫唑胺同步化療對膠質(zhì)瘤的作用效果并不理想[6-7]。目前，臨床診斷主要依靠磁共振成像(MRI)檢查；MRI檢查發(fā)現(xiàn)2個(gè)及以上腦葉受累，信號特點(diǎn)為片狀彌散性T1低信號、T2高信號，可無明顯強(qiáng)化，這也是目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷時(shí)唯一需要影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的疾病。腦膠質(zhì)瘤邊界不清，表現(xiàn)為長T1、長T2信號影，信號可以不均勻，周邊水腫輕重不一。T1WI表現(xiàn)為等信號或低信號，T2WI和FLAIR表現(xiàn)為高信號，DWI部分病灶可呈高信號。如果占位效應(yīng)輕，增強(qiáng)掃描多無明顯強(qiáng)化或輕度強(qiáng)化。MRI主要顯示腦膠質(zhì)瘤出血、壞死、水腫組織等的不同信號強(qiáng)度差異及占位效應(yīng)，并且可以顯示病變的侵襲范圍。目前分子標(biāo)志物對腦膠質(zhì)瘤的個(gè)體化治療及臨床預(yù)后判斷具有重要意義，隨著生物信息學(xué)對膠質(zhì)瘤特異性表達(dá)基因篩查出的晝夜節(jié)律基因CRY1與膠質(zhì)瘤的關(guān)系的不斷發(fā)展，腫瘤治療和研究有了新的突破，基因靶向分子治療成為近年來腫瘤治療和研究的熱點(diǎn)，不僅如此，由于以往研究證明晝夜節(jié)律系統(tǒng)有節(jié)律地調(diào)節(jié)抗癌治療的療效，這導(dǎo)致了時(shí)間療法的創(chuàng)新想法[8-9]，基于此，研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、探索膠質(zhì)瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵分子事件為臨床診斷和預(yù)后尋找新的指標(biāo)，以及為靶向藥物治療尋找新的靶點(diǎn)至關(guān)重要[10]。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)處理下載來自癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)網(wǎng)站結(jié)合基因型-組織表達(dá)門戶網(wǎng)站(GTEx)的膠質(zhì)瘤樣本和非腫瘤樣本中CRY1的表達(dá)的單細(xì)胞RNA-Seq數(shù)據(jù)，并使用R軟件包“Seurat”進(jìn)行處理,同時(shí)GEPIA2網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)顯示了CRY1在膠質(zhì)瘤瘤中表達(dá)的差異(TCGA腫瘤組織vs TCGA正常組織的)。

1.2 膠質(zhì)瘤的預(yù)后生存分析

以CRY1表達(dá)的中位數(shù)為閾值，將患者分為高(50%)和低(50%)表達(dá)組，并采用Kaplan-Meier分析生成生存曲線，log-rank檢驗(yàn)確定總生存(OS)和無病生存期(DFS)的相關(guān)性。

1.3 膠質(zhì)瘤的遺傳變異分析神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遺傳變異信息，從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載，使用cBioPortal網(wǎng)站(https://www.cbioportal.org/)，這是一個(gè)開放獲取的癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)集的存儲庫[11-12]，分析所有TCGA腫瘤的改變頻率、突變類型的結(jié)果，探索高或低風(fēng)險(xiǎn)組的改變峰值信息。突變位點(diǎn)信息通過“突變”模塊顯示在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖或3D結(jié)構(gòu)中,使用了“比較”模塊來獲得TCGA癌癥病例CRY1基因改變的總體,進(jìn)展和疾病生存率差異的數(shù)據(jù),卡普蘭-邁耶圖與對數(shù)秩P值也產(chǎn)生，并且選擇總生存期OS(overall survival)，疾病特異性生存期DSS(disease-specific survival)，無病生存期DFS(disease-free survival)，無進(jìn)展生存期PFS(progression free survival)來分析CRY1基因變異的生存分析。

1.4 膠質(zhì)瘤的免疫細(xì)胞浸潤分析為了分析CRY1表達(dá)與膠質(zhì)瘤免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系，我們使用TIMER 2.0工具處理所有癌癥的TCGA數(shù)據(jù)，這是一個(gè)系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤的綜合資源數(shù)據(jù)庫，分析膠質(zhì)瘤中四種免疫浸潤(CD4+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和DC細(xì)胞)的豐度，用散點(diǎn)圖進(jìn)行驗(yàn)證，數(shù)據(jù)分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)得到P值和偏相關(guān)值。

1.5 膠質(zhì)瘤中與CRY1共表達(dá)蛋白的分析使用STRING 2.0數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)對膠質(zhì)瘤組織中與CRY1共表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析，這是一個(gè)已知和預(yù)測的蛋白-蛋白相互作用的PPI(protein-Protein interaction networks)數(shù)據(jù)庫，用來分析蛋白質(zhì)之間的功能相互作用。然后利用在線工具GEPIA2篩選與CRY1結(jié)合的蛋白，獲得蛋白相互作用圖，結(jié)合癌癥調(diào)控因子探索者網(wǎng)站(http://explorer.cancerregulome。org/)搜索、過濾和可視化從TCGA數(shù)據(jù)中生成的分析數(shù)據(jù)，獲得與CRY1表達(dá)相關(guān)的前10個(gè)重要蛋白，用于進(jìn)一步分析和散點(diǎn)作圖。

1.6 GO和KEGG通路分析為了進(jìn)一步探究模塊基因和關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能，使用“聚類分析器”中的R包進(jìn)行GO(gene ontology)大規(guī)模功能富集研究分析和從基因，分子網(wǎng)絡(luò)的角度系統(tǒng)分析基因功能的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，P<0.05。

1.7 基因集合富集分析(GSEA)為了探討CRY1在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的潛在分子功能，采用GSEA軟件R pakage進(jìn)行富集分析，設(shè)置P<0.05，根據(jù)CRY1表達(dá)的中位數(shù)將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,以預(yù)測CRY1相關(guān)的信號通路和生物學(xué)過程。根據(jù)富集分析結(jié)果，篩選出的與膠質(zhì)瘤相關(guān)的信號通路中，其中在NOMP<0.05、FDR<0.25和| NES |>1處顯著豐富，本研究涵蓋了參與生長、免疫和通路信號傳導(dǎo)的明確定義的基因集，采用基因集合富集分析(GSEA)確定其名義(NOM)P值、FDR和歸一化富集評分。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用Mean± SEM或者SD表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次，結(jié)果用R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對于倆組間比較的數(shù)據(jù)，我們使用配對t檢驗(yàn)，對于多組間比較的數(shù)據(jù)則用單因素方差分析，而對于組間多重比較的數(shù)據(jù)，我們采用LSD-t比較檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分別為?P<0.05、??P<0.01、???P<0.001。

2 結(jié)果

2.1 CRY1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的高表達(dá)水平為了研究CRY1在黑色素瘤進(jìn)展中的作用，分析癌癥基因組圖譜TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)門戶網(wǎng)站的163個(gè)膠質(zhì)瘤瘤組織樣本和207個(gè)非腫瘤組織樣本中CRY1的表達(dá)，TIMER2.0網(wǎng)站顯示了CRY1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的差異(TCGA腫瘤vsTCGA正常的)，發(fā)現(xiàn)它在各種腫瘤組織中廣泛表達(dá)，但水平較低(圖1A、1B)?；贚emma包分析，發(fā)現(xiàn)CRY1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯著上調(diào)(圖1C)。調(diào)查了風(fēng)險(xiǎn)評分與不同臨床病理因素(種族、年齡、性別、分期)之間的關(guān)系(圖1D)，同時(shí)CRY1的表達(dá)也可以通過分析CRY1基因在種族，性別，年齡中的甲基化表達(dá)水平來證實(shí)(圖1E)。以上結(jié)果表明，與正常組織相比，膠質(zhì)瘤組織中CRY1表達(dá)顯著上調(diào)，且預(yù)測CRY1的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良相關(guān)。

圖1A-圖1E 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中CRY1的高表達(dá)水平；圖1A 采用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析TCGA數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤類型中CRY1的表達(dá)水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；圖1B箱式圖顯示CRY1在不同腫瘤類型中的表達(dá)水平；圖1C 使用Limma軟件包分析神經(jīng)膠質(zhì)瘤中CRY1的表達(dá)水平；圖1D CRY1表達(dá)水平與不同臨床病理因素(種族、年齡、性別、分期)之間的聯(lián)系；圖1E CRY1的表達(dá)水平通過分析在種族，性別，年齡中的甲基化表達(dá)水平。

2.2 膠質(zhì)瘤患者的模型預(yù)后分析根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分的中位數(shù)將GBM患者分為低危組和高危組，Kaplan-Meier生存曲線顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分和生存狀態(tài)的分布，表明風(fēng)險(xiǎn)評分較高的患者總生存時(shí)間較短，死亡人數(shù)較多，同時(shí)ROC曲線顯示，在TCGA隊(duì)列中，prl對預(yù)測總生存OS和DFS有很強(qiáng)的預(yù)后價(jià)值(圖2A-2B)。綜上所述，結(jié)合種族及腫瘤分級等驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CRY1基因的mRNA高表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤不良預(yù)后明顯相關(guān)(圖2C)。

圖2A-圖2C CRY1高表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的生存分析；圖2A 運(yùn)用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗(yàn)，熱圖和其對應(yīng)的高相關(guān)性的生存曲線圖顯示了CRY1的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的總生存期的關(guān)系；圖2B 運(yùn)用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗(yàn),熱圖和其對應(yīng)的高相關(guān)性的生存曲線圖顯示了CRY1的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的無病生存期的關(guān)系；圖2C 結(jié)合種族及腫瘤分級等，同時(shí)驗(yàn)證CRY1的mRNA高表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤不良預(yù)后的關(guān)系。

2.3 CRY1基因突變情況及生存預(yù)后分析登錄cBioPortal網(wǎng)站(https://www.cbioportal.org/)，觀察所有TCGA腫瘤的改變頻率、突變類型的結(jié)果(圖3A)，CRY1的突變位點(diǎn)信息通過“突變”模塊顯示在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖或3D結(jié)構(gòu)中(圖3B)，“比較”模塊獲得TCGA癌癥病例CRY1基因改變的總體，進(jìn)展和疾病生存率差異的數(shù)據(jù)，卡普蘭-邁耶圖與對數(shù)秩P值也產(chǎn)生，選擇總體生存曲線(overall survival)，疾病特異性生存曲線(disease-specific survival)，無疾病生存曲線(disease free survival)，無進(jìn)展期生存曲線(progression Free survival)，分析CRY1基因變異的生存曲線圖。

圖3A-圖3D TCGA數(shù)據(jù)分析CRY1基因突變情況及其生存預(yù)后分析；圖3A The CBIOPORTAL數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，在不同的腫瘤類型中，跨CRY1蛋白結(jié)構(gòu)域的突變類型和CRY1突變頻率；圖3B CRY1蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析，圖中數(shù)據(jù)表明CRY1突變位點(diǎn)(R348C/H)在CRY1中變化頻率最高；圖3C-圖3D Kaplan-Meier曲線和logrank檢驗(yàn)，顯示CRY1突變狀態(tài)與總體生存，疾病特異性，無疾病和無進(jìn)展生存期的潛在關(guān)系。

2.4 CRY1的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)為了可視化與膠質(zhì)瘤免疫細(xì)胞浸潤之間的表達(dá)水平，TIMER2.0“Gene”模塊做出CRY1表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤免疫細(xì)胞浸潤水平之間相關(guān)性熱圖(圖4A)，經(jīng)過一系列分析，我們觀察到CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、DC、NK、內(nèi)皮細(xì)胞的免疫浸潤與CRY1的表達(dá)呈正相關(guān)(圖4B)，但與DC、NK細(xì)胞呈統(tǒng)計(jì)學(xué)負(fù)相關(guān)(圖4C)，用散點(diǎn)圖進(jìn)行驗(yàn)證，以顯示浸潤估計(jì)值與基因表達(dá)之間的關(guān)系，斯皮爾曼相關(guān)性來執(zhí)行此關(guān)聯(lián)。sCNA模塊通過基因的sCNA狀態(tài)比較TCGA癌癥類型的免疫浸潤分布，GISTIC2.0 估計(jì)基因水平拷貝數(shù)分割譜的sCNA 信息，包括“深度缺失”、“手臂級缺失”、“二倍體/正?！?、“手臂級增益”和“高擴(kuò)增”，分析表明，膠質(zhì)瘤中幾種免疫細(xì)胞浸潤水平似乎和CRY1基因拷貝數(shù)改變有關(guān)，其中包括CD4+T細(xì)胞和DC細(xì)胞(補(bǔ)充圖1)。為了進(jìn)一步評估免疫浸潤對膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的影響，結(jié)果模塊探索膠質(zhì)瘤免疫亞群的臨床相關(guān)性，并靈活地在多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型中校正，結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞水平高與不良預(yù)后有關(guān)(補(bǔ)充圖2)。

圖4A-圖4C CRY1表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者免疫浸潤的關(guān)系；圖4A CRY1表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者免疫細(xì)胞浸潤水平之間相關(guān)性的熱圖；圖4B 膠質(zhì)瘤患者中CRY1表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、DC、NK、內(nèi)皮細(xì)胞的正相關(guān)水平；圖4C膠質(zhì)瘤患者中CRY1表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞DC、NK的負(fù)相關(guān)水平。

2.5 CRY1基因突變與膠質(zhì)瘤患者的免疫細(xì)胞浸潤水平為了探索CRY1基因突變的膠質(zhì)瘤和未發(fā)生CRY1突變的膠質(zhì)瘤之間免疫細(xì)胞浸潤水平,做出其對數(shù)倍變化熱圖(圖5A)，并做出CRY1突變型與野生型CRY1的腫瘤之間免疫細(xì)胞浸潤水平差異的小提琴圖(圖5B)，運(yùn)用Wilcoxon檢驗(yàn)分析，對鑒定體細(xì)胞CRY1突變在基因表達(dá)模式中的功能影響對于精確的腫瘤學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。

圖5A-圖5B CRY1基因突變與膠質(zhì)瘤患者的免疫細(xì)胞浸潤；圖5A CRY1基因突變的膠質(zhì)瘤和未發(fā)生CRY1突變的膠質(zhì)瘤之間免疫細(xì)胞浸潤水平的熱圖；圖5B CRY1突變型與野生型CRY1的腫瘤之間免疫細(xì)胞浸潤水平差異的小提琴圖。

圖6 從GSEA分析中得到的富集圖；綜合GSEA分析顯示，CRY1高表達(dá)表型中的“Chemokine通路(Chemokine signaling pathway)”,“ECM通路(Extracellular matrix)”,“EGF信號通路(EGF signaling pathway)”，“Hippo信號通路(Hippo signaling pathway)”，“P53信號通路(P53 signaling pathway)”，“TGF通路(TGF signaling pathway)”，“WNT信號通路(WNT signaling pathway)”均有差異富集?？s寫：GSEA，基因集合富集分析；ES，富集評分；NES，歸一化ES；NOM p-val，歸一化P值。

2.6 CRY1的基因集富集分析(GSEA)為了探討CRY1在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的潛在分子功能，GSEA軟件進(jìn)行富集分析，設(shè)置P<0.05，根據(jù)CRY1表達(dá)的中位數(shù)將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，篩選出的與膠質(zhì)瘤相關(guān)的生物學(xué)功能共表達(dá)的信號通路，其中在NOMP<0.05、FDR<0.25處顯著豐富，參與腫瘤發(fā)生上調(diào)的通路有“Chemokine通路(chemokine signaling pathway)”，“ECM通路(extracellular matrix)”,“EGF信號通路(EGF signaling pathway)”，“Hippo信號通路(Hippo signaling pathway)”，“P53信號通路(P53 signaling pathway)”，“TGF通路(TGF signaling pathway)”，“WNT信號通路(WNT signaling pathway)”等，富集結(jié)果如圖六。

2.7 與CRY1共表達(dá)的基因分析CRY1基因通過多條信號通路影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖分化等生物學(xué)功能，STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)篩選了有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的與CRY1結(jié)合的相關(guān)的蛋白，檢索已知蛋白間的互作關(guān)系，可視化分析得到蛋白相互作用圖(圖7A)，用GEPIA2進(jìn)行相關(guān)性分析，選擇與CRY1相關(guān)的前10個(gè)顯著基因進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖7B-7C)，散點(diǎn)圖進(jìn)行繪制，基因相關(guān)性熱圖(圖7D)。

圖7A-圖7D 與CRY1共表達(dá)的相關(guān)基因分析；圖7A 首先使用STRING工具獲得了可用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可確定的CRY1結(jié)合蛋白，并做出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；圖7B GEPIA2數(shù)據(jù)庫，獲得了TCGA數(shù)據(jù)庫中與CRY1相關(guān)的前10個(gè)基因，并分析了CRY1與所選擇的靶向基因之間的表達(dá)相關(guān)性，包括SEPT2 MATR3 FUBP3 RIC8B EPC2 SPIN1 RAB5A ZNF664 VE2F1 HNRNPLL；圖7C-圖7D 顯示了與CRY1共表達(dá)膠質(zhì)瘤中相應(yīng)的熱圖和對應(yīng)的散點(diǎn)圖。

2.8 通過RNA-Seq測序分析U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CRY1敲低的表達(dá)譜為了深入了解CRY1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的功能，全基因組RNA測序，設(shè)計(jì)U251細(xì)胞系在CRY1基因敲低條件和敲低對照條件下的RNA-seq，探索整體轉(zhuǎn)錄組的變化(圖8A)。在敲低CRY1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，共有131個(gè)基因的表達(dá)受到顯著影響,其中包括94個(gè)上調(diào)，37個(gè)下調(diào)的高度差異表達(dá)基因，用火山圖表示(圖8B)。為了研究敲低后最重要的生物學(xué)功能，對整個(gè)轉(zhuǎn)錄組和高度變化的基因進(jìn)行KEGG富集分析和GO分類分析，GO分析顯示差異表達(dá)基因在生物過程中富集(圖8C-8D)。熱圖顯示了與細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、抗病毒、增強(qiáng)細(xì)胞毒作用、促白細(xì)胞趨化和抗細(xì)胞增殖相關(guān)的差異表達(dá)基因DEGs(圖8E)。

圖8A-圖8E 通過RNA-Seq測序分析U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CRY1敲低的表達(dá)譜；圖8A，CRY1 U251干擾的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和干擾對照的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因(DEGs)的分層聚類；圖8B CRY1 U251干擾的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和U251干擾對照的膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)基因(DEGs)的火山圖譜；圖8C-D DEGs的KEGG富集分析和GO分類分析,顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異的項(xiàng)的分布(Fisher精確檢驗(yàn)，P值調(diào)整使用本杰明-霍赫伯格程序，用顏色尺度表示)；圖8E 熱圖顯示了與細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、抗病毒、增強(qiáng)細(xì)胞毒作用、促白細(xì)胞趨化和抗細(xì)胞增殖相關(guān)的DEGs。

3 討論

眾所周知，晝夜節(jié)律的破壞對心血管疾病、癌癥、代謝綜合征和衰老等等病理學(xué)產(chǎn)生極其重要的影響，且基因表型的時(shí)辰特異性可能作為影響腫瘤生長，提高腫瘤的治療效果[13]。CRY1(cryptochrome circadian regulator 1)是一個(gè)關(guān)鍵的晝夜節(jié)律基因。在嚙齒類動(dòng)物中，大約有7%的晝夜節(jié)律基因調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡[14]，24小時(shí)的晝夜節(jié)律形成的內(nèi)源性時(shí)鐘系統(tǒng)以一種組織特異性的方式調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄[15]。晝夜節(jié)律基因CRY1作為轉(zhuǎn)錄阻遏物的核心時(shí)鐘基因，形成反饋環(huán)的負(fù)肢，并與CLOCK| NPAS2-ARNTL/BMAL1 | ARNTL2/BMAL2異二聚體相互作用抑制其活性，從而負(fù)調(diào)節(jié)其自身的表達(dá)。同時(shí)，CRY1作為分子守門人以維持 CLOCK-ARNTL/BMAL1處于平衡和抑制狀態(tài)，直到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄激活時(shí)間然后抑制 CLOCK-ARNTL/BMAL1誘導(dǎo)的 BHLHE40/DEC1轉(zhuǎn)錄。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[16-17]，預(yù)后極差[18-19]，目前，臨床診斷主要依靠磁共振成像(MRI)檢查等影像學(xué)診斷方法膠質(zhì)瘤，磁共振彌散加權(quán)成像(DWI)、磁共振彌散張量成像(DTI)、磁共振灌注成像(PWI)、磁共振波譜成像(MRS)、功能磁共振成像(fMRI)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)等對腦膠質(zhì)瘤的鑒別診斷及治療效果評價(jià)有重要意義。T1WI表現(xiàn)為等信號或低信號，T2WI和FLAIR表現(xiàn)為高信號，DWI部分病灶可呈高信號。隨著生物信息學(xué)對膠質(zhì)瘤特異性表達(dá)基因篩查出的晝夜節(jié)律基因CRY1與膠質(zhì)瘤的關(guān)系的不斷發(fā)展，晝夜節(jié)律基因CRY1在其表達(dá)中表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性，并在參與分子靶點(diǎn)、細(xì)胞周期、凋亡等過程中產(chǎn)生振蕩[20]，腫瘤治療和研究有了新的突破，基因靶向治療成為近年來腫瘤治療和研究的熱點(diǎn)，研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、探索膠質(zhì)瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵分子事件為臨床診斷和預(yù)后尋找新的指標(biāo)，免疫特異性療法以及為靶向藥物治療尋找新的靶點(diǎn)至關(guān)重要。

綜上所述，生物鐘基因CRY1在膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)為高表達(dá)水平，且CRY1的高表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤較差的臨床病理特征和不良預(yù)后密切相關(guān)。篩查發(fā)現(xiàn)CRY1具有較高的免疫浸潤率，則對免疫治療的敏感性更高，在RNA-Seq證明的許多分子病理過程中生物鐘基因CRY1起著重要作用，因此晝夜節(jié)律基因CRY1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。至此，我們的研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明CRY1可能是一種新的生物標(biāo)志物的潛在靶點(diǎn)，對膠質(zhì)瘤免疫治療生物標(biāo)志物具有潛在意義。