水稻小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

查中萍，郭 英，殷得所，王紅波，胡建林，鄭興飛，董華林，薛 蓮，胡 鵬，羅肖隕，徐得澤

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

水稻（Oryza sativaL.）是中國重要的糧食作物［1，2］。常規(guī)的雜交水稻育種法需要親本雜交之后再通過6～8 代的回交和定向篩選才能實(shí)現(xiàn)優(yōu)良性狀的遺傳改良。利用單倍體育種技術(shù)則可以直接獲得優(yōu)良純合個(gè)體，縮短育種進(jìn)程［2，3］。水稻小孢子培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)都是常用的單倍體育種方法。Guha等［4］發(fā)現(xiàn)花粉粒可以脫離正常配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育并在體外誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生單倍體植株，單倍體培養(yǎng)技術(shù)逐漸發(fā)展起來。水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，該技術(shù)具有加速性狀穩(wěn)定、縮短育種年限、提高選擇效率等優(yōu)點(diǎn)，在種質(zhì)資源創(chuàng)新、雜種優(yōu)勢利用以及水稻分子育種上被廣泛應(yīng)用［5-13］。小孢子培養(yǎng)是直接從花蕾或者花藥中分離新鮮的小孢子，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，采用適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體從而獲得單倍體植株，再通過技術(shù)手段使染色體加倍，獲得純合可育的雙單倍體（DH）。與花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)可以排除花藥壁和絨氈層細(xì)胞的干擾，研究者可以在單倍體、單細(xì)胞水平上進(jìn)行遺傳操作［14，15］。本研究根據(jù)水稻小孢子培養(yǎng)的研究情況，綜述了影響小孢子培養(yǎng)的主要影響因素以及小孢子培養(yǎng)技術(shù)面臨的問題，并對小孢子培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 小孢子分離純化方法

水稻小孢子位于花藥內(nèi)，每個(gè)花藥有2 000～4 000 個(gè)小孢子。小孢子分離，即將經(jīng)過預(yù)處理的幼穗經(jīng)常規(guī)消毒（同一般組織培養(yǎng)消毒流程），然后在無菌條件下從花藥中分離小孢子。分離小孢子的方法可歸納為擠壓法、器械法和散落法3 種。

1.1 擠壓法

陳英等［16］分別用注射器內(nèi)管擠壓或磁力攪拌法從花藥中分離出花粉，經(jīng)過篩及500 r/min 離心2～3 次（每次2 min 左右），使小孢子從花藥中游離到抽提液中取得純凈花粉粒，王玲仙等［17］利用玻棒擠壓獲得分離的小孢子。通過無菌不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)篩去除比小孢子大的組織碎片，收集小孢子懸浮液。由于水稻花粉粒直徑一般在40～65 μm，故濾網(wǎng)一般選擇150～300 目。收集好的小孢子懸浮物從500～800 r/min 轉(zhuǎn)速低速離心使小孢子純化。前期研究發(fā)現(xiàn)，由于轉(zhuǎn)速較低，為便于收集小孢子最好用13～15 mL 尖底玻璃離心管離心，棄上清液后加抽提液反復(fù)清洗2～3 次，以徹底洗脫懸浮液中的植物組織殘液，最后用培養(yǎng)液（誘導(dǎo)培養(yǎng)基）清洗1 次，即可制備成小孢子懸浮液并轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 器械法

為了提高分離效果，一些研究者探索用機(jī)器分離小孢子。常用的方法是利用超速旋切機(jī)或勻漿機(jī)將水稻花藥切碎，從而釋放出游離小孢子。陸瑞菊等［14］、郭桂梅等［15］使用勻漿機(jī)高速旋切幼穗，懸浮液用150 目篩網(wǎng)過濾，濾液以700 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，重復(fù)3 次，收集小孢子。前期研究發(fā)現(xiàn)，由于水稻幼穗枝梗的木質(zhì)化程度較高，放入容器直接利用旋切機(jī)或勻漿機(jī)處理后殘?jiān)^多容易堵塞濾網(wǎng)而影響小孢子分離效率。因此，最好去除較老的枝梗，或者剪下每朵穎花進(jìn)行旋切。

1.3 散落法

選用合適滲透壓的培養(yǎng)基對花藥進(jìn)行液體漂浮培養(yǎng)時(shí)花藥會(huì)自行開裂，小孢子從花藥裂口處散落到培養(yǎng)基中，利用這種方法收集小孢子的方法叫散落法。陳英等［16］將花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液面，先后自然裂開，不斷釋放出花粉。定期將花藥從培養(yǎng)瓶中取出，轉(zhuǎn)入另外培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，再釋放花粉。過一定時(shí)期再將這些花藥轉(zhuǎn)出，這樣花藥被先后轉(zhuǎn)出，各培養(yǎng)瓶中留下不同時(shí)期由花藥釋放出的花粉，供繼續(xù)培養(yǎng)。王玲仙等［17］采用碳饑餓散落法處理花藥，即培養(yǎng)時(shí)不添加蔗糖而是用甘露醇代替來調(diào)節(jié)滲透壓，研究發(fā)現(xiàn)采用碳饑餓散落法能加速小孢子的散落速度而且收集量大。劉成洪等［18］以21%蔗糖溶液純化小孢子懸浮液，加無糖溶液調(diào)節(jié)滲透壓以600 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上清液后加1.5 mL 誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)皿中。

2 影響小孢子培養(yǎng)的主要因素

2.1 基因型

小孢子培養(yǎng)由花藥培養(yǎng)發(fā)展而來，因此小孢子培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)方式相同，供體品種的基因型是影響單倍體培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，基因型對愈傷組織或胚狀體的誘導(dǎo)率影響較大，沈錦驊等［19］對比分析了各種類型的水稻材料后，得出各類型水稻的花藥培養(yǎng)力由強(qiáng)到弱依次為糯稻、粳稻、秈粳型雜交稻、秈稻，但不同材料之間差異較大。粳稻類型相對于秈稻來說更易被誘導(dǎo)［12］，其愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)40%以上，一般也都會(huì)在10%以上［20］，而秈稻類型的花藥培養(yǎng)效率普遍偏低，其花粉培養(yǎng)的株產(chǎn)率平均只有1%～3%［16］。江樹業(yè)等［21］研究表明，秈稻雜交組合中若有培養(yǎng)效率較高的粳稻的血緣，其雜交F1的培養(yǎng)效率也會(huì)較好。陳兆貴等［22］研究表明，花藥培養(yǎng)力是受親本控制的遺傳性狀，如果父本和母本的培養(yǎng)力均較強(qiáng)，F(xiàn)1代的培養(yǎng)力也會(huì)較強(qiáng)。何濤［23］在研究影響秈稻花藥培養(yǎng)的因素及高培養(yǎng)力材料的篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的誘導(dǎo)和綠苗的分化之間相關(guān)性顯著，且均是由多基因控制的數(shù)量性狀。對水稻花藥培養(yǎng)效率的遺傳解析表明，愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率是由核基因控制的數(shù)量遺傳性狀，且這2 個(gè)性狀之間沒有關(guān)聯(lián)，可獨(dú)立遺傳［24］。其中，影響花藥培養(yǎng)力的基因被認(rèn)為在1 號(hào)染色體上，而控制綠苗與白苗分化比例的基因位于10 號(hào)染色體上［25］。何平等［24］對110 個(gè)DH 系進(jìn)行花藥培養(yǎng)力的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）分析，得到了與愈傷組織誘導(dǎo)有關(guān)的5 個(gè)QTLs，分別分布在第6、7、8、10 和12 號(hào)染色體上，與綠苗分化率有關(guān)的2 個(gè)QTLs 分布在第1 號(hào)和第9 號(hào)染色體上。研究認(rèn)為，如果將能提高愈傷誘導(dǎo)率和綠苗分化率的QTLs 聚合在一起，篩選出愈傷誘導(dǎo)率和綠苗分化率均較高的材料，將大幅度提升花藥的培養(yǎng)力［13］。由此可見，小孢子培養(yǎng)能力與其他遺傳性狀相同，是一種受基因調(diào)控的遺傳特性。

2.2 親本生理狀態(tài)及小孢子發(fā)育時(shí)期

親本植株的生理狀態(tài)對愈傷組織或胚狀體誘導(dǎo)頻率有直接影響。一般從發(fā)育健壯的植株上取花粉進(jìn)行培養(yǎng)效果較好。另外，游離小孢子培養(yǎng)還受供體植株生長條件的影響，如溫度、光照、光周期等。在氣溫不穩(wěn)定的季節(jié)，有時(shí)同一材料、生長在同一田地中只是取穗日期前后不同，小孢子胚狀體誘導(dǎo)率都有明顯差異。據(jù)胡忠等［26］報(bào)道，在昆明粳稻孕穗期間的溫度為18.5～20.0 ℃時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率要比氣溫為16～18 ℃時(shí)的誘導(dǎo)率高3～4 倍。

選擇合適發(fā)育時(shí)期的花粉是提高小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)率的重要因素?；ǚ郯l(fā)育在單核靠邊期是水稻花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期。田間取樣的適宜時(shí)間一般為晴天的8：00—10：00 或16：00—18：00，此時(shí)細(xì)胞處于旺盛的分裂期。處于單核中晚期的花粉細(xì)胞誘導(dǎo)愈傷組織的能力較強(qiáng)［27，28］。這個(gè)時(shí)期小孢子發(fā)育尚未進(jìn)入配子體發(fā)育階段，因此可以被迫增殖，表現(xiàn)出較高的被誘導(dǎo)率［29］。Chen［30］報(bào)道了花粉母細(xì)胞與四分體時(shí)期花粉在培養(yǎng)中停止在單核早期不產(chǎn)生愈傷組織，其他發(fā)育時(shí)期的花粉的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為單核早期5.6%、單核中晚期35.7%、第一次分裂期6.7%、雙核期0。在試驗(yàn)過程中，為了準(zhǔn)確找到單核中晚期花粉細(xì)胞，人們經(jīng)常用劍葉與其下一葉的葉枕間距離、穎殼的顏色及花藥長度作為外部形態(tài)指標(biāo)來進(jìn)行幼穗的選擇。通常花藥的單核靠邊期，穗苞飽滿而不破，穎殼淺綠色，花藥淡黃色，花藥長度伸長至穎殼2/5～1/2 處，劍葉與下一葉的葉枕距為8～12 cm，但這種形態(tài)判斷指標(biāo)比較粗放，不同的材料間存在較大差異，故不同的材料取材時(shí)要綜合衡量。

2.3 預(yù)處理

預(yù)處理是誘導(dǎo)小孢子由配子體發(fā)育轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育的重要因素。常用的方法包括熱激處理、低溫處理、鹽處理、輻射、滲透、化學(xué)處理等。預(yù)處理的目的在于人為地改變小孢子的內(nèi)在狀態(tài)，從而誘導(dǎo)小孢子轉(zhuǎn)入孢子體發(fā)育［5］。小孢子培養(yǎng)由花藥培養(yǎng)發(fā)展而來，因此，花藥培養(yǎng)的預(yù)處理也適應(yīng)小孢子培養(yǎng)。高溫?zé)峒ぬ幚砟芗涌煨℃咦臃至?，從而提高花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率。熱激溫度和熱激時(shí)間都對熱激效果有影響。李大林［31］于接種前將幼穗分別于40、45、50、55 ℃和60 ℃溫水中處理，發(fā)現(xiàn)40～45 ℃處理1～5 min 和60 ℃處理10 s 均取得誘導(dǎo)率高于對照的效果。郭桂梅等［15］研究證明，游離小孢子于32 ℃熱激預(yù)處理2 d 能提高小孢子的愈傷組織產(chǎn)量和綠苗產(chǎn)量。低溫預(yù)處理是簡單易行的預(yù)處理方法，具體步驟為將幼穗保留兩葉一節(jié)，用75%的乙醇棉球擦拭表面進(jìn)行消毒，然后用干凈的濕紗布包裹放入保鮮袋中，置于生化培養(yǎng)箱或冰箱中冷藏。低溫處理的作用機(jī)制是延緩花粉的退化、維持花粉發(fā)育的生理環(huán)境、提高源性生長素水平并降低乙烯水平、啟動(dòng)雄核發(fā)育等［32］。對離體幼穗進(jìn)行適當(dāng)天數(shù)的低溫處理可以提高花藥培養(yǎng)效率已被多數(shù)研究證實(shí)［33，34］。陸瑞菊等［14］研究比較了5 ℃4 d 和5 ℃8 d 低溫預(yù)處理對水稻花藥培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)5 ℃8 d 低溫預(yù)處理的效果明顯好于5 ℃4 d 的，平均愈傷組織產(chǎn)量提高了3.68 倍，平均綠苗產(chǎn)量提高了1.97倍。肖國櫻［32］的研究表明，低溫預(yù)處理20 d 內(nèi)時(shí)間越長，水稻花藥培養(yǎng)效果越好。張連平等［35］的研究表明，水稻花藥培養(yǎng)10 ℃下低溫預(yù)處理8 d 效果好于4 d，超過10 d 效果下降。周雄韜等［36］對4 個(gè)秈稻雜交組合的花粉在9～11 ℃下處理14 d，胚胎誘導(dǎo)率平均達(dá)到24.1%，綠苗率為7.93%。劉成洪等［18］對粳稻F1小孢子培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究表明，低溫（4 ℃）處理水稻幼穗12 d 在誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)量和分化綠苗產(chǎn)量上都要優(yōu)于16 d 處理。李三和等［37］報(bào)道最適溫度是10 ℃，取材后的低溫預(yù)處理可以明顯提高水稻花藥培養(yǎng)的愈傷誘導(dǎo)率。吳永忠等［38］將花藥接種于液體培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)0、3、5、7、10 d，再將花藥取出分離小孢子進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，表明花藥預(yù)培養(yǎng)7 d 后的小孢子能啟動(dòng)分裂。郭桂梅等［15］對甘露醇滲透和化學(xué)因素進(jìn)行小孢子培養(yǎng)預(yù)處理研究發(fā)現(xiàn)，花藥分別于60 g/L 甘露醇和10 mg/L 秋水仙堿中預(yù)處理3 d 均能明顯提高小孢子愈傷組織產(chǎn)量及綠苗產(chǎn)量。王玲仙等［17］于添加了Ficoll 和活性炭的預(yù)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)16 d 的花粉中成功培養(yǎng)出高活性的小孢子，并誘導(dǎo)出了愈傷組織。

2.4 基本培養(yǎng)基類型及生長調(diào)節(jié)劑配比

培養(yǎng)基中含大量元素、微量元素、附加物、生長調(diào)節(jié)劑和碳源等成分，這些成分的含量和比例對小孢子培養(yǎng)效率都有直接影響。培養(yǎng)基可分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。用于胚狀體或愈傷組織誘導(dǎo)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是關(guān)鍵，已經(jīng)研究出適合各種不同水稻小孢子培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，如N6、合5、M8、SK3 等［3，39-41］；査中萍等［3］的研究表明，改良的M8（GM8）培養(yǎng)基是水稻花藥培養(yǎng)最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，常見基本培養(yǎng)基見表1。

表1 小孢子培養(yǎng)常用基本培養(yǎng)基（單位：mg/L）

除基本培養(yǎng)基外，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的碳源和生長調(diào)節(jié)劑也是小孢子培養(yǎng)的重要影響因素。王光遠(yuǎn)等［42］認(rèn)為KM8p 培養(yǎng)基含有多種糖、有機(jī)酸和維生素等能為水稻小孢子的分裂提供良好的營養(yǎng)環(huán)境，能顯著提高小孢子的分裂頻率，同時(shí)蔗糖濃度為6%時(shí)最有利于胚狀體的發(fā)生。朱永生等［43］的研究證明，使用3%蔗糖+3%麥芽糖對胚狀體的發(fā)生及培養(yǎng)力的改善效果更佳。適當(dāng)?shù)纳L調(diào)節(jié)劑濃度和配比不僅影響小孢子的發(fā)育方向及誘導(dǎo)率，并對其形態(tài)發(fā)生起重要作用。用于水稻小孢子培養(yǎng)的外源生長調(diào)節(jié)劑有2，4-D、NAA，細(xì)胞分裂素類有KT、6-BA等。陳英等［16］報(bào)道粳稻花藥培養(yǎng)一般只需2.0 mg/L 2，4-D 即可獲得較好的誘導(dǎo)率，當(dāng)2，4-D 濃度高于10.0 mg/L 時(shí)，雖然能提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但綠苗分化率卻降低。該研究表明，在水稻小孢子培養(yǎng)過程中，需要兼顧愈傷誘導(dǎo)與綠苗分化2 個(gè)階段，合理調(diào)節(jié)2，4-D 的用量。研究報(bào)道多種生長調(diào)節(jié)劑配比更有利于水稻小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)，査中萍等［3］的研究證明，培養(yǎng)基NAA 3.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L 最有利于水稻花藥小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.5 培養(yǎng)方式

小孢子的培養(yǎng)方法有固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和固液雙層振蕩培養(yǎng)。吳暉霞等［44］對液體淺層培養(yǎng)和Transwell-CoL 培養(yǎng)盤2 種培養(yǎng)方式進(jìn)行了比較，認(rèn)為液體培養(yǎng)中出現(xiàn)的通氣不良問題，游離小孢子比花藥培養(yǎng)顯得更突出，沉在皿底的多細(xì)胞團(tuán)或早期胚狀體往往分裂遲緩、生長慢，有的停止分裂，甚至褐化。當(dāng)轉(zhuǎn)移這些褐化結(jié)構(gòu)到固體分化培養(yǎng)基后，大部分不能恢復(fù)生長。采用Tarsnwell-CoL 培養(yǎng)盤培養(yǎng)游離小孢子時(shí)，由于它的構(gòu)造優(yōu)于35 mm 的培育皿，小孢子可以通過膜接觸到液體培養(yǎng)基，能及時(shí)充分獲得養(yǎng)分，而不會(huì)沉到皿底，始終處于良好的通氣狀態(tài)中。申娟等［45］在蔬菜類作物小孢子培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，固液雙層振蕩培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率高于固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，不僅可以增加胚的數(shù)量，同時(shí)胚狀體的發(fā)育也較好。分析其原因可能是固液雙層振蕩培養(yǎng)可以改善液體培養(yǎng)基的通氣性使小孢子從活性高的液體培養(yǎng)基中汲取營養(yǎng)且胚狀體長大后又不會(huì)沉沒，使子葉胚產(chǎn)生率大大提高，胚也生長更健壯，提高了胚發(fā)育的同步性和胚的質(zhì)量，促進(jìn)了胚在成苗培養(yǎng)基上的直接成苗。王玲仙等［17］在液體培養(yǎng)基中加入Ficoll 和活性炭，提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率。培養(yǎng)基的通氣條件影響花粉的體胚發(fā)生，還會(huì)導(dǎo)致愈傷組織中的乳酸積累，引起白苗?；ǚ垡后w培養(yǎng)階段時(shí)在培養(yǎng)基中加入Ficoll，不僅可懸浮花粉，而且可懸浮花粉發(fā)育的體胚，從而提高花粉分裂頻率和得苗率，F(xiàn)icoll 還能使花粉釋放變慢，提高小孢子的活力，同時(shí)加入Ficoll后能提高培養(yǎng)基的滲透壓，以提高愈傷組織再生植株的頻率。

2.6 胚狀體的發(fā)生及植株再生的影響

胚狀體分化成植株是小孢子培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，該階段主要的影響因素是培養(yǎng)基組分。一般的做法是參考適宜于供試材料的分化培養(yǎng)基組分，通過對植物生長調(diào)節(jié)劑濃度、碳源成分、pH 等條件調(diào)節(jié)進(jìn)行改良。査中萍等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，能同時(shí)適用秈稻、粳稻的通用分化培養(yǎng)基為MS+KT 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30.0 g/L，pH 為5.8。

在對游離小孢子培養(yǎng)形成的早期胚狀體進(jìn)行再分化的工作中，發(fā)現(xiàn)將誘導(dǎo)培養(yǎng)14、21 d 時(shí)形成的早期胚狀體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，比28、35 d 時(shí)轉(zhuǎn)移的效果好。選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)14～21 d，直徑已達(dá)0.5 mm以上的早期胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基能獲得較高的綠苗再生頻率。過早將未達(dá)到直徑0.5 mm 的早期胚狀體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，胚狀體很難繼續(xù)生長；沒有及時(shí)將再生的早期胚狀體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上時(shí)，褐化的早期胚狀體會(huì)不斷增加，容易喪失分化能力，或?qū)е略偕谆绲念l率增加［45］。

小孢子培養(yǎng)所產(chǎn)生的單倍體植株常表現(xiàn)高度不育，需誘導(dǎo)染色體加倍。陸瑞菊等［14］研究報(bào)道預(yù)處理液中添加適量的秋水仙堿可以提高粳稻再生植株中雙單倍體植株的產(chǎn)量。

李朝燦［46］采用單倍體再生苗秋水仙堿浸根處理，平均加倍率達(dá)25.8%。對于水稻單倍體再生苗的浸根處理，秋水仙堿濃度以1 000 mg/L 為宜，處理時(shí)間以24 h 為宜，間歇處理加倍效果更好。用加有二甲基亞砜的秋水仙堿水溶液浸泡幼苗根和分蘗節(jié)誘發(fā)染色體加倍有很好效果［47］。楊漢民等［48］在小麥單倍體植株的加倍中也獲得類似的研究結(jié)果。

3 水稻小孢子培養(yǎng)存在的問題

盡管小孢子培養(yǎng)技術(shù)有許多優(yōu)勢，而且水稻小孢子培養(yǎng)研究取得了一定進(jìn)展，但仍不能廣泛應(yīng)用于育種，致使已育成的花培品種在生產(chǎn)中大面積推廣的數(shù)量還不多，效益不高。表明利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)育種在理論和實(shí)踐上還存在不少問題。主要表現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：一是誘導(dǎo)頻率和分化成苗率低，可重復(fù)性差，很難利用；二是水稻分化培養(yǎng)中均有白化苗現(xiàn)象發(fā)生，小孢子培養(yǎng)白化苗現(xiàn)象也很突出，雖然有一些研究從胚胎發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、代謝水平、分子水平等方面探究了小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制，但是孢子體發(fā)育的誘導(dǎo)機(jī)制、啟動(dòng)機(jī)制尚不明確。

4 水稻小孢子培養(yǎng)的前景展望

小孢子培養(yǎng)技術(shù)在十字花科、禾本科植物中應(yīng)用比較成熟，在大白菜、甘藍(lán)、菜心、小麥等植物中都建立了完整的培養(yǎng)體系［49］。隨著對小孢子培養(yǎng)的深入研究和小孢子發(fā)生機(jī)理的進(jìn)一步探索，依據(jù)水稻已有的花藥培養(yǎng)體系建立更有效、更完善的水稻小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系將成為可能。隨著水稻小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系的日益完善和成熟，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)將會(huì)更多地應(yīng)用于種質(zhì)創(chuàng)新、轉(zhuǎn)基因研究和分子標(biāo)記等領(lǐng)域。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)不僅會(huì)成為常規(guī)育種的重要組成部分，而且必將在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。同時(shí)，利用單倍體小孢子進(jìn)行誘變及突變體篩選，可以避免變異體為嵌合體，當(dāng)代就能選擇出隱性突變性狀，在游離小孢子培養(yǎng)的多細(xì)胞團(tuán)形成期、胚狀體形成期和胚狀體萌發(fā)成苗階段分別給予選擇壓，最終創(chuàng)造出抗病、耐逆新種質(zhì)。