燈盞花倍性的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)優(yōu)化

王夢(mèng)欽，董云龍，徐 達(dá)，陳曉波，張?jiān)品澹?

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2.生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程中心，昆明 650500）

多倍化是植物新物種形成的重要方式，在自然界中廣泛發(fā)生，可以幫助物種具備更廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力，在高等植物進(jìn)化中占有重要地位［1］。植物多倍化后形成更大的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存器官［2］，產(chǎn)生更快、更為豐富的次生代謝產(chǎn)物［3］，具有更強(qiáng)的抗病性和更好的環(huán)境適應(yīng)性［4］。諸如異源多倍體化的燕麥（Avena sativa）、小麥（Triticum aestivum）、甘蔗（Saccharum officinarum）以及同源多倍體化的馬鈴薯（Solanum tuberosum）、草莓（Fragaria ananassa）、咖啡（Coffea arabicaL.）、煙草（Nicotiana tabacumL.）等為人類(lèi)生產(chǎn)所利用［5］。燈盞花（Erigeron breviscapusHand.）又名短葶飛蓬、燈盞細(xì)辛，為菊科（Compositae）飛蓬屬植物，主要分布于中國(guó)云南?。ㄕ既珖?guó)95%以上），少數(shù)分布于四川、貴州和西藏等地［6］，可用于治療高血壓、心腦血管病等多種疾?。?］。燈盞花人工大田栽培病蟲(chóng)害嚴(yán)重，連作障礙明顯，嚴(yán)重制約了燈盞花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［8］。燈盞花多倍體具有株型大、有效成分較高、抗性強(qiáng)等特性，進(jìn)行燈盞花的多倍體品種選育是燈盞花育種的一種有效嘗試［9］。

傳統(tǒng)的植物倍性鑒定主要通過(guò)器官形態(tài)差異觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定、氣孔大小檢測(cè)等方法進(jìn)行推測(cè)，準(zhǔn)確度不高。采用染色體計(jì)數(shù)法雖然直觀、準(zhǔn)確，但對(duì)于染色體數(shù)目多、染色體小的植物而言，其技術(shù)要求相對(duì)較高［10］。流式細(xì)胞技術(shù)可針對(duì)細(xì)胞核中的DNA 進(jìn)行熒光標(biāo)記，快速準(zhǔn)確地測(cè)定其DNA 含量和倍性水平［11］，已廣泛用于蘋(píng)果（Malus pumilaMill.）、梨（Pyrus communis）、桑樹(shù)（Morus albaLinn.）、菘藍(lán)（Isatis indigoticaFortune）、草莓、水稻（Oryza sativaL.）、櫻桃（Cerasus pseudocerasus G.Don）、馬鈴薯等的鑒別［12］。

菊科植物由于酚類(lèi)、糖類(lèi)物質(zhì)含量較高，進(jìn)行細(xì)胞裂解時(shí)易發(fā)生氧化反應(yīng)造成細(xì)胞核沉積、黏連，影響了流式細(xì)胞儀的檢測(cè)效果，尤其是多倍體的檢測(cè)效果不佳。本研究通過(guò)對(duì)制樣方式、細(xì)胞核懸液及熒光染料染色劑等工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立燈盞花倍性鑒定的方法，旨在為燈盞花大規(guī)模的倍性鑒定奠定基礎(chǔ)，推動(dòng)燈盞花的育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

以云南師范大學(xué)生物工程中心遺傳實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的二倍體和四倍體燈盞花為材料來(lái)源，選取在MS 培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)3 周左右的幼嫩葉片為供試材料。

1.2 解離液及染色液的配制

共設(shè)計(jì)3 種細(xì)胞解離液和2 種PI 染色液，其配方成分詳見(jiàn)表1。

表1 解離液和染色液成分

1.3 制樣方法

1.3.1 機(jī)器研磨法 將葉片用滅菌dd H2O2沖洗干凈，擦干，放入離心管中加入鋼珠，同時(shí)加入2 mL 解離液，放入研磨機(jī)中，溫度設(shè)置為4 ℃，研磨1 min。

1.3.2 液氮研磨法 將葉片用滅菌dd H2O 沖洗干凈，擦干，放入研缽中，加入5～10 mL 液氮迅速研磨成粉末，然后加入2 mL 預(yù)冷的解離液，再將其轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中插入冰上裂解30 min。

1.3.3 刀片切碎法 將葉片用滅菌dd H2O 沖洗干凈，擦干，放入培養(yǎng)皿中同時(shí)加入2 mL 解離液，用吉利刀片迅速切2 min。

1.4 植物組織單細(xì)胞制備方法

選取培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)狀況好的幼嫩葉片，用滅菌dd H2O 沖洗干凈、擦干后，按照“1.3”方法進(jìn)行樣品制備；隨后用400 目的濾膜過(guò)濾至1.5 mL 離心管中，于4 ℃下靜置10 min 后離心，轉(zhuǎn)速1 000～2 000 r/min離心5 min，棄上清液，取沉淀物。在試管中加入預(yù)冷的按照“1.2”方法制備的解離液1 mL，加20 μL 1 mg/mL 預(yù)冷的染料，使其懸浮液與染料結(jié)合，4 ℃避光保存15～20 min，用400 目的濾膜過(guò)濾至上機(jī)管中待測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

使用艾森生物ACEA NovoCyte 型流式細(xì)胞儀，按照儀器操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定，采用NovoExpress 1.3.0軟件處理數(shù)據(jù)。以細(xì)胞核DNA 相對(duì)含量的總熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞核數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制流式峰值圖；以細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞核顆粒度為縱坐標(biāo)，繪制流式散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法制備的細(xì)胞核懸液效果比較

分別采用液氮研磨法、刀片切碎法和機(jī)器研磨法3 種方法制備燈盞花葉片樣品，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞核懸液效果檢測(cè)（圖1）。由圖1 可知，液氮研磨法和機(jī)器研磨法中細(xì)胞核沒(méi)有顯著聚集在一起，而刀片切碎法在總熒光強(qiáng)度106和106.2處分別呈現(xiàn)出細(xì)胞核的顯著聚集，且不同熒光強(qiáng)度的2 個(gè)細(xì)胞核群可以完全地分開(kāi)，表明刀片切碎法收集到了完整的細(xì)胞核。此外，圖1c 中的細(xì)胞核聚集較為緊密，細(xì)胞核占比為67.77%。結(jié)果表明，刀片切碎法制備的燈盞花流式細(xì)胞樣品效果較好。

圖1 不同方法制備的細(xì)胞核懸液效果比較

2.2 不同細(xì)胞解離液解離的效果比較

采用3種細(xì)胞解離液分別對(duì)二倍體燈盞花（圖2）和四倍體燈盞花細(xì)胞（圖3）進(jìn)行植物組織單細(xì)胞裂解。由圖2 可知，采用解離液Ⅰ處理燈盞花二倍體葉片細(xì)胞，燈盞花葉片的流式細(xì)胞檢驗(yàn)圖峰型清晰且集中，在總熒光強(qiáng)度1.2 處出現(xiàn)峰值；解離液Ⅱ處理的樣品，檢驗(yàn)圖出現(xiàn)了明顯的雜亂峰；解離液Ⅲ處理的樣品，峰型集中但不夠清晰，總熒光強(qiáng)度1.2 后有雜亂峰。由圖3 可知，解離Ⅰ處理的燈盞花四倍體葉片細(xì)胞出現(xiàn)了集中且清晰的2 個(gè)峰型，比二倍體更明顯；解離液Ⅱ和解離液Ⅲ處理的樣品，雖測(cè)出1 個(gè)峰，但峰型表現(xiàn)雜亂。結(jié)果表明，采用細(xì)胞解離液Ⅰ對(duì)燈盞花細(xì)胞進(jìn)行裂解，不僅出峰清晰，且能較好地呈現(xiàn)出二倍體和四倍體細(xì)胞核DNA 峰型。因此，本研究選擇解離液Ⅰ。

圖2 不同解離液處理二倍體燈盞花葉片的流式細(xì)胞檢驗(yàn)

圖3 不同解離液處理四倍體燈盞花葉片的流式細(xì)胞檢驗(yàn)

2.3 不同染色液的效果比較

采用刀片切碎法制備樣品，經(jīng)解離液Ⅰ裂解后的細(xì)胞懸液分別用不同公司的PI 染色液進(jìn)行染色，結(jié)果（圖4）表明，使用BioFroxx 公司的粉末自配染色液可以明顯減少細(xì)胞碎片造成的背景干擾，染色效果明顯。因此，本研究選擇BioFroxx公司的PI 染色液。

2.4 對(duì)繼代苗體細(xì)胞變異的檢驗(yàn)

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，體細(xì)胞變異（Somaclonal variation）是時(shí)常發(fā)生的事件［13］，尤其是繼代數(shù)超過(guò)12 次以后。在燈盞花的組織培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)再生植株呈現(xiàn)出不同的表型，對(duì)其葉片進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同表型呈現(xiàn)出不同的峰型（圖5）。圖5a 燈盞花植株的流式細(xì)胞檢驗(yàn)為二倍體，圖5b 為單倍體，圖5c 為四倍體，圖5d 為混倍體，并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。組織培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的遺傳不穩(wěn)定性是倍性變化［14］，體細(xì)胞無(wú)性系核型的改變包括染色體重排、非整倍體和整倍體。非整倍體可能是由染色體不分離、異常紡錘體、滯后染色體和/或染色體斷裂引起的［15］。其中，多倍體化是染色體數(shù)量上最常見(jiàn)的變化，通常由內(nèi)多倍體化（核內(nèi)重復(fù)或有絲分裂）或核聚變引起［16］。許多研究表明，基因型［15］、繼代培養(yǎng)次數(shù)、培養(yǎng)基類(lèi)型、外植體狀況都會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞無(wú)性系變異［17］，尤其是培養(yǎng)基中2，4-d 的運(yùn)用［18］。盡管如此，鮮見(jiàn)燈盞花組培中體細(xì)胞變異的相關(guān)報(bào)道。本研究表明，在燈盞花的組培快繁中的確存在體細(xì)胞變異。下一步可以利用組培過(guò)程中的變異體細(xì)胞篩選有用的變異株。

圖5 流式細(xì)胞檢驗(yàn)優(yōu)化流程對(duì)燈盞花繼代再生苗的檢驗(yàn)

3 小結(jié)

利用染色體計(jì)數(shù)方法鑒定植株倍性，雖準(zhǔn)確率高但操作繁鎖，且技術(shù)要求高，所需材料為根尖，而取根通常會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)，且不易鑒定出混倍體［10］。流式細(xì)胞檢測(cè)不僅操作簡(jiǎn)單，取材多元化，且能測(cè)定基因組大小及鑒定混倍體。有許多因素會(huì)影響到流式細(xì)胞的檢驗(yàn)結(jié)果，如材料來(lái)源［19］、細(xì)胞核解離液類(lèi)型［20］、膜過(guò)濾次數(shù)［21］、DNA 熒光染料類(lèi)型［22］等，尤其是材料選取不當(dāng)，酚類(lèi)、多糖、單寧等雜質(zhì)的干擾會(huì)導(dǎo)致解離出來(lái)的單細(xì)胞核顆粒少，甚至形成較大的染色體峰。但是，采用適宜的解離液和解離方法可以消除此類(lèi)干擾［23］。燈盞花多糖、酚類(lèi)物質(zhì)含量較高，本研究采用刀片研磨法制備樣品，選擇解離液I 進(jìn)行植物組織裂解，使用Bio-Froxx 公司染料進(jìn)行染色。優(yōu)化后的工藝不僅能較好地檢驗(yàn)燈盞花的倍性，同時(shí)也能檢驗(yàn)出再生植株中的混倍體和單倍體。建立的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定燈盞花倍性檢驗(yàn)體系，可為燈盞花多倍體育種提供參考。