肝細(xì)胞多倍體發(fā)生機(jī)制及其與肝細(xì)胞癌形成的相關(guān)性研究進(jìn)展

汪 楠，郝風(fēng)節(jié)，王俊青

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科，上海 200025）

多倍體是指細(xì)胞中存在2 套以上的染色體組。在自然界中，多倍體現(xiàn)象廣泛存在，常見于植物類、魚類、兩棲動物類，但在哺乳動物中少見。正常生理狀態(tài)下，人體多倍體細(xì)胞一般僅見于心臟、骨髓、肝臟等特定組織和器官。其中，已證實(shí)肝細(xì)胞多倍體與肝臟再生、穩(wěn)態(tài)、終末分化、衰老等相關(guān)，但關(guān)于其具體功能和作用機(jī)制目前尚未明確。

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)2018 年公布的全球腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球肝癌的年新發(fā)病人數(shù)達(dá)84.1 萬人，居惡性腫瘤第6 位，年患病死亡數(shù)達(dá)78.2 萬人，居惡性腫瘤第2 位。原發(fā)性肝癌在我國高發(fā)，我國肝細(xì)胞癌（肝癌）年新發(fā)病例占全球的55.4%，年死亡人數(shù)占全球的53.9%,位居常見惡性腫瘤的第4 位和腫瘤致死病因的第2 位[1-2]。肝臟是人體最大的消化器官和多倍體器官。近年來，越來越多的研究提示多倍體細(xì)胞可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，包括多種人類腫瘤的癌前病變和惡性轉(zhuǎn)化。因此，研究多倍體肝細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，對肝癌的預(yù)防、早期診斷和治療具有重要的研究和臨床轉(zhuǎn)化意義。本文就多倍體肝細(xì)胞的形成機(jī)制、功能及病理生理學(xué)意義進(jìn)行闡述，深入探討多倍體肝細(xì)胞在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的研究進(jìn)展。

多倍體肝細(xì)胞的形成機(jī)制

人體細(xì)胞除生殖細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)染色體組通常以二倍體形式存在并發(fā)揮生物學(xué)功能。在不同生理或病理?xiàng)l件下，二倍體生物可通過多種途徑和機(jī)制在特定組織或器官中形成多倍體細(xì)胞。二倍體生物形成多倍體細(xì)胞的途徑大致包括細(xì)胞融合、細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制和細(xì)胞質(zhì)分裂失敗3 種形式[3-4]。

一、細(xì)胞融合

細(xì)胞融合是指2 個單核二倍體肝細(xì)胞（2n）融合在一起而產(chǎn)生一個雙核四倍體肝細(xì)胞（2×2n）。就人類肝細(xì)胞而言，當(dāng)肝細(xì)胞形成細(xì)胞融合時，雙核四倍體肝細(xì)胞保留了正常進(jìn)入分裂周期的能力，可產(chǎn)生2 個單核四倍體肝細(xì)胞（4n）。在此基礎(chǔ)上，單核四倍體肝細(xì)胞進(jìn)一步多倍體化，則可形成雙核四倍體（2×4n）或單核八倍體肝細(xì)胞（8n）[5]。研究表明，在肝臟嵌合體小鼠模型中可觀察到肝細(xì)胞間細(xì)胞融合現(xiàn)象。然而，由于細(xì)胞外囊泡可能形成偽影干擾細(xì)胞倍性的觀察，對于肝臟中肝細(xì)胞融合的存在目前仍有爭議[6]，尚有待進(jìn)一步深入探討。

二、細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制

細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制是指細(xì)胞在不發(fā)生有絲分裂的前提下，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生多次DNA 合成，從而產(chǎn)生細(xì)胞多倍體化的細(xì)胞學(xué)現(xiàn)象。在生理?xiàng)l件下，哺乳動物的細(xì)胞周期可分為G1期、S 期、G2期和M 期4 個連續(xù)階段，該過程受細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶等嚴(yán)密調(diào)控。多項(xiàng)研究表明，采用敲除特定細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，能夠在相應(yīng)的細(xì)胞周期進(jìn)程中影響肝細(xì)胞多倍體化，進(jìn)而建立富含不同細(xì)胞倍性的肝細(xì)胞小鼠模型，如敲除p53[7]、p21[8]、Rb[8-9]，可分別誘導(dǎo)不同細(xì) 胞周期階段的細(xì)胞形成多倍體肝細(xì)胞。持續(xù)的DNA 損傷可觸發(fā)肝細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，可促使多倍體肝細(xì)胞的生成[10-11]。研究顯示，體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞經(jīng)一定時間的紫外光照射后，在細(xì)胞周期S 期和G2期中，表現(xiàn)出共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3 相關(guān)激酶高度磷酸化和氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時經(jīng)ATR/p53/pRb 通路，促進(jìn)細(xì)胞周期抑制因子p53 和pRb 蛋白高表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，產(chǎn)生多倍體肝細(xì)胞[10-11]。

三、細(xì)胞質(zhì)分裂失敗

細(xì)胞質(zhì)分裂是細(xì)胞分裂的最后環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞分裂后期紡錘體重組、分裂溝的形成、中心體結(jié)構(gòu)的脫落等環(huán)節(jié)。細(xì)胞質(zhì)分裂失敗會產(chǎn)生雙核多倍體細(xì)胞，同樣細(xì)胞質(zhì)分裂失敗后，如出現(xiàn)細(xì)胞核重新融合，也可能導(dǎo)致單核多倍體細(xì)胞形成。

1.PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：就哺乳動物肝細(xì)胞而言，細(xì)胞多倍化起始于斷奶期間[12]，與高脂飲食及高水平胰島素、AKT 信號增強(qiáng)密切相關(guān)[5,12]。胰島素經(jīng)PI3K 信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，PI3K/AKT 信號通路是胰島素作用的主要下游通路。研究顯示，PI3K/AKT 信號通路在細(xì)胞遷移中發(fā)揮促使肌動蛋白細(xì)胞骨架極化和重組的作用，該通路各環(huán)節(jié)發(fā)生的變化均可能導(dǎo)致肝細(xì)胞質(zhì)完全分裂失敗，進(jìn)而形成多倍體細(xì)胞。

2.E2F 家族：E2F 家族是細(xì)胞周期進(jìn)程的主要調(diào)節(jié)因子[13]。研究表明，該家族的E2F7 和E2F8 基因雙敲除的小鼠模型肝臟中富含二倍體肝細(xì)胞（基因敲除小鼠模型的肝細(xì)胞中二倍體肝細(xì)胞占60%～70%，而對照組肝細(xì)胞中則占3%～4%）[15-16]。在肝細(xì)胞多倍體化過程中，可觀察到E2F7 和E2F8 的表達(dá)水平顯著升高，表明其參與了細(xì)胞多倍體化的調(diào)節(jié)。E2F1 基因具有抑制細(xì)胞多倍體化的作用，E2F1 基因缺失，可導(dǎo)致細(xì)胞G2期和M 期轉(zhuǎn)錄效率下調(diào)，促進(jìn)多倍體細(xì)胞形成[14]。

3.微小RNA（microRNA，miRNA）：Hsu 等[15]發(fā)現(xiàn)，miRNA與雙核多倍體肝細(xì)胞的形成間關(guān)系密切。在miR-122 基因敲除的小鼠模型中觀察到，肝細(xì)胞多倍體總量減少60%～70%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究顯示，miR-122 下調(diào)在誘導(dǎo)減少肝細(xì)胞多倍體化的同時，具有促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生的作用，提示miR-122 可能作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)，而與其相關(guān)的肝細(xì)胞多倍體化改變可能與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[16]。

多倍體肝細(xì)胞生理功能和意義的假說

正常生理狀態(tài)下，肝臟細(xì)胞多倍體化僅是肝臟生理發(fā)育的表現(xiàn)形式，還是具有一定的生物學(xué)意義,結(jié)合目前的理論，已有幾項(xiàng)假說支持肝臟細(xì)胞多倍體化具有特定的生物學(xué)意義。

一、肝細(xì)胞多倍體化與肝臟細(xì)胞的終末分化及衰老有關(guān)

最早的研究認(rèn)為，在嚙齒類動物和人類中，肝細(xì)胞多倍體化與肝細(xì)胞終末分化及衰老有關(guān)。既往研究提示，肝細(xì)胞多倍體化伴隨著肝細(xì)胞的終末分化、增殖能力和細(xì)胞分裂功能的下降[20]。然而最近研究表明，多倍體肝細(xì)胞雖然可能與細(xì)胞衰老進(jìn)程的加速相關(guān)，但多倍體肝細(xì)胞仍保留了分裂和增殖的能力，因此認(rèn)為肝細(xì)胞多倍體不屬于細(xì)胞分化的終末形式。Pandit 等[17]提出，E2F8 基因敲除的小鼠其肝臟主要由二倍體肝細(xì)胞組成，其肝臟的再生能力與具有大量多倍體細(xì)胞的野生型小鼠肝臟間沒有差異，有力地支持了上述觀點(diǎn)。同樣，Knouse 等[18]、Miyaoka 等[19]、Miettinen 等[20]發(fā)現(xiàn)，在部分肝切除術(shù)后，多倍體肝細(xì)胞的分裂程度與二倍體亦相同；Duncan 等[21]把成年小鼠的二倍體和八倍體肝細(xì)胞移植到延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷的小鼠肝臟內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二倍體和八倍體肝細(xì)胞具有同等的再增殖潛力，說明多倍體肝細(xì)胞均具有相當(dāng)高的增殖能力。

二、多倍體肝細(xì)胞具有增強(qiáng)和穩(wěn)定肝細(xì)胞功能的作用

多倍體肝細(xì)胞具有多套染色體組。新近觀點(diǎn)認(rèn)為，多倍體細(xì)胞相應(yīng)的基因在轉(zhuǎn)錄過程中能夠成倍增加，籍此導(dǎo)致特定代謝功能的增強(qiáng)[21-22]。Lu 等[23]早在2007 年就使用微陣列分析觀察了來自野生型小鼠的不同核倍體數(shù)肝細(xì)胞的基因表達(dá)譜，僅發(fā)現(xiàn)了在不同人群之間的基因表達(dá)譜中存在一些差異。Kreutz 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，二倍體肝細(xì)胞與單核多倍體肝細(xì)胞的基因表達(dá)譜不同，而與雙核多倍體肝細(xì)胞的基因表達(dá)譜相近。上述發(fā)現(xiàn)提示，肝細(xì)胞核倍體數(shù)的增加可能提高肝細(xì)胞的生物功能。Miettinen 等[20]應(yīng)用周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1,CDK1）基因敲除的小鼠建立了單核多倍體肝細(xì)胞模型，研究較高的細(xì)胞核倍體數(shù)與肝細(xì)胞代謝之間的關(guān)系，結(jié)果表明，較高的肝細(xì)胞核倍體數(shù)會誘導(dǎo)線粒體相關(guān)基因和脂質(zhì)從頭合成途徑相關(guān)基因表達(dá)水平下降，同時誘導(dǎo)細(xì)胞骨架、糖酵解基因表達(dá)水平升高，說明多倍體肝細(xì)胞具有促進(jìn)肝臟代謝功能的作用。

肝臟具有較高的能量需求，細(xì)胞多倍體化后功能的增強(qiáng)可能有助于其快速適應(yīng)環(huán)境改變帶來的生物學(xué)壓力。Bahar等[25]采用基于單分子熒光原位雜交技術(shù)方法，定量分析了肝細(xì)胞內(nèi)特定啟動子的活化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄過程中轉(zhuǎn)錄效率、轉(zhuǎn)錄頻率等存在不穩(wěn)定性，啟動子在活化和關(guān)閉狀態(tài)之間隨機(jī)切換，并誘導(dǎo)細(xì)胞基因表達(dá)圍繞一定的值上下波動，即形成“轉(zhuǎn)錄噪聲”。值得一提的是，多倍體肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄噪聲很小，表明肝臟多倍體化參與了轉(zhuǎn)錄噪聲產(chǎn)生的嚴(yán)格調(diào)控和有效緩沖，使基因表達(dá)趨向穩(wěn)定，并在此基礎(chǔ)上保持肝細(xì)胞發(fā)揮穩(wěn)定的生理功能[22,26]。

三、多倍體肝細(xì)胞促進(jìn)肝組織修復(fù)及抵抗基因毒性損傷

肝臟是人體中最為重要的再生器官，同樣也是為數(shù)不多的多倍體細(xì)胞占總體細(xì)胞一半以上的器官。研究表明，對小鼠肝臟施行部分切除后，其殘余肝組織中的多倍體肝細(xì)胞發(fā)生明顯增殖，并參與了肝組織的再生。Zhang 等[27-28]建立了E2F7 和E2F8 雙敲除二倍體肝臟小鼠模型，并對其進(jìn)行部分肝切除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠肝臟（多倍體肝細(xì)胞）部分肝臟切除后的肝組織再生能力比較，多倍體肝細(xì)胞在修復(fù)受損肝組織方面能力明顯高于二倍體肝細(xì)胞。同樣，使用四氯化碳毒素處理野生型小鼠與E2F7、E2F8 雙敲除小鼠，獲得小鼠肝損傷模型，對比2 種小鼠處理后的肝臟體積和重量，也得到了類似結(jié)果。上述發(fā)現(xiàn)說明，肝細(xì)胞的多倍體化對肝臟再生影響顯著。

肝細(xì)胞多倍體與肝癌的關(guān)系

一、環(huán)境特異性背景下多倍體細(xì)胞與人類腫瘤

基因組學(xué)已證實(shí)，約有30%的人類實(shí)體腫瘤，如結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌等中存在大量多倍體細(xì)胞[29]。在臨床病理診斷中，多倍體腫瘤細(xì)胞與腫瘤侵襲性強(qiáng)、惡性程度高、預(yù)后較差相關(guān)?；诖?，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞多倍體化參與了從癌前病變到惡性腫瘤轉(zhuǎn)變的動態(tài)過程，基因組倍性的增加極有可能是腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動因素[26]。Ganem 等[30]發(fā)現(xiàn)，將TP53 基因敲除的四倍體乳腺上皮細(xì)胞移植至免疫缺陷的裸鼠中會引起惡性腫瘤，而移植TP53 基因敲除的二倍體乳腺上皮細(xì)胞不會引起惡性腫瘤，這一發(fā)現(xiàn)提示四倍體會引起腫瘤發(fā)生。由于正常成年人的肝臟在生理狀態(tài)下富含大量多倍體細(xì)胞，故多倍體在肝臟腫瘤發(fā)生中的作用目前尚無法解釋。對于多倍體細(xì)胞在肝臟中是促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生的因素還是抑制腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的保護(hù)因素，不少學(xué)者展開了討論。

二、多倍體肝細(xì)胞對肝細(xì)胞肝癌發(fā)生、發(fā)展的潛在抑制作用

1.抑癌作用機(jī)制研究：根據(jù)前述提出的觀點(diǎn)，細(xì)胞多倍體化一般是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。然而，研究表明，正常成年人的肝臟生理狀態(tài)下有50%為多倍體細(xì)胞。關(guān)于多倍體肝細(xì)胞是否與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，是否也具有促進(jìn)肝癌發(fā)生的作用的問題，這值得探討。與大多數(shù)人類實(shí)體腫瘤相關(guān)研究不同，現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，多倍體肝細(xì)胞具有拮抗肝癌發(fā)生、發(fā)展的作用。理論上，二倍體組織內(nèi)的細(xì)胞通過經(jīng)典的雜合性丟失機(jī)制可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，即在2 個成對的抑癌基因中，1 個或2 個等位基因出現(xiàn)不同的基因組變化，可導(dǎo)致其失去抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的功能。相反，多倍體肝細(xì)胞最多可以包含16 個等位抑癌基因，因而對抑癌基因的丟失或者突變具有緩沖作用?，F(xiàn)階段，有關(guān)肝細(xì)胞多倍體抑制肝癌發(fā)生的假說中，以下研究結(jié)論最被廣泛接受。這些研究提出，細(xì)胞多倍體化可以增加單細(xì)胞基因數(shù)目，保護(hù)細(xì)胞免受遺傳毒性機(jī)制的損害[28,31,34]。該研究者分別通過控制小鼠斷奶時間和Anln 基因、E2F8 基因的水平，建立了Anln 基因敲除小鼠模型 （肝細(xì)胞大多數(shù)為多倍體）和E2F8 基因敲除小鼠模型（肝細(xì)胞大多數(shù)為二倍體），隨后用二乙基亞硝胺建立了肝癌誘導(dǎo)模型。結(jié)果表明，多倍體細(xì)胞占優(yōu)勢的肝細(xì)胞組成狀態(tài)在多種肝癌模型中均顯示出腫瘤抑制功能。進(jìn)一步研究顯示，多倍體肝細(xì)胞抑癌作用與緩沖抑癌基因突變或缺失有關(guān)，而并非抑制肝細(xì)胞在致癌性因素作用后的異常細(xì)胞增殖[27,30]。

作為上述假說的理論支持，Knouse 等[18]對E2F8 基因敲除小鼠和野生型小鼠分別進(jìn)行了部分肝切除手術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，以二倍體為主的E2F7、E2F8 雙敲除小鼠術(shù)后的肝臟質(zhì)量恢復(fù)率更高。另外，Wilkinson 等[32]從小鼠肝臟中直接提取肝細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中以二倍體為主的E2F7、E2F8 雙敲除肝細(xì)胞的增殖率明顯高于野生型多倍體肝細(xì)胞。上述結(jié)果提示，二倍體肝細(xì)胞增殖能力大于多倍體肝細(xì)胞，而多倍體肝細(xì)胞可能因其抑癌基因獲得多次復(fù)制機(jī)會，具備明顯的抑制肝癌作用。

2.與預(yù)后的相關(guān)性：多倍體肝細(xì)胞的不同細(xì)胞核狀態(tài)也與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)。2019 年，Bou-Nader 等[33]利用腫瘤細(xì)胞原位成像的方法，分析了肝癌患者與健康對照者肝組織的細(xì)胞倍性譜，結(jié)果顯示，在人體肝癌發(fā)生過程中，雙核多倍體百分比及細(xì)胞倍性大大降低 （正常組織中約為15%，而腫瘤組織中約為5%）。相反，單核多倍體百分比及細(xì)胞倍性在肝癌中上升（正常組織中約為12%，而腫瘤組織中約為33%）。因此，單核多倍體肝細(xì)胞可能與低分化、增殖率高、預(yù)后不良的肝癌有關(guān)。

值得關(guān)注的是，在哺乳動物出生后的發(fā)育過程中，絕大部分肝細(xì)胞通過細(xì)胞質(zhì)分裂失敗的形式生成雙核多倍體細(xì)胞。Bou-Nader 等[33]發(fā)現(xiàn)，雙核多倍體肝細(xì)胞在人類肝癌中幾乎不存在，強(qiáng)烈提示惡性肝細(xì)胞分裂時不存在細(xì)胞質(zhì)缺陷，為之后的研究提供了方向。除此之外，Bou-Nader 等[32]的研究結(jié)果也支持了Zhang 等[28,34]和Lin 等[31]的假說。

雖然多倍體肝細(xì)胞與肝癌的關(guān)系仍未完全闡明，但多倍體肝細(xì)胞對肝癌發(fā)揮抑制作用觀點(diǎn)已逐步被研究者所接受，細(xì)胞質(zhì)分裂機(jī)制與癌細(xì)胞增殖之間的分子聯(lián)系是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Anln、E2F 等基因涉及細(xì)胞有絲分裂多個環(huán)節(jié)，將是進(jìn)一步深入探討的重要領(lǐng)域。前述的miRNA-122 也為研究者從非編碼RNA 著手研究肝細(xì)胞多倍體與腫瘤的關(guān)系，提供了另一種研究思路[15-16]。

結(jié)論和展望

多倍體形成是一種特殊的細(xì)胞功能機(jī)制，其產(chǎn)生原理和生物學(xué)意義尚待深入闡述。多倍體細(xì)胞在人體生理發(fā)育過程中必不可少，肝臟作為人體最大的多倍體器官，肝細(xì)胞多倍體化貫穿于肝臟發(fā)育、生長、再生及衰老的全過程中。明確肝臟多倍體與肝癌間的關(guān)系，以及肝癌究竟是來自于多倍體還是二倍體肝細(xì)胞，將為之后的臨床肝癌預(yù)防、診斷、治療提供重要理論支持。全面揭示多倍體肝細(xì)胞抑制肝癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制，將推動肝癌精準(zhǔn)治療的開展。此外，尚可進(jìn)一步探討以下相關(guān)問題，如肝細(xì)胞倍性能達(dá)到的極限；多倍體肝細(xì)胞如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖；多倍體肝細(xì)胞如何解決有絲分裂期間形成的多極紡錘體[18,20]等。