生物通風(fēng)法修復(fù)石油烴污染土壤

殷鸝婷，韓書新，刁志龍，王 勇，蔣夢涵，高煥方

（1. 重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054；2. 黑龍江省生態(tài)氣象中心，黑龍江 哈爾濱 150030；3. 重慶匯亞環(huán)保工程有限公司，重慶 400041；4. 正和綠源檢測技術(shù)（重慶）有限公司，重慶 400072）

石油烴（TPH）是一種持久性有機(jī)污染物，具有致癌、致畸和致突變性［1-2］，主要來自于石油開采、運(yùn)輸及加工過程中泵、管線、油罐等設(shè)施和設(shè)備的泄漏。TPH一旦進(jìn)入土壤，一方面會通過食物鏈在人和動物體內(nèi)富集，對人體健康造成危害；另一方面還會破壞土壤結(jié)構(gòu)、抑制植物生長，對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。近年來，TPH污染已逐漸成為石油、石化行業(yè)土壤污染的主要形式。TPH污染土壤的修復(fù)方法主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)3種。其中，物理修復(fù)（如吸附、熱處理、隔離等）和化學(xué)修復(fù)（如萃取、淋洗、化學(xué)氧化等）處理成本高、二次污染嚴(yán)重［3-5］，生物修復(fù)雖然具有修復(fù)效果好、處理費(fèi)用低、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，但卻存在耗時長的缺陷。生物通風(fēng)是將物理修復(fù)與生物修復(fù)結(jié)合起來的一種土壤修復(fù)技術(shù)，對TPH污染土壤具有良好的修復(fù)效果［6］。THOMé等［7］利用生物通風(fēng)技術(shù)修復(fù)受柴油污染的黏土土壤，120 d后，TPH去除率達(dá)到85%。張煜軒［8］采用異位生物通風(fēng)技術(shù)修復(fù)焦化類污染土壤，考察了通風(fēng)條件和菌劑添加量對修復(fù)效果的影響，結(jié)果表明，在96 d的試驗(yàn)周期內(nèi)，目標(biāo)污染物苯并［a］芘、苯并［a］蒽和二苯并［a，h］蒽等均有良好的去除效果。盡管生物通風(fēng)技術(shù)在TPH污染土壤修復(fù)方面已有應(yīng)用，但鑒于TPH污染土壤本身的復(fù)雜性，目前對于影響生物通風(fēng)修復(fù)效果的因素，如初始TPH含量、土壤含水率、通風(fēng)強(qiáng)度和通風(fēng)時間等的研究還不夠透徹，對微生物降解TPH的機(jī)理也不甚清楚，亟需深入研究［9-11］。

本工作采用生物通風(fēng)技術(shù)修復(fù)受TPH污染的土壤，考察了初始TPH含量、土壤中C，N，P元素質(zhì)量比（C∶N∶P）、土壤含水率和通風(fēng)速率4種因素對TPH降解率的影響，探討了TPH的降解機(jī)制，為TPH污染土壤的修復(fù)作參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

土壤取自重慶理工大學(xué)校園內(nèi)，采集表層（0～15 cm）土樣，自然風(fēng)干后，過2 mm篩備用。經(jīng)檢測，土壤pH 7.74、含水率4.81%、有機(jī)質(zhì)含量（w）1.40%。

TPH污染土壤的制備：將40#機(jī)油在適量石油醚中溶解，加入土壤中，充分混合，制備成不同TPH含量（分別為6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 mg/kg）的污染土壤；將污染土壤在陰涼通風(fēng)處放置14 d，每2 d攪拌1次，以確保石油醚完全揮發(fā)。

實(shí)驗(yàn)所用菌液是由4株真菌所構(gòu)建的高效TPH降解菌群。4株真菌分別為硬孔菌（Rigidoporus vinctus）、雜色曲霉菌（Aspergillus versicolor）、淡紫擬青霉菌（Purureocillium lilacinum）和曲霉菌（Aspergillus japonicus），均為本課題組篩選所得。

GC-2014型氣相色譜儀：日本島津公司；Agilent 8860-5977B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）：美國安捷倫公司；SEP-100型生化培養(yǎng)箱：上海精其儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置圖見圖1。整個實(shí)驗(yàn)裝置由生物通風(fēng)柱（由有機(jī)玻璃柱制成，內(nèi)徑80 mm、高500 mm）、充氣泵、氣體流量計、裝有NaOH溶液的CO2去除瓶、裝有NaOH溶液的CO2收集瓶和活性炭管等組成。生物通風(fēng)柱側(cè)壁設(shè)置6個直徑均為10 mm的圓形取樣口（從下到上分別記作A#-F#），取樣口高度距柱底分別為60，110，195，285，370，415 mm，取樣口用硅膠墊密封。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在TPH含量為10 000 mg/kg的污染土壤中分別添加一定量的硝酸銨和磷酸氫二鉀，調(diào)節(jié)土壤C∶N∶P為100∶15∶1；將污染土壤裝填至生物通風(fēng)柱中，填充高度430 mm；在通風(fēng)速率150 mL/min的條件下，考察土壤含水率對TPH降解率的影響。分別改變C∶N∶P、通風(fēng)速率和初始TPH含量，考察不同因素對TPH降解率的影響。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察不同因素對TPH降解率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計了4因素3水平L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)（表1），考察修復(fù)期間（0～63 d）污染土壤中TPH降解率的變化情況。

表1 生物通風(fēng)修復(fù)TPH污染土壤正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.4 分析方法

采用氣相色譜儀測定土壤樣品中TPH的含量［12］，結(jié)果取6個采樣點(diǎn)的平均值。

采用GC-MS測定TPH降解產(chǎn)物。具體步驟如下：生物通風(fēng)結(jié)束后，從6個取樣口中各稱取5.0 g左右的土壤樣品加入到研缽中，同時加入等質(zhì)量的無水硫酸鈉，研磨至干燥態(tài)；將樣品移入微波消解管中，加入20 mL體積比為1∶1的丙酮-正己烷混合溶液，在120 ℃下微波萃取30 min；萃取液經(jīng)濃縮、干燥后，定容至1 mL，上機(jī)檢測。測試條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至320 ℃并保持59 min。不分流，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜采用EI離子源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響TPH降解率的因素

2.1.1 土壤含水率

在初始TPH含量為10 000 mg/kg、通風(fēng)速率為150 mL/min、C∶N∶P為100∶15∶1的條件下，考察土壤含水率對TPH降解率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 土壤含水率對TPH降解率的影響

由圖2可見：隨著修復(fù)時間的延長，TPH降解率逐漸增加；當(dāng)土壤含水率從10%增加到20%時，TPH的降解率不斷上升，當(dāng)修復(fù)時間為35 d時，TPH降解率達(dá)到最大，為37.7%；繼續(xù)增加土壤含水率至25%和30%時，TPH降解率明顯降低。研究表明，適宜的土壤含水率不僅可以促進(jìn)微生物的代謝活動，增加其細(xì)胞活性，還能夠維持土壤孔隙，增加土壤供氧能力，有利于好氧微生物發(fā)揮作用［13］。當(dāng)土壤含水率過低時，營養(yǎng)物質(zhì)不能及時傳遞給微生物，導(dǎo)致微生物活性受到抑制，呼吸作用減弱，從而影響TPH的降解；隨著土壤含水率的逐漸增大，土壤中越來越容易形成厭氧環(huán)境，不利于好氧微生物的生長；當(dāng)土壤含水率超過25%時，土壤呈泥漿狀，土壤孔隙度降低，氧氣難以擴(kuò)散，進(jìn)而影響微生物活性，TPH降解率降低［14］。一般認(rèn)為土壤含水率為 15%～20%時，生物修復(fù)的效果最佳［15］。綜上，選擇適宜的土壤含水率為20%。

2.1.2 C∶N∶P

在初始TPH含量為10 000 mg/kg、土壤含水率為20%、通風(fēng)速率為150 mL/min的條件下，考察C∶N∶P對TPH降解率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 C∶N∶P對TPH降解率的影響

由圖3可見：當(dāng)C∶N∶P由100∶10∶1增加至100∶20∶1時，TPH降解率逐漸增大；當(dāng)C∶N∶P為100∶20∶1、修復(fù)時間為35 d時，TPH降解率達(dá)到最大，為39.4%；繼續(xù)增加C∶N∶P至100∶25∶1和100∶30∶1時，TPH降解率逐漸降低。土壤中C，N，P等營養(yǎng)物質(zhì)的含量對微生物降解TPH影響較大。一方面微生物的生長代謝離不開C，N，P等營養(yǎng)物質(zhì)，TPH可以為微生物生長提供碳源，N、P等營養(yǎng)物質(zhì)能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、增強(qiáng)微生物活性、加速微生物對TPH的降解。另一方面，當(dāng)N、P等營養(yǎng)物質(zhì)含量過高時，會對微生物生長產(chǎn)生毒害作用，不利于微生物產(chǎn)生相應(yīng)的降解酶，降低了微生物對TPH的降解率［16-18］。綜上，選擇適宜的C∶N∶P為100∶20∶1。

2.1.3 通風(fēng)速率

在初始TPH含量為10 000 mg/kg、土壤含水率為20%、C∶N∶P為100∶20∶1的條件下，考察通風(fēng)速率對TPH降解率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可見：當(dāng)修復(fù)時間為0～7 d時，隨著通風(fēng)速率的增加，TPH降解率逐漸增加；隨著修復(fù)時間的延長，當(dāng)通風(fēng)速率由50 mL/min增加至100 mL/min時，TPH降解率逐漸增大，繼續(xù)增加通風(fēng)速率至150 mL/min，TPH降解率略有降低，進(jìn)一步增大通風(fēng)速率至250 mL/min時，TPH降解率明顯降低；當(dāng)通風(fēng)速率為100 mL/min、修復(fù)時間為35 d時，TPH降解率達(dá)到最大，為 40.3%。在修復(fù)初期（0～7 d），微生物尚未適應(yīng)新的土壤環(huán)境，此時TPH的去除主要依靠揮發(fā)作用，隨著修復(fù)時間的延長，微生物逐漸適應(yīng)土壤環(huán)境并開始大量繁殖，因此，修復(fù)中、后期，TPH的去除主要依賴微生物的降解作用。土壤中氧含量是影響TPH生物降解率的主要因素［19］。微生物在有氧條件下，以TPH為碳源和能源進(jìn)行代謝合成自身物質(zhì)，當(dāng)土壤中氧含量不足時，會抑制好氧微生物的生長，進(jìn)而影響對TPH的降解，當(dāng)土壤中氧含量充足時，TPH容易被微生物降解。適當(dāng)?shù)耐L(fēng)速率可以保證土壤中氧含量充足，但通風(fēng)速率過大可能會使土壤內(nèi)部溫度降低，進(jìn)而影響微生物的活性，導(dǎo)致TPH降解率下降［20］。綜上，選擇適宜的通風(fēng)速率為100 mL/min。

圖4 通風(fēng)速率對TPH降解率的影響

2.1.4 初始TPH含量

在土壤含水率為20%、C∶N∶P為100∶20∶1、通風(fēng)速率為100 mL/min的條件下，考察初始TPH含量對其降解率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可見：當(dāng)初始TPH含量由6 000 mg/kg增加至10 000 mg/kg時，TPH降解率逐漸增大；在修復(fù)中、后期，初始TPH含量增加至12 000 mg/kg和14 000 mg/kg時，TPH降解率逐漸降低；當(dāng)初始TPH含量為10 000 mg/kg、修復(fù)時間為35 d時，TPH降解率達(dá)到最大，為43.1%。TPH可以為微生物生長提供豐富的碳源，當(dāng)土壤中初始TPH含量過低時不足以維持微生物的生長繁殖［21］，導(dǎo)致TPH降解率較低；隨著土壤中初始TPH含量的升高，微生物的生長繁殖加快，微生物數(shù)量增多、活性增強(qiáng)，對TPH的降解率增大；當(dāng)初始TPH含量過高時，會影響土壤的呼吸強(qiáng)度，阻礙土壤中營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳輸，抑制微生物的活性，導(dǎo)致TPH降解率降低［22-23］。綜上，選擇適宜的初始TPH含量為10 000 mg/kg。

圖5 初始TPH含量對其降解率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

為了進(jìn)一步優(yōu)化生物通風(fēng)修復(fù)TPH污染土壤的工藝條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開展正交實(shí)驗(yàn)，考察不同因素對TPH降解率的影響，結(jié)果見表2。由表2可見：生物通風(fēng)修復(fù)TPH污染土壤的最佳實(shí)驗(yàn)條件為A2B1C3D2，即初始TPH含量10 000 mg/kg、C∶N∶P 100∶15∶1、土壤含水率20%、通風(fēng)速率100 mL/min。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下修復(fù)63 d后，污染土壤中TPH的含量降低至3 167 mg/kg，降解率為68.3%；各因素對TPH降解率影響的大小順序?yàn)槌跏糡PH含量（A）＞土壤含水率（C）＞C∶N∶P（B）＞通風(fēng)速率（D），表明初始TPH含量是影響其降解率的最主要因素，這與李琦［24］的研究結(jié)果相一致。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 TPH降解產(chǎn)物及降解機(jī)理

以TPH降解率最高的生物通風(fēng)柱為對象，采用GC-MS分析土壤修復(fù)前后TPH組分和含量的變化，結(jié)果見圖6。按碳骨架類型的不同，TPH可分為脂肪族、脂環(huán)族和芳香族化合物3類。由圖6a可見：生物通風(fēng)前后，各TPH組分含量的變化明顯不同，其中脂肪族化合物的相對含量顯著降低，由修復(fù)前的27.9%降低至12.5%，脂環(huán)族和芳香族化合物的相對含量有所增加，分別由修復(fù)前的52.5%和19.6%增加至61.3%和26.3%，表明脂肪族化合物比脂環(huán)族和芳香族化合物容易被降解，即具有開鏈碳結(jié)構(gòu)的TPH比具有環(huán)狀碳結(jié)構(gòu)的TPH更容易被微生物降解。從TPH碳鏈的長短來看（圖6b）：生物通風(fēng)修復(fù)后，C10～C16的相對含量明顯降低，由修復(fù)前的31.1%降低至16.7%；C17～C21和C22～C40的相對含量有所升高，分別由修復(fù)前的24.0%和44.9%升高至29.2%和54.2%，可見，TPH的碳鏈越短越容易被微生物降解。

圖6 修復(fù)前后土壤中各TPH組分和含量的變化

生物通風(fēng)修復(fù)前，采用GC-MS可以從TPH污染土壤中檢測到9，10-二甲基蒽（見圖7）；經(jīng)生物通風(fēng)修復(fù)后，從TPH污染土壤中只能檢測到10-甲基蒽-9-甲醛（圖8）。可以認(rèn)為這是9，10-二甲基蒽上的甲基經(jīng)加氧酶氧化成酚羥基、再經(jīng)過脫氫酶還原成醛的過程，表明此時多環(huán)芳烴已開始降解。此外，在修復(fù)前的TPH污染土壤中可以檢測到1-氯代二十碳烷，在修復(fù)后的土壤樣品中只能檢測到二十烷，表明鹵代脂肪烴已經(jīng)開始取代脫氯，長鏈烷烴也開始降解。在適宜的條件下，TPH作為碳源，為微生物的生長繁殖提供能量，在一系列酶的作用下，微生物通過氧化、水解、烷基化和去烷基化等代謝方式將TPH逐步降解為CO2和H2O等，且TPH的結(jié)構(gòu)越簡單，越容易被降解［25-26］。

圖7 9，10-二甲基蒽的質(zhì)譜圖

圖8 10-甲基蒽-9-甲醛的質(zhì)譜圖

不同TPH的好氧降解過程見圖9。由圖9可見：鏈烷烴的降解主要為末端氧化和次末端氧化。在末端氧化過程中，鏈烷烴被烷烴加氧酶依次氧化為伯醇、脂肪酸或醛，脂肪酸經(jīng)過β-氧化進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A（CoA），隨后進(jìn)入三羧酸（TCA）循環(huán)被進(jìn)一步分解，最終產(chǎn)物為CO2和H2O。烷烴發(fā)生次末端氧化時會首先形成仲醇，仲醇再轉(zhuǎn)化為甲基酮，酮進(jìn)一步代謝為酯，隨后生成脂肪酸和伯醇，伯醇繼續(xù)氧化為羧酸，羧酸與脂肪酸經(jīng)過β-氧化后，進(jìn)一步分解為CO2和H2O［27］。

圖9 不同TPH的好氧降解過程

與鏈烷烴相比，環(huán)烷烴較難被微生物降解。其降解路徑為：環(huán)烷烴首先經(jīng)氧化酶氧化成環(huán)醇，脫氫后形成環(huán)酮，環(huán)酮可以進(jìn)一步氧化生成內(nèi)酯、也可以開環(huán)生成脂肪酸，再通過β-氧化最終分解為CO2和 H2O［28］。

以苯為例，芳香族化合物的降解路徑為：加氧酶將苯環(huán)羥基化生成鄰苯二酚，再經(jīng)過鄰苯二酚雙加氧酶的作用在鄰位或間位開環(huán)，其中鄰位開環(huán)生成己二烯二酸，己二烯二酸進(jìn)一步氧化生成β-酮己二酸，最后形成琥珀酸和CoA參與到TCA循環(huán)中；間位開環(huán)生成2-羥基己二烯半醛酸，開環(huán)產(chǎn)物分解為甲酸、乙醛和丙酮酸參與到TCA循環(huán)中［29］。

3 結(jié)論

a）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在初始TPH含量10 000 mg/kg、C∶N∶P 100∶15∶1、土壤含水率20%、通風(fēng)速率100 mL/min的條件下，生物修復(fù)63 d后，污染土壤中TPH的含量降低至3 167 mg/kg，降解率為68.3%；各因素對TPH降解率影響的大小順序?yàn)槌跏糡PH含量＞土壤含水率＞C∶N∶P＞通風(fēng)速率。

b）從碳骨架分析，生物通風(fēng)修復(fù)后，脂肪族化合物的相對含量顯著降低，由修復(fù)前的27.9%降低至12.5%，脂環(huán)族化合物和芳香族化合物的相對含量有所增加，分別由修復(fù)前的52.5%和19.6%增加至61.3%和26.3%，表明脂肪族化合物比脂環(huán)族和芳香族化合物容易被降解，即具有開鏈碳結(jié)構(gòu)的TPH比具有環(huán)狀碳結(jié)構(gòu)的TPH更容易被微生物降解。

c）從TPH碳鏈的長短來看，生物通風(fēng)修復(fù)后，C10～C16的相對含量明顯降低，由修復(fù)前的31.1%降低至16.7%，C17～C21和C22～C40的相對含量有所升高，分別由修復(fù)前的24.0%和44.9%升高至29.2%和54.2%，表明TPH的碳鏈越短越容易被微生物降解。

d）在適宜的條件下，微生物以TPH為碳源，在一系列酶的作用下，通過氧化、水解、烷基化和去烷基化等代謝方式將TPH逐步降解為CO2和H2O等，且TPH結(jié)構(gòu)越簡單，越容易被降解。