絲膠蛋白源Tn和T抗原的釋放制備及質(zhì)譜分析

滿麗娟，葉佳佳，張德鋒，鄒籽華，黃琳娟，王仲孚，王承健

（1.陜西省天然多糖資源利用工程研究中心,西北大學食品科學與工程學院,西安 710069；2.西北大學生命科學學院,西安 710069）

糖基化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，人體中大多數(shù)蛋白質(zhì)均可能被O-（Ser/Thr殘基上）或N-（Asn 殘基上）糖基化修飾，其在多種生物學過程和疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［1，2］.研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細胞中糖基轉(zhuǎn)移酶的表達會發(fā)生改變，導致部分糖蛋白上糖鏈的結(jié)構(gòu)和數(shù)量也隨之發(fā)生變化，而這些異常表達的糖鏈有可能成為一類重要的腫瘤早期診斷生物標志物或藥物治療特異性靶標分子［3］.最典型的例子是多種癌癥細胞表面高表達的糖蛋白Mucin-1（MUC1），其O-糖鏈具有截斷現(xiàn)象，從而產(chǎn)生只由一個或少數(shù)幾個單糖殘基構(gòu)成的較短O-糖鏈，而在正常細胞上這些糖鏈并不表達或表達量極低［3～6］.其中，一個GalNAc通過α型O-糖肽鍵連接到Ser/Thr殘基上形成的結(jié)構(gòu)被稱為Tn抗原（GalNAc-α-Ser/Thr），而在Tn 抗原上通過β1，3 糖苷鍵連接一個Gal 殘基形成的結(jié)構(gòu)被稱為T 抗原（Galβ1，3GalNAc-α-Ser/Thr），是最常見的癌細胞糖鏈抗原，可被免疫系統(tǒng)特異性識別［5，6］.目前，已有大量研究利用此類癌細胞特異性糖類抗原結(jié)構(gòu)來合成糖肽類抗癌疫苗候選分子，使機體產(chǎn)生較強的免疫反應，以達到預防腫瘤或延緩腫瘤復發(fā)時間的目的.同時，與細胞毒性療法（如放療和化療）相比，這類免疫療法對人體副作用更小，因此已成為癌癥預防和治療中最有前景的手段之一［7～11］.然而，在糖肽疫苗合成過程中，所需關鍵原料Tn 抗原或T 抗原需要具有正確的異頭構(gòu)型，導致其合成難度較大，生產(chǎn)成本較高，影響了廣泛應用.因此，對天然來源Tn 和T 抗原的開發(fā)利用成為一種重要替代途徑.

絲膠蛋白是蠶繭中的一種水溶性糖蛋白，占總重的15%～35%，是絲綢工業(yè)的副產(chǎn)品，主要存在于繅絲廠廢水中，產(chǎn)量較大，具有重要的回收利用價值［12，13］.早期研究發(fā)現(xiàn)，以蛋白酶對絲膠蛋白進行水解可獲得帶有多個氨基酸殘基的糖肽，其中包括帶有單糖或二糖結(jié)構(gòu)的O-糖肽，并且通過化學方法和糖苷酶法降解后分析推測，這些O-糖肽具有與腫瘤細胞Tn 和T 抗原一致的小分子糖鏈結(jié)構(gòu)［14，15］.然而，由于所用分析手段的局限性，尚無更直接、更明確的絲膠蛋白完整O-糖鏈結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)，而且不同O-糖鏈的豐度分布情況仍不清楚，更缺乏對這一O-糖鏈資源進行開發(fā)利用的相關技術(shù)方法.

基于此，本文以絲膠蛋白為研究對象，以電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）、串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）和在線液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Online LC-MS）為主要檢測手段，對其O-糖鏈的結(jié)構(gòu)、豐度分布及含量進行了分析，并進一步建立了對其O-連接單糖進行非還原性釋放和分離制備的新方法，發(fā)展了以其為原料通過鏈霉蛋白酶E（Pronase E）釋放制備Tn抗原和T抗原的新方法，為絲膠蛋白O-糖鏈資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和技術(shù)基礎，對癌癥糖肽疫苗及靶向檢測試劑的合成制備有重要的潛在價值.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

家蠶蠶繭，初級農(nóng)產(chǎn)品，四川藏曦堂生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、氫氧化鈉（NaOH）、苯磺酰肼（BSH）、吉拉德試劑P（GP）和二甲亞砜（DMSO），分析純，德國Merck KGaA 公司；乙腈（ACN），色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司；PNGase F，純度≥95%（SDS-PAGE），德國Merck KGaA公司；鏈霉蛋白酶E（Pronase E），7000 U/g，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；C18固相萃取小柱，250 mg/4 mL，美國Waters 公司；多孔石墨碳（PGC）固相萃取小柱，250 mg/3 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

LC-2010A 型高效液相色譜（HPLC）儀，日本Shimadzu 公司；LTQ-XL 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）儀，美國Thermo Scientific公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 蠶繭絲膠蛋白的提取 參照文獻［16］方法，將2 g 蠶繭剪碎后用二次蒸餾水清洗3 次，加入400 mL二次蒸餾水，于100 ℃水浴中加熱40 min，冷卻過濾，將濾液減壓濃縮至50 mL，冷凍干燥后得到白色絲膠蛋白粉末.

1.2.2O-糖鏈的“一釜法”釋放及純化 參照文獻［17］報道的“一釜法”對絲膠蛋白O-糖鏈進行釋放并同時進行PMP標記.將5 mg絲膠蛋白粉末溶于2 mL含2.5 mol/L PMP 和2.0 mol/L NaOH 的50%（體積分數(shù)）甲醇溶液中，置于80 ℃水浴中密閉反應24 h.反應結(jié)束后，將樣品溶液轉(zhuǎn)移至4 mL離心管中，用0.3 mL12 mol/L濃鹽酸將pH值調(diào)至中性，然后加入1.5 mL二氯甲烷萃取多余的PMP，再用20 μL冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4～5，并用二氯甲烷重復萃取2次.通過真空濃縮對所得上層清液進行干燥，并用1 mL水復溶，用于C18固相萃取小柱分級純化.在純化過程中，先用體積分數(shù)分別為20%和25%的ACN溶液各50 mL依次對C18固相萃取小柱進行清洗，然后用12 mL ACN進行活化，用15 mL水進行平衡.加入樣品溶液并等待其被小柱充分吸附后，以6倍柱體積的水洗柱除鹽，再依次用25%和35%的ACN溶液各3 mL洗脫目標物，洗出液經(jīng)離心濃縮儀干燥后在-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3O-糖鏈PMP 衍生物的全甲基化 參考文獻［18］方法，將100 mg 干燥的NaOH 顆粒研磨成粉末后加入1 mL 無水DMSO，充分混合均勻后將400 μL 該混合液加入冷凍干燥后的糖鏈樣品中，并加入100 μL 碘甲烷（CH3I），室溫下避光、振蕩反應30 min.反應結(jié)束后，加入1 mL 水終止反應，然后加入1 mL 二氯甲烷，充分振蕩后以18313g的轉(zhuǎn)速離心3 min，棄去上層清液.向所得有機相中加入1 mL 0.5 mol/L NaCl溶液，充分混合均勻后以18313g轉(zhuǎn)速離心3 min，棄去上層清液，重復此萃取操作3次.最后，將所得有機相減壓濃縮干燥，并用甲醇重新溶解，用于多級串聯(lián)質(zhì)譜（MSn）分析.

1.2.4O-糖鏈PMP 衍生物的反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離分析 采用Supersil ODS2 C18 反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對O-糖鏈PMP衍生物樣品進行RP-HPLC分離，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL，流動相A 和B 分別為ACN 和10 mmol/L 乙酸銨（pH=4.5），洗脫梯度：0 min，86%A+14%B；30 min，84%A+16%B.流速為0.8 mL/min.

1.2.5O-連接單糖的氨水催化法非還原性釋放 將10 mg絲膠蛋白置于10 mL密閉玻璃小瓶中，加入3 mL氨水（質(zhì)量分數(shù)25%～28%）并搖勻，在一定溫度水浴中進行反應，最佳條件為40 ℃反應16 h.反應結(jié)束后，經(jīng)真空濃縮除去氨水，然后用1 mL水重新溶解樣品，用PGC固相萃取小柱進行分級純化.在純化過程中，將樣品溶液加載到PGC 小柱上，收集洗出液并重復上樣3 次，然后用10 mL 水洗脫糖鏈，并以每管0.5 mL對洗出液進行分部收集，最終通過ESI-MS進行檢測分析.

1.2.6 還原性O-單糖的苯磺酰肼（BSH）衍生化 參照文獻［18］方法，將1 mg從絲膠蛋白中釋放的還原性O-糖鏈樣品和10 mg BSH溶解于1 mL乙醇/水/冰乙酸（體積比10∶9∶1）混合液中，搖勻后置于60 ℃水浴中反應45 min，再加入1 mL二氯甲烷萃取過量的BSH，重復萃取操作3次，最后收集上層清液并干燥，用100 μL體積分數(shù)為50%的ACN水溶液重新溶解，用于HPLC分離分析.

1.2.7O-單糖BSH 衍生物的親水相互作用液相色譜（HILIC）分離 用TSK-GEL Amide-80 酰胺柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對O-糖鏈BSH 衍生物樣品進行HILIC 分離，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL，流動相A 和B 分別為ACN 和10 mmol/L 乙酸銨（pH=4.5）溶液，流速為0.8 mL/min，洗脫梯度：0 min，86%A+14%B；30 min，84%A+16%B.對所有色譜峰組分分別進行收集并干燥，以ESI-MS 檢測分析.

1.2.8 還原性O-單糖單體的再生 參照文獻［18］方法，將HILIC分離后收集到的O-糖鏈BSH衍生物組分溶于1 mL 體積分數(shù)為5%的冰乙酸溶液中，在70 ℃反應30 min.反應結(jié)束后，加入2 mL 二氯甲烷，振蕩混合均勻并以18313g的轉(zhuǎn)速離心3 min，收集上層清液且重復萃取操作3次.最終將所得水相溶液減壓濃縮干燥并用水重新溶解，用于ESI-MS檢測.

1.2.9 絲膠蛋白源Tn 和T 抗原的Pronase E 水解法釋放及純化 參照文獻［19］報道的反應條件，將10 mg 絲膠蛋白和10 mg Pronase E 置于4 mL 離心管中，加入1 mL 1 mol/L（pH=8.0）磷酸鹽緩沖液溶解后，于37 ℃反應24 h，然后以C18 固相萃取小柱進行分級純化.在純化過程中，首先用5 mL ACN 對C18小柱進行活化，再用10 mL水平衡，然后加載樣品溶液，并用20 mL水洗脫糖鏈，以每管0.5 mL對洗出液進行分部收集，最終通過ESI-MS和MS/MS對收集的樣品進行檢測分析.

1.2.10 質(zhì)譜分析條件 利用LTQ XL 線性離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行ESI-MS，MS/MS 和LC-MS分析.一級質(zhì)譜采用正離子模式掃描，質(zhì)荷比（m/z）范圍為100～2000，離子傳輸毛細管溫度為275 ℃，管透鏡電壓為350 V.二級質(zhì)譜（MS2）和多級質(zhì)譜（MSn）采用碰撞誘導裂解（CID）方法進行，歸一化碰撞能量設置為25.0～35.0，激活q值為0.25，激活時間為30 ms，其它質(zhì)譜參數(shù)設置參照文獻［20］方法.以Supersil ODS2 C18反相色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）進行在線LC-MS分析，進樣量為10 μL，流動相A 和B 分別為ACN 和10 mmol/L 乙酸銨（pH=5.5），采用等度洗脫：0 min，19%A+81%B；70 min，19%A+81%B，流速為0.2 mL/min.此過程中質(zhì)譜參數(shù)同上.質(zhì)譜分析完成后，借助GlycoWorkbench軟件［21］對采集到的數(shù)據(jù)進行解析和注釋.

2 結(jié)果與討論

2.1 絲膠蛋白O-糖組的定性和定量分析

為了在已有研究［14，15］基礎上進一步從完整分子的角度確定絲膠蛋白O-糖鏈的具體種類和結(jié)構(gòu)，采用“一釜法”［17］對其同時進行了非還原性釋放與PMP標記，樣品經(jīng)過富集純化后，以ESI-MS進行檢測分析.由圖1（A）可見，在ESI-MS正離子模式下共檢測到4個質(zhì)譜峰，其中m/z552.33和574.33處分別為O-連接單糖HexNAc 的PMP 衍生物的［M+H］+和［M+Na］+信號峰，而m/z714.42 和736.42 處為分別為O-連接二糖HexHexNAc 的PMP衍生物的［M+H］+和［M+Na］+信號峰，表明絲膠蛋白中僅有這兩種O-糖鏈，而且都是小分子.相比之下，其它已報道的許多糖蛋白［22］中的O-糖鏈種類通常更加多樣，分子量也更大，與絲膠蛋白明顯不同.

Fig.1 Structural identification and quantification of intact O-glycans as PMP derivatives released from sericin by ESI-MS,MS/MS,RP-HPLC and LC-MS

為了從完整分子的角度解析絲膠蛋白O-連接二糖HexHexNAc 內(nèi)部的糖苷鍵連接方式，對“一釜法”釋放的O-糖鏈PMP衍生物全甲基化修飾后，以MSn進行分析，結(jié)果如圖1（B）所示.該糖鏈全甲基化衍生物的理論分子量為839，m/z62.50處為其［M+Na］+信號峰，將其作為母離子進行MS2分析，產(chǎn)生的碎片離子m/z626.33（Y1）和644.33（Z1）均為糖苷鍵斷裂所形成的碎片峰.進一步對m/z644.33（Z1）進行MS3分析，獲得了碎片離子m/z510.33（0，3A1），其為該糖鏈中1，3-連接糖苷鍵的特征信號峰.根據(jù)O-糖鏈生物合成過程［23］以及相關文獻［15］報道可知，該糖苷鍵應為β構(gòu)型，可以判斷該O-糖鏈的糖苷鍵為β1，3-連接.

為了確定絲膠蛋白O-連接單糖的種類以及不同O-糖鏈的豐度比例，以GlcNAc和GalNAc的PMP衍生物為參照標準品，對絲膠蛋白O-糖鏈PMP衍生物進行了RP-HPLC定性定量分析，結(jié)果如圖1（C）所示.通過對比單糖PMP衍生物的保留時間發(fā)現(xiàn)，絲膠蛋白O-連接單糖HexNAc的PMP衍生物的保留時間與GalNAc的PMP衍生物保留時間高度一致，而與GlcNAc的PMP衍生物保留時間差異較大，因此可以確定絲膠蛋白中只存在一種O-連接單糖，即O-GalNAc.因為絲膠蛋白中的O-糖鏈只有這一種核心單糖，所以結(jié)合文獻［15］報道可以判斷，其O-連接二糖的結(jié)構(gòu)應為Galβ1，3GalNAc.由此可見，絲膠蛋白中含有與癌癥Tn抗原和T抗原相同的O-糖鏈結(jié)構(gòu).此外，通過對RP-HPLC洗脫組分進行ESI-MS檢測確定了絲膠蛋白O-Galβ1，3GalNAc 的PMP衍生物所對應的色譜峰，進而通過色譜峰面積計算可知，絲膠蛋白中O-GalNAc與O-Galβ1，3GalNAc的豐度比約為5.3∶1.

為了進一步測定這兩種O-糖鏈在絲膠蛋白中的含量，參照文獻［17］報道的O-糖鏈穩(wěn)定同位素試劑標記及質(zhì)譜定量分析方法，向來源于5 mg絲膠蛋白的O-糖鏈PMP衍生物中加入0.11 μg GalNAc 標準品的氘代PMP（d5-PMP）衍生物作為定量內(nèi)標，然后進行LC-MS 定性定量分析，所得絲膠蛋白O-Gal-NAc的PMP衍生物的提取離子流圖（EIC）如圖1（D）所示.根據(jù)分析得到的內(nèi)標與O-GalNAc的EIC峰面積比值計算可知，絲膠蛋白中O-GalNAc 的含量為1.58 μg/g，并且根據(jù)絲膠蛋白中不同O-糖鏈的豐度比值進一步計算得出O-Galβ1，3GalNAc的含量為0.54 μg/g.以上結(jié)果為Tn抗原和T抗原的釋放提供了重要理論依據(jù).

2.2 絲膠蛋白還原性O-連接單糖的釋放及分離制備

在癌癥O-糖肽疫苗候選分子合成過程中，通常需要以單糖GalNAc為原料合成用于增強免疫響應的糖簇配體［10，11］.為了從天然原材料中獲取高純度GalNAc，進一步建立了一種在氨水中從絲膠蛋白中釋放制備還原性O-GalNAc 的新方法.首先，參考本課題組［24］已建立的氨水催化釋放糖蛋白N-糖鏈的反應條件，將絲膠蛋白溶于體積分數(shù)為25%～28%的氨水中，濃度為1 g/L，反應時間設為16 h，對不同溫度（25，30，35，40，45，50和55 ℃）下釋放并純化獲得的糖鏈產(chǎn)物進行ESI-MS檢測，以GalNAc的質(zhì)譜峰信號強度為指標來判斷其釋放效率，從而對反應溫度進行考察，結(jié)果如圖2（A）所示.可見，最佳反應溫度為40 ℃，而繼續(xù)升高溫度時糖鏈產(chǎn)率反而會下降，其原因可能是產(chǎn)物發(fā)生了降解.在此最佳溫度下以類似方法進一步對反應時間（4，8，12，16，20和24 h）進行了考察，結(jié)果如圖2（B）所示，最佳反應條件下所釋放糖鏈樣品的質(zhì)譜圖如圖2（C）所示.由圖2（B）可見，當反應時間從4 h延長至16 h，GalNAc 的釋放產(chǎn)率不斷升高，而反應16 h 后產(chǎn)率不斷下降，因此最佳反應時間為16 h.由圖2（C）可知，以該方法從絲膠蛋白中釋放出的糖鏈為O-GalNAc，而未發(fā)現(xiàn)O-Galβ1，3GalNAc 的質(zhì)譜信號，其原因可能是釋放的二糖因含有1，3-連接糖苷鍵而在堿性條件下發(fā)生了剝皮降解反應［25］，而釋放的單糖在相同條件下則具有相對較高的穩(wěn)定性.此外，發(fā)現(xiàn)樣品雖已通過固相萃取柱分級純化，但糖鏈純度依然不高，在質(zhì)譜圖中觀察到許多雜質(zhì)信號峰.

為了進一步對氨水催化法釋放的絲膠蛋白還原性O-糖鏈樣品進行精細分離純化，利用本課題組［18］已建立的還原性糖鏈HPLC分離制備策略，對其進行BSH標記后，再進行HILIC分離和組分收集，最后對收集到的糖鏈BSH衍生物組分進行了脫標記，檢測結(jié)果如圖2（D）～2（F）所示.如圖2（D）所示，從絲膠蛋白釋放的O-GalNAc 標記上BSH 后，其質(zhì)譜圖中信號峰為m/z398.08（［M+Na］+）和m/z414.08（［M+K］+）.圖2（E）為該樣品的HILIC 分離色譜圖，可見多種雜質(zhì)成分與目標糖鏈被有效分開.在HILIC分離過程中，根據(jù)保留時間對樣品中的GalNAc BSH衍生物組分進行收集和干燥，然后在弱酸性水溶液中加熱脫除BSH，產(chǎn)物的ESI-MS檢測結(jié)果如圖2（F）所示.可見，GalNAc 的BSH衍生物已完全轉(zhuǎn)化為還原性GalNAc，且其中雜質(zhì)信號峰極低，說明樣品純度顯著提高.以上結(jié)果表明，氨水催化法釋放的絲膠蛋白GalNAc 可通過色譜方法實現(xiàn)精細分離純化，此釋放純化策略的建立為獲取高純度GalNAc提供了一種重要天然來源，同時也為絲膠蛋白資源的深度利用提供了一種新的可能途徑.

Fig.2 Reaction condition optimization and product chromatographic separation of the ammoniacatalyzed method for non-reductive release of sericin O-linked monosaccharide

2.3 絲膠蛋白源Tn和T抗原的釋放純化及質(zhì)譜分析

Tn抗原和T抗原是合成癌癥特異性糖肽疫苗的關鍵原料，其易得性和結(jié)構(gòu)可靠性對癌癥疫苗的合成和生產(chǎn)有重要影響［8～11］.絲膠蛋白作為一種天然糖蛋白，由于其小分子O-糖鏈在結(jié)構(gòu)上與癌癥Tn抗原和T抗原完全相同，因而理論上可作為制備這兩種癌癥抗原的天然原材料.為了進一步從絲膠蛋白中提取Tn抗原和T抗原，利用不同量的Pronase E對絲膠蛋白進行水解，并以C18固相萃取小柱對樣品進行分級純化，最終在不同時間段的水洗液中分別獲得了Tn抗原和T抗原組分，產(chǎn)物的ESI-MS檢測結(jié)果如圖3所示，其結(jié)構(gòu)的MS/MS分析鑒定結(jié)果如圖4所示.

Fig.3 ESI-MS profiles of Tn antigen(A) and T antigen(B) derived from sericin

Fig.4 MS/MS analysis of Tn antigen and T antigen derived from sericin

從絲膠蛋白中釋放的Tn 抗原的理論相對分子質(zhì)量為308（GalNAc-Ser）和322（GalNAc-Thr），圖3（A）中m/z331.17和353.17處分別為GalNAc-Ser的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號峰，而m/z345.17和367.17處分別為GalNAc-Thr的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號峰.同時，從絲膠蛋白中釋放的T抗原的理論相對分子質(zhì)量為470（GalGalNAc-Ser）和484（GalGalNAc-Thr），圖3（B）中m/z493.25和515.25處分別為GalGalNAc-Ser的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號峰，而m/z507.25和529.25處分別為GalGalNAc-Thr的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號峰.進一步以m/z331.17，345.17，493.25 和507.25 作為母離子進行MS/MS分析時，產(chǎn)生的碎片離子信號均能夠與Tn抗原和T抗原結(jié)構(gòu)相對應（圖4）.由于已確定T抗原中的二糖為β1，3-連接，而且現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的天然糖蛋白中的O-糖肽鍵均為α-構(gòu)型，文獻［15］報道的絲膠蛋白O-糖肽鍵也同樣具有此構(gòu)型，因此可以判斷產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為GalNAc-α-Ser/Thr 和Galβ1，3GalNAc-α-Ser/Thr，與癌癥Tn抗原和T抗原的結(jié)構(gòu)相同.

此外，研究中還發(fā)現(xiàn)當Pronase E用量較少時無法從絲膠蛋白中釋放出Tn抗原和T抗原，而當該酶的用量增加至與絲膠蛋白原料等重時才能夠得到較多的Tn抗原和T抗原，說明利用Pronase E 法可從絲膠蛋白中有效釋放出Tn抗原和T抗原，并且對絲膠蛋白肽鏈的水解程度明顯影響產(chǎn)物產(chǎn)率.同時，在產(chǎn)物的質(zhì)譜圖（圖3）中還有少量低豐度未知物的信號，其可能是樣品中未除凈的少量肽段雜質(zhì)，說明樣品純化方法仍有必要進一步改進.此外，目前該方法中Pronase E的用量較大，未來可考慮與其它蛋白酶聯(lián)合使用，并實現(xiàn)對產(chǎn)物產(chǎn)率的準確估算，以進一步提高反應效率，并降低成本，為Tn抗原和T抗原的大量生產(chǎn)制備奠定基礎.

3 結(jié)論

以ESI-MS，MS/MS及在線LC-MS為主要檢測手段，通過O-糖組學分析發(fā)現(xiàn)，蠶繭絲膠蛋白中僅存在GalNAc和Galβ1，3GalNAc兩種小分子O-糖鏈，二者在結(jié)構(gòu)上分別與Tn抗原與T抗原相同，豐度比約為5.3：1，其中GalNAc 的含量約為1.58 μg/g，Galβ1，3GalNAc 的含量為0.54 μg/g.利用氨水催化法從絲膠蛋白中釋放O-糖鏈，獲得了還原性O-連接單糖，而O-連接二糖被降解，最佳反應條件為在體積分數(shù)為25%～28%的氨水中于40 ℃反應16 h，并通過液相色譜實現(xiàn)了樣品的精細分離純化，得到了高純度的還原性單糖GalNAc，由此表明絲膠蛋白中的O-連接單糖在氨水中被釋放的過程中具有較好的穩(wěn)定性.通過Pronase E水解法可從絲膠蛋白中有效釋放出Tn抗原和T抗原，并發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白肽鏈的水解程度對產(chǎn)物產(chǎn)率有重要影響.該研究為獲取高純度GalNAc，Tn 抗原和T 抗原提供了一種重要天然來源，同時也為絲膠蛋白資源的開發(fā)利用提供了一種新的可能途徑.