基于FFPE組織切片的膀胱癌N-連接糖鏈原位酶解及分析*

程 穎孫承文秦 艷 時 帥 李岳陽 樊啟高 楊剛龍*高曉冬*

（1）江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122；2）江南大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，無錫 214028；3）江南大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，無錫 214028；4）江南大學(xué)物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院，無錫 214122；5）江南大學(xué)人工智能與計算機學(xué)院，無錫 214122）

N-連接糖基化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，在細胞間黏附、細胞遷移、發(fā)育、病原體識別和感染等重要生物過程中起著至關(guān)重要的作用［1-5］。N-連接糖鏈是在肽序列Asn-X-Ser/Thr（其中X代表除脯氨酸以外的任何氨基酸）處共價連接到天冬酰胺的低聚糖，具有共同的五糖核心結(jié)構(gòu)，經(jīng)過一系列糖基化相關(guān)酶的催化，可產(chǎn)生多種N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)變異，并被分為3種類型：高甘露糖型、雜合型和復(fù)雜型［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機體（組織、血清、尿液、腹水等）的N-連接糖基化異常密切相關(guān)［7］。更值得注意的是，N-連接糖基化修飾是在細胞器中一系列有組織的酶反應(yīng)控制下進行的，具有很高的特異性，且對細胞內(nèi)外環(huán)境的細微變化非常敏感，具有作為腫瘤標志物的先天優(yōu)勢［8］。因此，N-連接糖基化修飾物在腫瘤診斷中潛力巨大，其中包含的N-連接糖鏈也是腫瘤標志物的主要研究對象之一。例如，在13對結(jié)直腸癌腫瘤組織和相應(yīng)對照結(jié)腸組織N-連接糖鏈變化的研究中發(fā)現(xiàn)，平分型N-連接糖鏈在腫瘤組織中顯著減少，可用作判斷結(jié)直腸癌的潛在生物標志物［9］。

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，以尿路上皮癌居多［10］。膀胱癌的發(fā)病率在男性和女性癌癥患者中分別位居第4和第11位［11］。隨著技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于膀胱癌N-連接糖基化的研究更加深入，涵蓋N-連接糖基化相關(guān)基因及蛋白質(zhì)表達和蛋白質(zhì)翻譯后N-連接糖鏈修飾水平［12-14］。其中關(guān)于膀胱癌N-連接糖鏈研究的生物樣本來源各異，包括膀胱癌細胞系、患者血液或尿液等［14-16］。有研究解析了膀胱癌患者血清球蛋白上N-連接糖鏈，發(fā)現(xiàn)N5H5F1等的顯著上調(diào)可指示膀胱癌發(fā)生，并引入N-連接糖鏈集合評分模式（dNGscore）幫助判斷膀胱癌［17］。但目前尚無對膀胱癌患者組織中N-連接糖鏈作為膀胱癌生物標志物的研究，與癌癥細胞系、患者血液或尿液相比，患者腫瘤組織能更直接真實反應(yīng)其癌癥發(fā)生后腫瘤部位的N-連接糖鏈異常修飾情況。

相較于完整手術(shù)組織和冷凍組織切片，福爾馬林浸泡石蠟包埋 （formalin-fixed paraffinembedded，F(xiàn)FPE）保存的組織切片更易獲得，其貯存要求也更低［18］，且FFPE組織切片已被證實其中的N-連接糖鏈修飾情況與冷凍切片基本一致，并與臨床表型密切相關(guān)［19］。基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionizationmass spectrometry，MALDI-MS）常被研究人員用來表征分析FFPE組織切片的N-連接糖鏈［20］，達到快速鑒定微量的組織中蛋白質(zhì)N-連接糖鏈的目的。近 年 來，質(zhì) 譜 成 像（mass spectrometry imaging，MSI）技術(shù)不斷發(fā)展成熟，已經(jīng)實現(xiàn)了對N-連接糖鏈在組織切片中的原位分布解析，揭示了N-連接糖鏈在腫瘤組織中的不均一性［21］。此外，從組織上分離N-連接糖鏈是質(zhì)譜檢測FFPE組織切片中N-連接糖鏈的關(guān)鍵步驟，目前的分離方法有：刮取玻片上的組織并裂解釋放蛋白質(zhì)，溶液內(nèi)酶解蛋白釋放N-連接糖鏈［20］；原位酶解組織，實現(xiàn)組織直接釋放N-連接糖鏈［22］。相較于前者而言，后者操作更簡便。

綜合考慮上述情況，本文發(fā)展了一種原位酶解組織釋放N-連接糖鏈（in-situ N-linked glycan release）聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法（INGR-MS）研究膀胱癌FFPE組織切片的N-連接糖鏈修飾水平。利用該方法分析了16例膀胱癌患者的癌癥和癌旁的FFPE組織切片，結(jié)果顯示：在腫瘤組織中，高甘露 糖 型N2H6、N2H7、N2H8、N2H9和 復(fù) 雜 型N5H6F1糖鏈修飾水平顯著提高；高甘露糖型N2H5、雜 合 型N3H5和 復(fù) 雜 型N3H4、N4H4、N5H6F1S2糖鏈修飾水平顯著下降。ROC分析顯示，雙天線型N-連接糖鏈N3H4（AUC=0.90）和N4H4（AUC=0.91）在單獨或者共同區(qū)分膀胱癌患者腫瘤組織和癌旁組織中都具有很好的可靠性，可能成為膀胱癌的潛在生物標志物。

1 材料與方法

1.1 材料

乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸和三氯甲烷購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；碳酸氫銨（NH4HCO3）、2,5-二羥基苯甲酸（DHB）、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、標準肽、三氟乙酸（TFA）、乙酸（FA）、甲醇和二甲亞砜（DMSO）購自Sigma-Aldrich（美國）；二甲苯購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碘甲烷購自西亞化學(xué)科技有限公司；PNGase F購自北京生夏蛋白技術(shù)有限公司；C18 SPE膜片購自3M公司（美國）；多孔石墨化碳（PGC）層析柱購自Sigma-Aldrich（美國）。16例膀胱癌患者的組織切片來自江南大學(xué)附屬醫(yī)院，患者樣本信息如表1所示，16例癌癥組織中，15例為尿路上皮癌，1例為鱗狀細胞癌（表S1）。本研究中涉及人體樣本的所有程序均符合江南大學(xué)生物安全與倫理委員會的倫理標準。

1.2 FFPE組織切片脫石蠟與抗原修復(fù)

FFPE切片通過兩次二甲苯洗滌脫蠟，每次10 min；然后在100%乙醇浸泡2次，5 min/次；再分別在95%、90%、80%和70%（v/v）的乙醇溶液浸泡一次，各3 min；而后用超純水浸泡2次，3 min/次；最后在真空干燥器中干燥5 min。之前有關(guān)FFPE切片的研究發(fā)現(xiàn)，抗原修復(fù)可以消除福爾馬林浸泡造成的蛋白質(zhì)交聯(lián)，暴露更多蛋白質(zhì)［23］。將切片置于裝有pH 3.0抗原修復(fù)緩沖液的切片盒中，于95℃下孵育30 min；然后將切片盒置于冷水中冷卻5 min；再用水替換切片盒中一半緩沖液后在冷水中冷卻2次，5 min/次；而后用超純水沖洗切片10~15 s；最后在真空干燥器中干燥5 min。

1.3 N-連接糖鏈提取及全甲基化

將PNGase F溶液（PNGase F溶于40 mmol/L NH4HCO3；1∶50（v/v））覆蓋在切片組織區(qū)域，于45℃環(huán)境下干燥20 min后，在自制濕盒內(nèi)37℃孵育3 h。用50 mmol/L NH4HCO3覆蓋組織3次，5 min/次；收集合并覆蓋溶液即為N-連接糖鏈。使用自制的PGC槍頭和ACN/水系統(tǒng)純化N-連接糖鏈并冷凍干燥。隨后進行N-連接糖鏈的全甲基化：將NaOH和DMSO的勻漿加入干燥N-連接糖鏈樣品中，再加入碘甲烷，室溫下避光振蕩25 min，加入水使反應(yīng)停止；用三氯甲烷萃取全甲基化N-連接糖鏈，三氯甲烷層用水洗滌8次，氮吹干燥樣品。

1.4 N-連接糖鏈MALDI-TOF/TOF-MS檢測

5μl甲醇∶水（1∶1，v/v）溶解全甲基化N-連接糖鏈，取1μl與1μl DHB-Na基質(zhì)溶液（20 g/L DHB、10%甲醇、1 mmol/L NaCl）混合，上樣于MTP Anchorchip靶板（900μm，384點）上，并在室 溫 下 干 燥。使 用FlexControl 3.0（Bruker Daltonics GmbsH，Bremen，Germany）控 制UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS（Bruker Daltonics GmbH，Bremen，Germany）分析N-連接糖鏈樣品。儀器參數(shù)設(shè)置如下：陽離子模式，離子源1：24.59 kV，離子源2：22.19 kV；反射模式，反射電壓1：26.63 kV，反射電壓2：13.44 kV；質(zhì)量測定范圍，1.5～4.5 ku。在一級圖譜中選擇目標峰進行二級質(zhì)譜分析，具體參數(shù)設(shè)置如下：離子源1：7.5 kV，離子源2：6.8 kV；反射電壓1：29.1 kV，反射電壓2：13.95 kV，LIFT1：19 kV；LIFT2：3.15 kV。

1.5 N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)注釋及數(shù)據(jù)分析

使用FlexAnalysis 3.3（Bruker Daltonics GmbsH，Bremen，Germany）對 譜 圖 進 行5次smooth并執(zhí)行1次Baseline subtraction，選擇信噪比大于3的同位素峰，將m/z和intensity信息導(dǎo)出為xlsx格式。用GlycoWorkbench 2手動注釋N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)，參數(shù)設(shè)定如下：GlycomeDB數(shù)據(jù)庫，離子形式為［M+Na］+，電荷量為+1，前體離子容忍度為1，碎片離子容忍度為0.5。為了研究膀胱癌腫瘤和癌旁組織中N-連接糖鏈修飾水平的差異，使用N-連接糖鏈的質(zhì)譜強度數(shù)據(jù)表征其修飾水平。為了消除不同樣本間的個體差異，采用N-連接糖鏈的相對強度進行比較，單一譜圖中某一N-連接糖鏈強度與該譜圖中所有N-連接糖鏈強度的比值為其相對強度。為了降低實驗誤差，取3次重復(fù)的N-連接糖鏈相對強度均值進行腫瘤和癌旁組織之間的比較。使用GraphPad Prism 8繪制散點圖比較腫瘤和癌旁組織間的N-連接糖鏈修飾水平差異，并使用雙尾配對t檢驗驗證數(shù)據(jù)的顯著差異程度。使用GraphPad Prism 8繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線展示在癌癥中異常修飾的N-連接糖鏈對膀胱癌判斷的準確度，其曲線下面積（area under curve，AUC）值即為其預(yù)測準確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 膀胱癌FFPE組織切片N-連接糖鏈分析

以FFPE組織切片為材料研究患者組織的N-連接糖鏈變化，對原位酶解組織釋放N-連接糖鏈聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法進行了優(yōu)化。優(yōu)化后具體流程如下：FFPE組織切片經(jīng)脫石蠟、復(fù)水化和抗原修復(fù)后，用PNGaseF酶解組織釋放N-連接糖鏈，再經(jīng)PGC-Tip富集后進行泛甲基化修飾，然后用MALDI-TOF/TOF-MS檢測甲基化N-連接糖鏈并進行數(shù)據(jù)分析（圖1）。選取來自16例不同保存時間的膀胱癌患者FFPE切片，共32個組織切片樣本，每個樣本組織包含3次重復(fù)，切片HE染色結(jié)果顯示膀胱癌腫瘤區(qū)域清晰可見（圖S1）。同一患者腫瘤和癌旁組織的FFPE切片N-連接糖鏈圖譜顯示兩者間的N-連接糖鏈特征具有明顯差異（圖2a）。同時，在癌旁和腫瘤組織各切片檢測到N-連接糖鏈的個數(shù)中位數(shù)分別為33和36.5，同一個體重復(fù)樣品之間N-連接糖鏈檢測數(shù)量差異較小，且癌旁和腫瘤組織間N-連接糖鏈數(shù)目集中在同一數(shù)目范圍內(nèi)（圖2b），說明該糖鏈鑒定方法具有很好的穩(wěn)定性且可進行癌旁與腫瘤間的比較。此外，在癌旁和腫瘤組織中大多數(shù)N-連接糖鏈的變異系數(shù)（CV）值低于30%，且CV值的中值分別為27.70%和22.35%（圖2c），3次重復(fù)間的差異在可允許范圍內(nèi)，適用于膀胱癌FFPE組織切片的N-連接糖鏈分析［24］。隨后，為了探究FFPE組織切片保存時間對蛋白質(zhì)糖基化修飾的影響，對不同保存時間（1、2、3和4年）的FFPE組織切片鑒定的N-連接糖鏈進行了主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果表明不同儲存時間的FFPE組織切片的N-連接糖鏈之間沒有顯著差異，說明FFPE保存可以穩(wěn)定維持蛋白質(zhì)及其糖基化修飾的實際狀態(tài)（圖2d）。

溫濕度控制原理框圖如圖4所示。該控制系統(tǒng)由采用STC89C52單片機和無線模塊NRF24L01來傳輸和反饋數(shù)據(jù)，從而進行數(shù)據(jù)通信傳輸[2,9]。在PC機上，可以顯示外界的溫度和濕度的界面，如圖5所示。通過設(shè)定一個溫濕度來控制霧化片的工作。當外界環(huán)境沒有超過預(yù)設(shè)的條件即正常的數(shù)據(jù)傳輸時，指示燈是綠色的；當超過預(yù)設(shè)的條件后，指示燈變成紅色，處于報警狀態(tài)，霧化片開始工作。改變外界的環(huán)境，使其沒有超過預(yù)設(shè)的條件，指示燈又跳變成綠色，霧化片停止工作。

2.2 膀胱癌FFPE組織切片N-連接糖鏈定性分析

本研究從16對膀胱癌FFPE組織切片中共鑒定到76種N-連接糖鏈（表2），包括5種高甘露糖型、4種雜合型和67種復(fù)雜型N-連接糖鏈；對糖鏈進行了二級質(zhì)譜分析確定其糖型，部分二級譜圖見圖S2。在76種鑒定的N-連接糖鏈中有46種

（60.53%）糖鏈結(jié)構(gòu)被巖藻糖基化修飾，另外有28種（36.84%）N-連接糖鏈被唾液酸化修飾。對于單一N-連接糖鏈而言，高甘露糖型在癌旁組織和腫瘤組織種的相對強度均比較高，而復(fù)雜型中多分支型和唾液酸化修飾的N-連接糖鏈的相對強度較低（圖3a）。癌旁和癌組織中分別鑒定出66和73種N-連接糖鏈，除共同檢定到的63種N-連接糖鏈外，只在腫瘤組織或癌癥組織中鑒定到的N-連接糖鏈的情況如下：腫瘤組織中有10種（N3H4F1S1、N6H3F1、N5H4F2、N7H4、N6H5F1、N6H6、N7H6F1、N5H5F1S2、N6H7F2、N8H9F1），均為復(fù)雜型，主要為單巖藻糖基化修飾的N-連接糖鏈；癌旁組織中有3種（N3H4S1、N9H3F1、N6H5F3），均為復(fù)雜型（圖S3）。

Continued to Table 2

Continued to Table 2

Continued to Table 2

Continued to Table 2

對于3種亞型的N-連接糖鏈，腫瘤組織中高甘露糖型N-連接糖鏈比癌旁組織高甘露糖型N-連接糖鏈相對豐度高6.8%，腫瘤組織中復(fù)雜型N-連接糖鏈比癌旁組織中的相對豐度低5.7%（圖3b）。對復(fù)雜型N-連接糖鏈進一步分析發(fā)現(xiàn)，巖藻糖基化和唾液酸化的N-連接糖鏈差異較大，相比于癌旁組織，腫瘤組織中的巖藻糖化的復(fù)雜型N-連接糖鏈的相對豐度高2%；而唾液酸化的復(fù)雜型N-連接糖鏈的相對豐度低7%，約為癌旁組織的一半（圖3c）。

2.3 膀胱癌FFPE組織切片顯著差異的N-連接糖鏈

對僅在腫瘤組織中出現(xiàn)的N-連接糖鏈分析發(fā)現(xiàn)，這些特異表達的N-連接糖鏈在腫瘤組織中鑒定次數(shù)平均值為2.2，同一樣本間重復(fù)性差，并有明顯的個體差異（表S2），故為了提高差異指標的普適性，選取在32個組織FFPE切片樣本中鑒定次數(shù)70%以上（即鑒定次數(shù)大于等于23）的33個N-連接糖鏈，對其相對強度進行配對t檢驗分析。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，其中10個N-連接糖鏈修飾水平在腫瘤組織中表現(xiàn)出的顯著上升或下降趨勢，且該趨勢與患者的性別和年齡無關(guān)。在顯著差異的N-連接糖鏈中，5種N-連接糖鏈的修飾水平在腫瘤組織中顯著上升，其中4種N2H6（1 784.05 u；P<0.05），N2H7（1 987.98 u；P<0.01），N2H8（2 192.23 u；P<0.01），N2H9（2 396.18 u；P<0.01）為高甘露糖型，另一種N5H6F1（2 693.35 u；P<0.001）為復(fù)雜型；5種N-連接聚糖修飾水平在腫瘤組織中顯著下降，其中N2H5（1 579.78 u；P<0.05）為高甘露糖型，N3H5（1 824.91 u；P<0.01）為雜合型，N3H4（1 620.81 u；P<0.05），N4H4（1 865.94 u；P<0.001），N5H6F1S2（3 415.70 u；P<0.05）為復(fù)雜型（圖4）。

為了評估顯著差異N-連接聚糖指示膀胱癌的能力，對膀胱癌中的10種顯著差異的N-連接聚糖進行了ROC曲線分析。10種顯著差異N-連接聚糖的AUC除N3H5（AUC=0.69）外均大于0.7（圖5a），表明10種顯著差異的N-連接聚糖具有成為膀胱癌的標志物的潛力。進一步評估了多個N-連接糖鏈集合指示膀胱癌的能力，主要選擇M6-9（N2H6、N2H7、N2H8、N2H9）和C3-4（N3H4、N4H4）兩類糖鏈集合進行ROC分析。其中C3-4集合的AUC為0.9；M6-9集合的AUC為0.73（圖5b），表明C3-4 N-連接糖鏈集合可以成為尿路上皮癌潛在標志物集。

3 討 論

基于FFPE的N-連接糖鏈研究結(jié)果顯示，膀胱組織中N-連接糖鏈的相對強度與其他組織中N-連接聚糖修飾情況相似，高甘露糖型糖鏈為最主要的組織N-連接糖鏈。同時膀胱癌腫瘤組織的高甘露糖型和巖藻糖型糖鏈相對豐度升高，與乳腺癌、上皮卵巢癌等很多癌癥的情況類似［26-27］。本課題組前期關(guān)于正常膀胱細胞HCV29和膀胱癌細胞KK47、YTS1、J82和T24的定量糖組學(xué)研究結(jié)果顯示，高甘露糖型N-連接糖鏈中的M6-M9在膀胱癌細胞中顯著增加，與FFPE組織切片分析結(jié)果一致［28］。此外，F(xiàn)FPE組織切片研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高甘露糖型N-連接糖鏈N2H5在腫瘤組織中顯著下降。這可能與α-1,2甘露糖苷酶基因（MAN1A1）差異表達相關(guān)，在肺癌前期研究中表明，MAN1A1的過表達會增加M6-9高甘露糖的含量，但不會增加N2H5的含量［29-30］。另外，在前期尿路上皮癌血清免疫球蛋白N-連接聚糖解析的研究中，N4H4等雙天線型N-連接糖鏈在膀胱癌中顯著下降，這與FFPE組織切片中N-連接糖鏈研究結(jié)果趨勢一致［17］。近年來，有關(guān)腫瘤及癌旁組織中差異性表達的糖鏈參與癌癥的發(fā)生發(fā)展研究逐漸深入，其中有關(guān)MCF10A乳腺上皮細胞上皮間質(zhì)化過程的研究發(fā)現(xiàn)，N-連接糖鏈的β1-6GlcNAc分支上調(diào)能在低細胞密度下促進細胞遷移［31］。

總之，本文使用了一種基于FFPE切片N-連接聚糖分析方法，該方法能通過MALDI-TOF/TOFMS分析臨床FFPE組織切片的N-連接聚糖修飾水平情況，發(fā)現(xiàn)了一些在癌旁和腫瘤組織間修飾水平差異顯著的N-連接聚糖，為N-連接聚糖在膀胱癌發(fā)生中的作用研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

本研究表明，在膀胱癌患者的FFPE組織切片中，相較于癌旁組織，腫瘤組織中的N-連接糖鏈修飾表現(xiàn)出N-連接糖鏈M6-M9（高甘露糖型）以及N5H6F1（復(fù)雜糖型）修飾顯著增加；N2H5（高甘露糖型）、N3H5（雜合糖型）和N3H4、N4H4、N5H6F1S2（復(fù)雜糖型）修飾顯著減少的趨勢。這揭示了膀胱癌腫瘤組織中存在異常的N-連接糖鏈修飾情況。隨著研究的深入，特殊的N-連接糖鏈或可成為膀胱癌的癌癥生物標志物。

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Table 1 Sample information

Table 2 76 N-glycan compositions and their putative structures identified in this study

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