胎盤脫細胞基質作為組織修復材料的初步研究

劉 琇 臧傳寶 林彥超 程 龍 付曉萌

（銀豐低溫醫(yī)學科技有限公司，濟南 250102）

組織工程產品是近年來組織修復領域的熱門話題，已逐漸成為目前臨床手術治療及意外等導致的人體組織器官缺失和各種損傷的重要治療措施，目前組織工程產品面臨的關鍵問題之一是尋求理想的生物支架材料［1-3］。隨著生物材料技術的發(fā)展，脫細胞組織基質（acellular tissue matrix，ACTM）因其具有天然的三維支架、含有多種細胞活性因子備受關注，ACTM經過各種脫細胞技術等處理后獲得，主要由膠原蛋白組成，且去除細胞和抗原成分，故較少引起宿主免疫排異反應［4-6］。ACTM既可單獨應用，也可以負載種子細胞、細胞因子及藥物等，在組織工程再生修復方面發(fā)揮重要作用。

胎盤、臍帶作為分娩廢棄物，在胎兒出生之后，大都作為醫(yī)療廢物而遺棄，造成極大的浪費。胎盤為母體及胎兒之間物質交換的器官，是胚胎與母體組織的結合體，含有大量的膠原及纖維成分，同時具有多種生長因子促進細胞的生長與代謝。臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）來源于新生兒臍帶組織，目前分離、培養(yǎng)技術比較成熟，為應用比較廣泛的多功能干細胞之一，它能分化成許多種組織細胞，具有成脂、成骨、成軟骨、成肌分化潛能，具有廣闊的臨床應用前景［7-11］。

本研究采用脫細胞方法制備胎盤脫細胞基質，單獨或負載UC-MSCs進行大鼠皮下植入實驗，評價其生物相容性并探討其作為組織修復材料的可行性，為組織工程研究尋找合適的支架材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

本研究為隨機對照動物實驗，于2018年11月在濟南市藥監(jiān)局動物實驗中心完成。

1.2 材料

1.2.1 實驗動物

健康SD大鼠，普通級，6周齡，體質量120～150 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。本研究所采用的實驗動物及操作程序符合動物實驗相關倫理學要求。

1.2.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Gibco，USA），α-MEM細胞培養(yǎng)基（Gibco，USA），EDTA（Sigma，USA），脫氧膽酸鈉（索萊寶，中國），磷酸鹽緩沖液（索萊寶，中國），HEPES（Sigma，USA），DNaseⅠ（索萊寶，中國）；XFA6130全自動血液細胞分析儀（普朗，中國）；石蠟切片機（Leica，GER）；倒置相差顯微鏡（Olympus，JPN）；GM300刀式混合研磨儀（Retsch，GER）；低速離心機（Thermo，USA）；超凈工作臺（蘇州凈化，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Heal Force，中國上海）；戊巴比妥鈉（上海榕柏生物技術有限公司），常規(guī)手術器械等。

1.3 方法

1.3.1 臍帶間充質干細胞分離、培養(yǎng)、傳代

取健康足月新生兒臍帶組織（由健康產婦分娩后自愿捐贈），于超凈工作臺中采用無菌PBS反復沖洗臍帶表面，洗凈表面血液及體液，將臍帶剪成3～5 cm小段，剝除臍動、靜脈血管，保留華通膠部分，用組織剪剪碎至1 mm3組織塊，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法將剪碎的組織塊離心清洗2遍后，加入含體積分數(shù)10%FBS的ɑ-MEM細胞培養(yǎng)基，將其轉移至培養(yǎng)瓶中，于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進行全貼壁培養(yǎng)。待細胞出現(xiàn)集落生長并融合至80%以上時去除組織塊，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，之后按照1∶4的比例傳至第3代，收集細胞用作后續(xù)實驗。

1.3.2 胎盤脫細胞海綿基質材料制備及檢測

胎盤脫細胞海綿基質材料制備方法為本課題組開發(fā)且擁有自主產權的發(fā)明專利（中國專利號CN201911162947.1）［12］。合法取得臨床實驗用胎盤（由健康產婦分娩后自愿捐贈），采集前產婦HBV、HCV、HIV、梅毒標志物等病毒檢測均為陰性。用生理鹽水清洗3遍，剪成約2 cm3小塊，生理鹽水反復清洗3遍至基本無血色；GM300刀式混合研磨儀打碎（3 500 r/min，12 s，4次），1 500×g離心10 min，加入脫細胞溶液（含10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）+10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）+1.0%（w/v）脫氧膽酸納，pH 8.0）過夜處理16 h；次日1 500×g離心10 min后加入生理鹽水清洗3遍去除洗滌劑；0.1%過氧乙酸處理2 h進行病毒滅活，然后加入2 000 U/L DNaseⅠ酶的緩沖液，搖床過夜處理去除DNA；次日生理鹽水反復清洗后將胎盤脫細胞基質平鋪于不銹鋼器皿中，進行真空冷凍干燥處理，得到海綿基質材料（以下簡稱“材料”）。采用電子束滅菌，劑量為18 kGy。

1.3.3 大體觀察及蘇木精-伊紅（HE）染色

觀察胎盤脫細胞海綿基質的顏色及形態(tài)，另取脫細胞前胎盤組織及基質材料4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片進行HE染色，光鏡下觀察組織結構。

1.3.4 掃描電鏡觀察

取基質材料2.5%戊二醛固定，噴金進行掃描電鏡觀察微結構，應用Image J軟件分析材料孔隙率。

1.3.5 實驗動物分組及實驗方法

選取健康雄性SD大鼠39只，體質量120～150 g，隨機分為實驗1組、實驗2組及對照組（表1）。具體操作步驟：實驗大鼠于術前12 h禁飲食，分別稱重后以2%戊巴比妥鈉2 ml/kg麻醉大鼠后背部備皮，選取背部肌肉豐厚的脊柱旁肌為植入位點，消毒后以手術刀逐層切開皮膚、淺筋膜、深筋膜，分離深筋膜形成一皮囊。實驗1組植入胎盤脫細胞海綿基質材料（1 cm×1 cm×4 mm），逐層縫合；實驗2組植入胎盤脫細胞海綿基質材料（1 cm×1 cm×4 mm）后，用注射器注入臍帶間充質干細胞1 ml（細胞數(shù)為1×105個），逐層縫合；對照組只進行皮下皮囊制備，不植入任何材料，逐層縫合。手術后每天觀察術口炎性反應及切口愈合情況，分別于第3、5、7天大鼠頸靜脈取血進行血常規(guī)檢測，檢測白細胞（WBC）總數(shù)、淋巴細胞（LY）總數(shù)、單核細胞（MO）總數(shù)、粒細胞（GR）總數(shù)。于術后第1、2、4、8、9周各處死3只實驗動物，取植入材料及周圍組織，觀察材料降解情況，并進行脫水，石蠟包埋，HE染色觀察炎性細胞浸潤及新生血管情況。

Table 1 Grouping of experimental animals

2 結 果

2.1 胎盤脫細胞基質材料外觀特征及結構特征

按照所示方法構建的胎盤脫細胞基質材料呈乳白色，海綿狀，置于生理鹽水中復水后不散落（圖1a、b）。HE染色顯微鏡下觀察脫細胞的胎盤組織未見明顯藍染的細胞核（圖1d）。

2.2 電鏡觀察及孔隙率測定

對材料進行掃描電鏡觀察，可見材料內部空隙比較明顯，材料交聯(lián)度較好，且進一步驗證脫細胞效果明顯，無細胞殘留（圖2）。應用Image J軟件分析材料平均孔隙率為（77.54±2.53）%。

2.3 炎性反應觀察及血常規(guī)檢測結果分析

術后每天觀察切口處無紅腫、滲液等炎性反應，手術區(qū)域毛發(fā)正常生長，切口處愈合良好（圖3）。

為了進一步驗證材料是否引起炎性反應，分別于皮下植入后第3、5、7天取靜脈血進行血常規(guī)檢測，檢測WBC總數(shù)、LY總數(shù)、MO總 數(shù)、GR總數(shù)。實驗結果如圖4所示，實驗1組，實驗2組相比于對照組未見明顯的炎性細胞數(shù)增高，未出現(xiàn)明顯的炎性反應，植入材料存在一定的安全性。

2.4 組織學觀察

胎盤脫細胞海綿基質材料HE染色結果未見細胞結構，材料呈現(xiàn)網狀多孔結構（圖5a）。于手術后第7天對植入材料部位進行取材，進行HE染色分析，可見機體細胞逐漸嵌入材料內部生長，實驗2組（圖5c）可見血管深入，初步血管化現(xiàn)象，相對于實驗1組（圖5b），材料靠近中間位置形成較多細胞網狀結構，可見間充質干細胞的加入能夠促進機體細胞的遷入生長及血管化。

之后分別于植入后2、4、8、9周取材進行HE染色分析（圖6），植入材料與機體都有很好的組織相容性，實驗2組間充質干細胞的加入能夠促進機體細胞的嵌入生長。從第2周開始，植入材料內部開始出現(xiàn)明顯血管化（箭頭所示）。實驗1組第8周及第9周HE可以看出，植入材料只剩少量遺留，而實驗2組細胞遷入生長較好，材料相容性好，降解率低。

3 討 論

中國的手術量居世界首位，對于組織器官缺損傳統(tǒng)的修復方法是自體組織植入術，雖然可以取得滿意療效，但它是以犧牲自體健康組織為代價，導致很多并發(fā)癥及附加損傷；人的器官功能衰竭，采用藥物治療、暫時性替代療法可挽救部分病人生命，但供體器官來源極為有限，因免疫排斥反應需長期使用免疫抑制劑，由此而帶來的并發(fā)癥有時是致命的［13-15］。

自20世紀80年代科學家首次提出“組織工程學”概念以后，為眾多的組織缺損、器官功能衰竭病人的治療帶來了曙光［16-18］。隨著技術的發(fā)展，組織工程產品逐漸成為臨床上重要的手術修復和替代物，目前組織工程材料主要應用于心血管手術、燒傷、骨外科、手足外科、假體、整形等領域，需求量日益增大［19-22］。

組織工程學核心技術是將活細胞與生物材料結合，修復、重建、維持、恢復或提高人體組織的功能。脫細胞基質（ECM）是種子細胞及再生相關分子復合良好支架，保留了細胞外基質的生理結構，為種子細胞的種植提供了良好的三維空間結構和生長環(huán)境。種子細胞可以進入脫細胞后，與ECM成分相互作用，產生新生組織［23-27］。植入體內后干細胞能在體內分化、增殖，理論上能豐富組織細胞和組織結構，解決組織修復不足的矛盾，提高遠期效果［28］。

本實驗研究中采用胎盤等合法來源的同種異體組織經過脫細胞技術，構建成的支架材料，具有免疫原性低、組織相容性好等優(yōu)點，在組織工程材料構建及應用過程中，細胞的黏附和生長是確定組織工程支架材料安全性及有效性的關鍵指標，按照本實驗方法構建的胎盤脫細胞海綿基質材料呈海綿狀多孔結構，平均孔隙率為（77.54±2.53）%，可以為機體細胞的遷入生長提供良好的三維空間結構，其支架結構還可以為細胞黏附提供支撐，促進創(chuàng)面愈合。

本實驗將胎盤脫細胞海綿基質材料大鼠皮下植入后未產生明顯的炎性反應，血常規(guī)檢測也未見明顯的炎性細胞量升高，在SD大鼠的正常范圍內；大鼠皮下植入之后，材料可以很快的與皮下組織融合，細胞嵌入生長，表現(xiàn)出良好的生物相容性，且臍帶間充質干細胞的添加能夠短時間內促進機體細胞的嵌入生長及血管化。

4 結 論

胎盤脫細胞海綿基質材料具有良好的生物相容性，可作為組織工程材料的理想來源。但由于皮下植入實驗存在一定的局限性，為了更進一步探究胎盤脫細胞海綿基質材料的生物安全性及有效性，還需進行大量實驗室驗證及臨床前研究，這對今后組織工程材料開發(fā)及臨床組織修復應用至關重要。