小鼠睪丸組織慢速冷凍保存工藝的優(yōu)化研究*

譚 佳 郭瑩瑩 周新麗

（上海理工大學生物系統(tǒng)熱科學研究所，上海 200093）

近年來，由于各種因素（包括放化療、遺傳和先天性疾病等）引起的不孕不育發(fā)生率呈上升趨勢。不孕癥還會破壞患者的心理健康［1］，保留生育能力對于保證患者的生活質(zhì)量至關(guān)重要［2］。常用的男性生殖力保存方法為精子保存，是一種有效并且無創(chuàng)的生育力保存方法［3-6］。但是，患有少精癥或無精癥的男子難以采集正常活性的精子。另外，由于癌癥患者趨于年輕化，被診斷患有癌癥的兒童，治愈率可能高達80%［7-8］，而癌癥治療可能對睪丸生殖細胞帶來損害，30%的男性兒童癌癥幸存者在成年時將患無精子癥［9］。因此，對于無精子癥及無法產(chǎn)生精子的青春期前癌癥患者，無法采用精子冷凍方法對他們進行生殖力保存，冷凍保存睪丸組織用于后期移植可能是保持生育力的另一有效選擇。睪丸組織可以用兩種不同的形態(tài)進行保存：a.睪丸細胞懸液；b.睪丸組織塊凍存。細胞懸浮液制備需要機械或酶促消化組織，存在影響細胞活性的風險。此外，睪丸組織本身的功能結(jié)構(gòu)有明顯的細胞間依賴關(guān)系，細胞與細胞間相互作用的缺失也可能對細胞增殖和分化造成危害。為了保持精原干細胞的成熟能力，青春期前睪丸組織中的所有不同生殖細胞需要一起保存［10］。因此，睪丸組織塊的保存被認為是一種良好的替代方法，保存組織中完整的生精小管可維持細胞間相互作用以保留精原干細胞存活所必需的生理環(huán)境。

目前，常用的塊狀睪丸組織低溫保存技術(shù)是慢速冷凍保存。Milazzo等［11］對未成熟小鼠睪丸組織冷凍保存方案進行了優(yōu)化，得出睪丸組織的慢速冷凍程序：4℃停留30 min以加載低溫保護劑，2℃/min降至-9℃，停留8 min，0.3℃/min降至-40℃，25℃/min降至-150℃，后投入液氮。解凍后顯示了代表細胞增殖能力的抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體約80%呈陽性表達，與對照組（91%）仍有一些差距。Unni等［12］運用類似程序?qū)θ瞬G丸組織凍存后培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示了約50%的活性，遠低于對照組（70%）。Kvist等［13］、Keros等［14-15］、Travers等［16］、Shinohara等［17］均運用相似程序?qū)θ嘶騽游锬Ｐ筒G丸組織進行了慢速冷凍保存。雖然睪丸組織的慢速冷凍取得了一定的成果，但是根據(jù)慢速冷凍的原理，上述睪丸組織冷凍程序存在兩個問題：一是常用慢速冷凍程序所用加載保護劑時間為30 min，即使所需保護劑濃度較低，長時間浸泡仍會對組織造成不可逆的毒性損傷；二是降溫的第一、二階段的降溫速率較慢，保護劑加載完成后經(jīng)過近2 h才投入液氮，對組織造成較大的溶質(zhì)損傷及毒性損傷。

慢速冷凍過程中常用的低溫保護劑二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）具有一定的生物毒性［18］。苗俊英等［19］發(fā)現(xiàn)，DMSO會誘導BEL-7402細胞核DNA凝縮和核片段化，最后形成凋亡小體，且隨著DMSO濃度的增加和處理時間的延長，細胞存活率明顯下降，用2%的DMSO處理細胞12 h后凋亡率達17.21%。在臨床應(yīng)用中已有研究表明，DMSO未完全洗脫將引起血管內(nèi)溶血和血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高等副作用［20］，患者出現(xiàn)腎功能衰竭肺水腫、心臟驟停和支氣管痙攣等副作用［21］。因此，有必要研究在保證凍存效果的前提下減少滲透保護劑DMSO用量的方法。Huang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在溶液降溫至成核溫度之前進行置核操作，使溶液中形成局部冰晶以提高胞外滲透壓，在滲透壓差作用下細胞緩慢脫水，以減少胞內(nèi)冰的形成，可達到替代滲透性保護劑的作用。另外，置核可釋放大量自由能，抑制升溫期間再結(jié)晶現(xiàn)象以提高凍后效果。在慢速冷凍過程中，若冰晶以極快的速率在胞外形成，胞內(nèi)水來不及脫出，將對細胞造成冰晶損傷，凍結(jié)過程的早期增加置核程序可通過在相對較高的零下溫度下人為形成晶核，可以降低過冷的破壞作用［23-24］。目前，還未有研究者探究通過置核降低睪丸組織凍存所需滲透保護劑DMSO濃度，以及不同置核溫度下形成冰晶對睪丸組織凍存效果的影響機理。

針對以上問題，本文首先提出改進兩步法冷凍，縮短了保護劑的加載時間，將第一步的降溫速率提升至1℃/min降至-40℃后直接投入液氮。比較常用慢速冷凍程序與改進兩步法冷凍對睪丸組織的保存效果。其次，在-6℃、-8℃、-10℃下對睪丸組織進行置核，并運用低溫顯微鏡分析置核過程中冰晶形成和生長情況，結(jié)合睪丸組織的凍后效果篩選最佳置核溫度。本研究對小鼠塊狀睪丸組織的慢速冷凍保存方法進行了優(yōu)化，旨在提高其凍后質(zhì)量，為臨床上人睪丸組織的凍存提供參考。

1 材料與方法

1.1 保護劑溶液配制

按照體積百分比濃度配置以下溶液。睪丸組織基礎(chǔ)液（BS）：含20%FBS的DF12（DMEM/F-12）培養(yǎng)液。低溫保護劑1：5% DMSO+10% FBS+0.1 mol/L蔗 糖+DF12。低 溫 保 護 劑2：10%DMSO+10%FBS+0.1 mol/L蔗糖+DF12。低溫保護劑3：15%DMSO+10%FBS+0.1 mol/L蔗糖+DF12。

1.2 小鼠睪丸組織采集

選取5~8周齡的雄性小鼠，將其安樂死后快速置于手術(shù)臺上，用酒精棉輕輕擦拭腹部，用消毒后的無菌剪刀剪開小鼠下腹部，找到睪丸后剪去附睪連接組織以取出睪丸，置于室溫下（約24~26℃）的睪丸組織基礎(chǔ)液中，用鑷子與剪刀夾住睪丸表面白膜輕輕撕開，獲得睪丸內(nèi)部組織，備用。

1.3 保護劑加載對睪丸組織的毒性損傷

分別將半個小鼠睪丸組織浸泡于5%、10%、15%DMSO保護劑溶液，30 min后取出，放入培養(yǎng)液中10 min去除保護劑，并用培養(yǎng)液洗滌3次。對照組則在培養(yǎng)液中浸泡40 min。接著立即用DCFH-DA（2',7-dichlorofluorescein diacetate，Sigma-Aldrich，UK）染色30 min后在熒光顯微鏡下觀察。DCFH-DA自身沒有熒光，其穿過細胞膜后，在胞內(nèi)水解生成DCFH，DCFH被胞內(nèi)活性氧氧化為有熒光的二氯熒光素（dichlorofluorescein，DCF），置于熒光顯微鏡下觀察，使用488 nm激發(fā)波長，515~565 nm發(fā)射波長拍攝熒光照片。通過Image J軟件記錄DCF的熒光信號強度來檢測胞內(nèi)活性氧水平，結(jié)果用平均熒光值表示。

1.4 睪丸組織慢速冷凍程序

在3支1.8 ml凍存管中分別裝入1 ml低溫保護劑1、2、3，每組取半顆小鼠睪丸，放入3支凍存管中，將小鼠睪丸組織分別以常用慢速和改進兩步法在程序降溫儀（CryoMed Freezer 7453，Thermo Fisher Scientific，USA）中進行冷凍。常用慢速冷凍程序為：a.4℃停留30 min以加載低溫保護劑；b.2℃/min降至-9℃，停留8 min；c.0.3℃/min降至-40℃；d.25℃/min降至-150℃；e.快速取出投入液氮保存1 h。改進兩步法冷凍程序為：a.4℃停留10 min以加載低溫保護劑；b.1℃/min降至-40℃，停留1 min；c.快速取出投入液氮。兩種冷凍方法的降溫程序如圖1所示。

復溫時從液氮中快速取出凍存管，置于37℃恒溫水浴鍋復溫，至冰晶融化。后將冷凍管中的組織塊取出，放入1 ml的培養(yǎng)液中10 min去除保護劑，并用培養(yǎng)液洗滌3次。將組織放入裝有1 ml培養(yǎng)液的孔板內(nèi)，放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。

1.5 睪丸組織的置核冷凍程序

3個1.8 ml凍存管中均裝入1 ml低溫保護劑1，分別放入半個睪丸組織，于4℃冰箱內(nèi)放置10 min進行保護劑加載。將程序降溫儀預先降至4℃，將完成保護劑加載的3只凍存管放入程序降溫儀，分別以1℃/min的降溫速率降至-6℃、-8℃、-10℃，達到設(shè)定溫度后，用液氮預冷的不銹鋼鑷子觸碰液面置核，繼續(xù)放入程序降溫儀保持10 min，然后將凍存管直接投入液氮。復溫步驟與慢速冷凍組相同。

1.6 冰晶的低溫顯微觀察

運用低溫顯微鏡（BX51，Olympus，日本）觀察置核實驗中的冰晶形態(tài)及生長，每組實驗取5μl低溫保護劑滴加于載物坩鍋內(nèi)，蓋1.6 cm直徑玻璃蓋玻片。將3組樣品分別以1℃/min的降溫速率冷卻至-6℃、-8℃、-10℃，用液氮預冷的不銹鋼鑷子觸碰坩鍋外圍置核，觀察形成冰晶生長速率及形態(tài)。在置核溫度保持10 min后觀察冰晶形態(tài)。

1.7 睪丸組織的凍存效果評價

睪丸組織形態(tài)，以及生精小管內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性主要通過HE染色評價。半定量評估切片組織的管腔完整性，正常結(jié)構(gòu)評分為1，管腔受到損傷結(jié)構(gòu)評分為0。當觀察到以下結(jié)構(gòu)變化時結(jié)構(gòu)評分為0：a.精原細胞從基底膜分離；b.基底膜破裂；c.小管內(nèi)出現(xiàn)體積較大的空泡；d.小管內(nèi)空泡面積超過單根小管截面積的40%。最終管腔完整率計算方法見公式（1），每組實驗重復3次，最終取平均值。

冷凍復溫后睪丸組織的凋亡水平采用Tunel試劑盒進行檢測。按照試劑盒的說明進行組織染色，染色后在熒光顯微鏡下觀察細胞著色情況（顯色后陽性凋亡細胞核為棕黃色，存活細胞核顯藍色）。在生精小管內(nèi)，根據(jù)細胞形態(tài)學方法（細胞形狀、核致密性和相對于基底膜的位置等）來確定各種細胞類型［25］。分別計算各類細胞總數(shù)及各類細胞凋亡數(shù)量，各生精細胞Tunel陰性率通過公式（2）計算，每組實驗重復5次，最后取平均值。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 19.0軟件中One way ANOVA、Duncan’s新復極差法進行分析，以P<0.05作為差異顯著評判標準。

2 結(jié)果與討論

2.1 保護劑加載的毒性損傷

毒性損傷不僅與保護劑接觸時間相關(guān)，還受保護劑濃度影響。對睪丸組織進行所用3種不同濃度保護劑的毒性試驗，分別在3組保護劑濃度中浸泡30 min后測量睪丸組織的活性氧水平，熒光強度如圖2。相對于對照組，在保護劑溶液中浸泡后組織內(nèi)活性氧水平顯著上升，且隨著保護劑濃度增高組織內(nèi)活性氧水平增高，15%DMSO浸泡后組織內(nèi)活性氧水平（9.27）顯著高于5%（3.30）及10%（4.34）組?；钚匝醯漠a(chǎn)生和去除的調(diào)節(jié)是通過細胞中的抗氧化劑機制進行的，一旦活性氧濃度超過細胞抗氧化劑保護機制的能力，就會導致無法修復的細胞損傷［26］。Unni等［12］以酶解后大鼠睪丸組織的平均細胞存活率為依據(jù)，對低溫保護劑的毒性進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在15 min的保護劑加載時間內(nèi)，細胞的存活率隨保護劑濃度的升高而下降，其結(jié)果與本文毒性實驗結(jié)果一致。經(jīng)15% DMSO浸泡30 min后活性氧水平顯著升高，說明高濃度保護劑浸泡會對睪丸組織帶來較大的不可逆毒性損傷，應(yīng)盡量減少睪丸組織在保護劑中的浸泡時間。

2.2 常用慢速冷凍與改進兩步法冷凍的凍存結(jié)果

運用5%、10%、15% DMSO保護劑對睪丸組織分別按照常用慢速冷凍與改進兩步法冷凍程序保存，凍后對睪丸組織進行HE染色觀察組織形態(tài)，另外進行Tunel染色觀察管腔內(nèi)生殖細胞的凋亡情況（圖3），管腔完整率及生精細胞凋亡陰性率統(tǒng)計結(jié)果見表1。

Table 1 Lumen integrity rate and negative rate of cell apoptosis in testicular tissue after freezing

在常用慢速冷凍降溫保存與改進兩步法冷凍降溫程序中，低濃度保護劑組的管腔完整率相對較高，結(jié)合圖2的活性氧熒光結(jié)果分析可知，高濃度保護劑將會對睪丸組織造成較大毒性損傷，可能是造成管腔完整率降低的原因。Tunel結(jié)果顯示，在常用慢速冷凍降溫保存與改進兩步法冷凍降溫程序中，當DMSO的濃度為5%時，組織內(nèi)細胞的凋亡率都較高，可能是低濃度保護劑阻冰作用的缺失使得細胞受到較大的冰晶損傷。當DMSO的濃度為10%時，兩種方法凍后組織內(nèi)生殖細胞的凋亡陰性率均顯著提高，改進兩步法帶來的對比更加突出。當DMSO濃度為15%時，細胞凋亡陰性率都有所降低，但仍高于5%DMSO組。對比睪丸組織改進兩步法冷凍及常用慢速冷凍法在5%、10%、15%DMSO保護劑溶液中的凍后效果，兩種方法的最優(yōu)保護劑濃度均為10% DMSO。這可能是因為10%DMSO組比5%DMSO組更能顯著降低結(jié)晶量；而10%DMSO帶來的毒性損傷與5%DMSO無顯著性差異，并顯著低于15% DMSO組。Pukazhenthi等［27］在室溫下將新生羊羔睪丸組織塊浸泡于20%DMSO一段時間后放入程序降溫盒轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱過夜，次日投入液氮，結(jié)果顯示了75%左右的凍后總細胞活力。本研究改進兩步法10%DMSO濃度時凍后細胞活力為精原細胞98.4%、精母細胞99.2%、精子細胞88.4%、支持細胞98.1%，證明了改進兩步法的有效性。

改進兩步法所得管腔完整率及細胞凋亡陰性率均高于常用慢速冷凍法，其原因可能包括以下幾個方面。a.改進兩步法所用加載時間為10 min，縮短了浸泡時間。毒性損傷受保護劑濃度及接觸時間共同影響［28］，縮短了組織與保護劑接觸時間可減小組織在加載過程中所受毒性損傷。b.將第一階段降溫速率提高至1℃/min，減小了降溫所需時間與細胞所受滲透損傷。Liu等［29］指出細胞所受滲透損傷不僅與滲透壓差相關(guān)，還受細胞體積變化經(jīng)歷時間相關(guān)。Abrishami等［30］將豬睪丸組織在22℃下于10%DMSO中浸泡10 min后，通過程序降溫儀接連使用1℃/min、0.3℃/min、0.5℃/min、10℃/min的降溫速率經(jīng)近3 h降至-90℃，隨后投入液氮，結(jié)果顯示了解凍后平均75%的細胞活力。而在相同的10%DMSO濃度下，本文的改進兩步法凍后細胞活力為精原細胞98.4%、精母細胞99.2%、精子細胞88.4%、支持細胞98.1%，這一研究結(jié)果進一步證實了滲透損傷的減少是本文改進兩步法提高存活率的關(guān)鍵。c.改進兩步法在第二階段直接扔入液氮，提高此階段的降溫速率，促進未凍溶液的非晶態(tài)固化從而減小冷凍中潛在的冰晶損傷。

2.3 置核對降低保護劑濃度的作用

采用低濃度保護劑（5%DMSO）對睪丸組織進行置核溫度分別為-6℃、-8℃、-10℃的凍存，分別在不同溫度置核后平衡10 min，然后直接扔入液氮保存。凍后睪丸組織的HE及Tunel染色結(jié)果見圖4，管腔完整率及生精細胞凋亡陰性率見表2。

Table 2 Lumen integrity rate and negative rate of germ cell apoptosis in testicular tissue after ice seeding

由HE染色結(jié)果可知，采用5%DMSO作為保護劑，置核溫度為-10℃時，部分管腔結(jié)構(gòu)受到損傷，且組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，因此凍后睪丸組織的管腔完整率（66.1%）低于-6℃及-8℃置核組。由Tunel染色可知，使用5%DMSO保護劑溶液進行-10℃置核操作后，各生殖細胞的凍后凋亡陰性率與改進兩步法的10%DMSO溶液未置核相比無顯著差異，說明置核操作可減小具有生物毒性的滲透保護劑的用量，并取得相似的保護效果。但本實驗未完全替代滲透性保護劑，置核替代滲透性保護劑時仍需部分滲透性保護劑以減小細胞在胞外冰晶生長過程中所受滲透應(yīng)激［22］，因此本研究中適當?shù)蜐舛鹊?%DMSO可緩解組織在滲透平衡失水時受到的滲透損傷以提高凍存效果。

在3個置核溫度下，置核后生精細胞的凋亡水平均顯著低于未置核組，說明置核操作也可顯著降低細胞凋亡，可能原因在于：經(jīng)置核操作后冰晶在組織外形成并生長提高了組織外滲透壓，細胞內(nèi)溶液濃度增大，置核后直接投入液氮，使高濃度胞外未凍溶液及達到滲透平衡的胞內(nèi)溶液在快速冷卻中形成部分玻璃化，抑制冰晶的生成以減小組織所受冰晶損傷。Huang等［22］通過熵和自由能的變化發(fā)現(xiàn)在零度以下的高溫下（-10℃～0℃）置核可以釋放巨大的自由能，避免這些自由能在冷卻期間儲存在樣品中，并在復溫期間釋放后觸發(fā)胞外重結(jié)晶和胞內(nèi)冰。因此置核可能避免了睪丸組織復溫過程中的重結(jié)晶現(xiàn)象，提高凍后效果。

分別在-6℃、-8℃、-10℃溫度下用預冷鑷子觸碰坩鍋邊緣置核并維持10 min，運用低溫顯微鏡觀察3種置核溫度所得冰晶形態(tài)（圖5）。由圖5可知，-6℃置核時，初始較鋒利的冰晶可能對組織造成較大機械損傷，-8℃置核初始冰晶未出現(xiàn)鋒利紋理，在-10℃置核，初始冰晶較前兩組更為致密，置核時組織在溶液形成冰晶的過程中受到的機械損傷最小。不同溫度置核后分別維持10 min觀察冰晶生長情況，在-6℃下置核10 min后冰晶聚集成較大冰晶并形成溝壑。-8℃置核10 min后，部分冰晶聚集成塊，形成體積較大冰晶，帶來少量溝壑。而在-10℃置核10 min后未觀察到冰晶明顯變化，冰晶依舊較為均勻致密，未觀察到明顯溝壑。這可能是由于過冷度較大則形成的晶核小而多，形成密集的小冰晶，過冷度較小則形成的晶核大而少，形成大冰晶［31］。同時，過冷度增大，溶液黏度增加，使質(zhì)點移動困難，難以從溶液擴散到晶核表面，不利于晶體的成核或長大［32］。冰晶再生長形成的溝壑可能對細胞造成擠壓應(yīng)力，對組織帶來機械損傷。綜合分析，-10℃置核可減小組織所受機械損傷。

本文的置核凍存方法區(qū)別于傳統(tǒng)的慢速冷凍和玻璃化方法，它消除了常規(guī)慢速冷凍的限制，可在指定溫度置核后直接放入液氮保存，通過提高降溫速率促進未凍溶液的非晶態(tài)固化，既不需要傳統(tǒng)用于慢速冷凍的專用冷凍容器（如程序降溫盒）［33］，也避免了傳統(tǒng)慢速冷凍所需的復雜繁瑣冷凍程序［17，34］。3個溫度置核后凋亡陰性率均高于未置核組，驗證了置核操作對冰晶重結(jié)晶的抑制效果。在5%DMSO保護劑溶液進行-10℃置核操作后的凍存效果與改進兩步法10%DMSO溶液未置核無顯著差異，說明了置核對降低保護劑濃度的效果。Lauterboeck等［35］分別用5% DMSO和10% DMSO作為保護劑，分別在-4℃、-10℃、-14℃對間充質(zhì)干細胞進行手動置核，以膜完整性和再培養(yǎng)率為依據(jù)篩選最佳保護劑濃度和置核溫度，也得到近似的結(jié)果。加載保護劑后將細胞從4℃以7.5℃/min冷卻到所需的成核溫度，置核后接著以7.5℃/min冷卻至-30℃，然后以3℃/min冷卻至-80℃，而后轉(zhuǎn)至-150℃電冰箱儲存。結(jié)果顯示，濃度為5%的DMSO在-10℃置核時是最有益于間充質(zhì)干細胞低溫保存的。其中，5%DMSO在-10℃置核時間充質(zhì)干細胞的膜完整性和再培養(yǎng)率都顯著高于10%DMSO在-10℃置核組。

值得注意的是，組織凍存不同于細胞凍存，一般情況下組織中不同種類的細胞對應(yīng)著不同的最優(yōu)凍存程序。不過本研究兩組實驗選取的最優(yōu)組中，不同種細胞（精原細胞、精母細胞、精子細胞、支持細胞）的存活率均相對其他組較好，不同種細胞間差異不顯著，說明4種細胞對低溫凍存的敏感性相近，因此對應(yīng)的最優(yōu)保存程序也近似。此外，睪丸組織自身的結(jié)構(gòu)也對不同種類的細胞得到近似的保存效果有幫助。睪丸組織主要由結(jié)締組織與許多生精小管組成，而每根生精小管由生精上皮與管腔構(gòu)成，精原細胞、精母細胞、精子細胞、支持細胞等有序分布在數(shù)十微米的生精上皮管壁上［36］，降溫與復溫時4種細胞溫度變化幾乎同步，不會出現(xiàn)熱應(yīng)力釋放導致的損傷。

3 結(jié) 論

冷凍保存睪丸組織用于后期移植是除精子凍存以外保存男性生育力的另一有效的選擇。本文通過縮短保護劑加載時間、提高第一階段的冷卻速率、第二階段直接投入液氮等方法對睪丸組織的常用慢速冷凍方法進行了優(yōu)化，并在不同溫度對睪丸組織進行置核，得到如下結(jié)論：

a.當使用10% DMSO對睪丸組織進行改進兩步法降溫凍存時，凍后組織內(nèi)生殖細胞的凋亡陰性率均較高，其中精原細胞100%、精母細胞100%、精子細胞88.4%、支持細胞100%，顯著高于常用慢速冷凍組，且與對照組均無顯著性差異。

b.相較于未置核組，低濃度保護劑5%DMSO組在-10℃置核時的凍存結(jié)果與較高濃度保護劑10% DMSO組無顯著性差異，生殖細胞的凋亡陰性率為精原細胞82.9%、精子細胞92.1%、精母細胞93.2%及支持細胞88.9%，證明了置核能夠降低所需保護劑的濃度。

本研究通過改進兩步法和置核提高了小鼠睪丸組織凍后的質(zhì)量，為臨床上人睪丸組織凍存時保護劑濃度和凍存工藝的確定提供參考。