SiO2NPs通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激激活Fas/FasL通路促進(jìn)TM4細(xì)胞凋亡*

王旭瑩 郭志義1， 郝會(huì)宇 孫凡麗 張品正 孟芳宇陳紫云 李金澤 尚 璇**

（1）華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，唐山 063210；2）華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，唐山 063210；3）河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山 063210）

納米材料是指至少在一個(gè)維度測(cè)量不到100 nm，并表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)特征與生物、物理和化學(xué)相關(guān)的無機(jī)材料。由于納米材料的尺寸接近電子的相干長(zhǎng)度和光的波長(zhǎng)，使得納米材料表現(xiàn)出不同于其在宏觀尺寸或整體狀態(tài)時(shí)所展現(xiàn)的物理化學(xué)性質(zhì)，如導(dǎo)電、光學(xué)和磁性等。納米材料獨(dú)特的性質(zhì)使其在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活等領(lǐng)域有著相當(dāng)大的應(yīng)用潛力［1］。納米硅（silica nanoparticles，SiNPs）作為全球生產(chǎn)最多、應(yīng)用最廣的納米材料之一，其優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)和高度可調(diào)的生物相容性使其被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)［2］、美妝護(hù)膚和醫(yī)療領(lǐng)域，如生物分析、醫(yī)學(xué)成像、生物標(biāo)記和藥物靶向輸送［3-5］。研究表明，SiNPs可以通過消化道、呼吸道、皮膚等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，并通過血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)潛在的敏感靶點(diǎn)。盡管每日暴露水平很低，但SiNPs在體內(nèi)的清除非常緩慢，長(zhǎng)期可導(dǎo)致在組織累積。而且，當(dāng)材料的粒徑達(dá)到納米級(jí)時(shí)，理論上可進(jìn)入機(jī)體并穿過體內(nèi)的生物屏障到達(dá)微米材料所不能到達(dá)的區(qū)域。因此，原本無毒或低毒的材料當(dāng)粒徑達(dá)到納米級(jí)時(shí)，毒性顯著增強(qiáng)［4］，產(chǎn)生一系列致病作用［6］。生殖系統(tǒng)擔(dān)負(fù)著將遺傳信息傳遞給后代的重要使命，對(duì)外源性有害物質(zhì)高度敏感。已有研究表明，納米二氧化硅在體內(nèi)暴露會(huì)影響雄性生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致精子質(zhì)量和數(shù)量下降［7］。然而，到目前為止，人們對(duì)納米材料在生殖系統(tǒng)的毒性作用機(jī)制尚不清楚。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一種高活性氧化自由基，包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、過氧化基（ROO-）和羥基自由基（OH-）等［8］。在生理?xiàng)l件下，活性氧是細(xì)胞正常代謝的產(chǎn)物，參與多種信號(hào)通路的調(diào)控［9］。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑清除系統(tǒng)被過量的ROS消耗，導(dǎo)致氧化與抗氧化失衡，此時(shí)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激［10］。研究表明，納米顆粒誘導(dǎo)的過量ROS可以引發(fā)DNA損傷、炎癥、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。ROS的快速生成能激活腫瘤壞死因子受體超家族成員Fas受體［11-14］。Fas受體與死亡配體FasL結(jié)合后發(fā)生三聚化，進(jìn)而被激活，使得Fas與其下游接頭蛋白FADD結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物作用于凋亡啟動(dòng)蛋白酶（Caspase-8），并進(jìn)一步激活凋亡執(zhí)行蛋白酶（Caspase-3，-6，-7），從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡過程的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［15］。據(jù)報(bào)道，約20%~88%的男性不育癥患者精液ROS水平顯著升高［16-18］。因此，納米材料對(duì)生殖系統(tǒng)的毒性作用被認(rèn)為可能與其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激相關(guān)。N-乙酰基-L半胱氨酸（NAC）是一種含有巰基（-SH）的還原性物質(zhì)，具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的藥理效應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于臨床呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等疾病的治療［19］。然而，NAC對(duì)納米材料引起的氧化應(yīng)激及生殖系統(tǒng)功能的影響尚不清楚。

據(jù)報(bào)道，SiO2NPs可以突破生殖屏障，分布在生精小管內(nèi)的支持細(xì)胞和精母細(xì)胞中［20］。小鼠睪丸支持細(xì)胞在靠近生精小管基底部形成緊密連接復(fù)合體（tight junctions，TJs），將生精上皮分為基底小室（basal compartment）和近腔小室（abluminal compartment），各級(jí)生精細(xì)胞按照分化程度不同從基底小室向近腔小室依次有序排列。由于生精上皮內(nèi)無毛細(xì)血管，近腔小室的各級(jí)生精細(xì)胞無法直接從血液獲取營養(yǎng)物質(zhì)，而是生活在支持細(xì)胞側(cè)面胞質(zhì)陷凹內(nèi)，通過細(xì)胞間縫隙從支持細(xì)胞中獲得激素和營養(yǎng)物質(zhì)［21-22］。因此，深入探究外界有害因素對(duì)睪丸支持細(xì)胞的影響，對(duì)于更好地理解環(huán)境因素對(duì)男性生育力危害十分必要。TM4細(xì)胞來源于小鼠睪丸支持細(xì)胞，對(duì)藥物非常敏感，可以間接反映環(huán)境毒物對(duì)精子發(fā)生的潛在毒性作用［23］。本研究以TM4細(xì)胞作為模型探討SiO2NPs對(duì)小鼠睪丸支持細(xì)胞的毒性作用及其分子機(jī)制，旨在從細(xì)胞和分子水平探討納米材料對(duì)雄性生育力的影響，從而為避免生殖毒性、擴(kuò)大納米材料應(yīng)用范圍提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

TM4專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽，CM-0456）；0.25%胰蛋白酶（Hyclone，J2000-48）；納米二氧化硅粉末（純度為99.5%，分子粒徑為5~20 nm，Sigma-Aldrich Chemical，637246）；抗氧化劑NAC（碧云天，ST1546）；CCK-8細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒（北京聚合美，MF128-1）；ROS檢測(cè)試劑盒（碧云天，S0033S）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成，A001-3）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成，A003-1）；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美侖，MA0220）；FasL抗體（WL02999）購自萬類生物；Fas抗體（AF5342）、Caspase-8抗 體 （AF6442）、Caspase-3抗 體（AF6311）、Bax抗 體（AF0120）、Bcl-2抗 體（AF6139）和β-Actin抗體（AF7018）均為Affinity公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（A0208）或山羊抗鼠IgG（A0216）均購自碧云天公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（北京莊盟，ZD310A）。

1.2 方法

1.2.1 納米二氧化硅電鏡分析

透射電鏡能夠清晰地觀察到納米二氧化硅的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而且直接簡(jiǎn)便地測(cè)量納米顆粒的大小。將購買的商品化納米二氧化硅溶于TM4專用培養(yǎng)基后使用超聲波清洗機(jī)（新芝，SB4200D）超聲，以使其分散均勻。在透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（JEOL，JEM-2800）下觀察納米二氧化硅的形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑大小。

1.2.2 納米二氧化硅的粒徑分布及Zeta電位測(cè)定

將購買的商品化納米二氧化硅用TM4專用培養(yǎng)基稀釋為100 ng/L納米二氧化硅懸液，使用超聲波清洗機(jī)超聲，以使其分散均勻。使用激光粒度儀/ZETA電位和納米粒度分析儀（Malvern，Mastersizer2000/Zetasizer Mano zs90）檢測(cè)納米顆粒的粒徑分布和Zeta電位。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4購于武漢普諾賽公司，常規(guī)培養(yǎng)于TM4細(xì)胞專用培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下。每2 d根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和密度進(jìn)行換液或傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將TM4細(xì)胞按密度為1×104個(gè)/孔接種于96孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基，依次以終濃度為0、1、10、100 ng/L SiO2NPs培養(yǎng)液加入96孔板的各孔內(nèi)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入含有CCK-8的培養(yǎng)基（10μl CCK-8和90μl培養(yǎng)基），培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，然后每孔吸出100μl培養(yǎng)液至新的96孔板內(nèi)，在酶標(biāo)儀上于490 nm處測(cè)定每孔的光密度值A(chǔ)490。通過下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=［（對(duì)照孔A490-實(shí)驗(yàn)孔A490）/（對(duì)照孔A490-空白孔A490）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

建筑組團(tuán)分區(qū)景觀及中心環(huán)路景觀： 各建筑組團(tuán)分區(qū)周邊，因地制宜，各具特色的分區(qū)置景，統(tǒng)一中有變化，變化中有統(tǒng)一。建筑組團(tuán)景觀與中心環(huán)路景觀結(jié)合形成園區(qū)特色景觀區(qū)。

1.2.5 活性氧測(cè)定

TM4細(xì)胞處理同上，在SiO2NPs處理24 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入含有終濃度10μmol/L的分子探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（6-carboxy-2',7'-dichlofluorescein diacetate，DCFH-DA），培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。棄掉培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基反復(fù)吹打并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中。用PBS清洗2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。1 000 r/min離心5 min，加入100μl PBS重懸細(xì)胞。在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)的條件下，使用熒光酶標(biāo)儀（BioTek Instruments SynergyTMMx，美國）進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光值表示。

1.2.6 MDA及SOD測(cè)定

TM4細(xì)胞處理同上，在SiO2NPs處理24 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS反復(fù)吹打并將細(xì)胞懸液收集到1.5 ml EP管中。每管內(nèi)加入200μl PBS重懸細(xì)胞，在冰上用電動(dòng)組織研磨器研磨3~5 min。細(xì)胞懸液在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管內(nèi)作為蛋白質(zhì)抽提液，蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測(cè)定。細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性測(cè)定按試劑盒說明書進(jìn)行。MDA含量測(cè)定主要步驟如下：取100μl待測(cè)樣本加入到含有100μl試劑一、1.5 ml試劑二應(yīng)用液和1.5 ml試劑三應(yīng)用液的15 ml離心管內(nèi)，95℃水浴40 min，取出流水沖洗冷卻，然后3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取200μl上清，在酶標(biāo)儀上于532 nm處測(cè)定每孔的光密度值A(chǔ)532。SOD活性測(cè)定主要步驟如下：取20μl待測(cè)樣本加入到含有20μl酶工作液和200μl底物應(yīng)用液的1.5 ml離心管內(nèi)，37℃溫度孵育20 min后，在酶標(biāo)儀上于455 nm處測(cè)定每孔的光密度值A(chǔ)455。通過下列公式計(jì)算SOD抑制率和活力：SOD抑制率=［（對(duì)照組A455-對(duì)照空白組A455）-（試驗(yàn)組A455-試驗(yàn)空白組A455）］/（對(duì)照組A455-對(duì)照空白組A455）×100%。SOD活力=SOD抑制率/50%×（反應(yīng)體系/稀釋倍數(shù)）/待測(cè)樣本蛋白質(zhì)濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.7 Annexin V/PI凋亡測(cè)定

TM4細(xì)胞處理同上，在SiO2NPs處理24 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管內(nèi)。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，加入含有5μl PI和5μl Annexin V-FITC的500μl染色緩沖液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育15 min。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，530 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，每組樣本共收集30 000個(gè)細(xì)胞。數(shù)據(jù)使用BD CELLQuest Pro軟件（美國BD公司）進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果分為4個(gè)部分：UL（左上），Annexin V陰性而PI陽性的細(xì)胞群，代表細(xì)胞碎片；UR（右上），Annexin V和PI雙陽性的細(xì)胞群，代表晚期凋亡細(xì)胞；LL（左下），Annexin V和PI雙陰性的細(xì)胞群，代表活細(xì)胞；LR（右下），Annexin V陽性而PI陰性的細(xì)胞群，代表早期凋亡細(xì)胞。

收集TM4細(xì)胞至1.5 ml離心管后，預(yù)冷PBS洗滌3遍，1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。加入200μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上用電動(dòng)組織研磨器研磨3~5 min后靜置30 min。細(xì)胞懸液在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下4℃離心20 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管內(nèi)作為蛋白質(zhì)抽提液。使用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。在等量蛋白中（20μg）加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液，100℃溫度下煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。變性后的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，10%分離膠）分離后，濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，在4℃條件下孵育一抗（1∶1 000）過夜。用PBST漂洗3次后，與山羊抗兔或抗鼠IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。用PBST漂洗3次，每次10 min。配置ECL化學(xué)發(fā)光試劑，混勻后滴在PVDF膜上，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiScope 6100 EXP）拍照。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)等方法分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SiO2NPs的分子表征

利用TEM觀察可見，納米二氧化硅單粒形態(tài)呈球形，分子粒徑約10 nm，但易聚集成團(tuán)（圖1a）。進(jìn)一步利用Zetasizer儀器分析了納米二氧化硅在細(xì)胞培養(yǎng)基中的分散性和Zeta電位，結(jié)果表明納米二氧化硅的粒徑分布包括10.04、50.07和439.6 nm（圖1b），Zeta電位平均值為-25.7 mV（表1），提示納米二氧化硅在細(xì)胞培養(yǎng)基中穩(wěn)定性較差，易發(fā)生聚集。

Table 1 Zeta potential(pH=7.0)of SiO2NPs in medium

2.2 SiO2NPs顯著抑制TM4細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖

光學(xué)顯微鏡下（40×）可見，對(duì)照組TM4細(xì)胞呈上皮樣貼壁狀況良好，形態(tài)呈梭形或多角形，細(xì)胞核明顯。而在SiO2NPs（1、10、100 mg/L）處理24 h后，TM4細(xì)胞數(shù)量下降，胞體變小、變圓，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)顯著減少，在100 mg/L組可見少量細(xì)胞碎片（圖2a）。為進(jìn)一步明確SiO2NPs對(duì)TM4細(xì)胞活性的影響，利用CCK-8法測(cè)定不同濃度SiO2NPs處理后TM4細(xì)胞的存活率。如圖2b所示，1、10和100 mg/L SiO2NPs處理對(duì)TM4細(xì)胞存活率的抑制作用與對(duì)照組相比均有顯著差異（P<0.05），分別下降至84.8%、88.5%和61.4%。結(jié)果表明，隨處理劑量的增加，SiO2NPs可明顯抑制TM4細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。

2.3 SiO2NPs誘導(dǎo)TM4細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激

為研究納米二氧化硅影響TM4細(xì)胞活性的作用機(jī)制，利用反映氧化應(yīng)激狀態(tài)的標(biāo)志分子（ROS、MDA和SOD）試劑盒檢測(cè)了SiO2NPs暴露24 h后TM4細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平。如圖3所示，隨著SiO2NPs處理劑量的增加，TM4細(xì)胞中ROS和MDA含量以及SOD活性顯著升高。這些結(jié)果表明，納米二氧化硅可以誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，使TM4細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激。

2.4 SiO2NPs激活TM4細(xì)胞內(nèi)Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路

過度氧化應(yīng)激可以引發(fā)細(xì)胞凋亡。利用Annexin V-FITC和PI對(duì)不同濃度SiO2NPs處 理 的TM4細(xì)胞進(jìn)行染色后，通過流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果表明，SiO2NPs可以顯著增加凋亡細(xì)胞的比例，表現(xiàn)為劑量依賴性（圖4a，b）。此外，利用Western blot檢測(cè)Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路相關(guān)分子在不同處理組TM4細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果顯示，SiO2NPs處理顯著上調(diào)Fas/FasL調(diào)控的促凋亡相關(guān)分子蛋白質(zhì)表達(dá)水平（Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3和Bax），并降低抗凋亡分子Bcl-2蛋白水平（圖4c，d）。

2.5 抗氧化劑NAC緩解SiO2NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平

為進(jìn)一步明確氧化應(yīng)激與SiO2NPs引起的細(xì)胞毒性的關(guān)系，利用抗氧化劑NAC與100 mg/L SiO2NPs聯(lián)合處理TM4細(xì)胞。結(jié)果表明，NAC可以有效抑制SiO2NPs引起的氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為ROS和MDA含量以及SOD活性的下降（圖5）。

2.6 抗氧化劑緩解SiO2NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡

光學(xué)顯微鏡下可見，抗氧化劑NAC和100 mg/L SiO2NPs聯(lián)合處理組與單一處理100 mg/L SiO2NPs組相比，細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)顯著增多，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)上皮樣結(jié)構(gòu)（圖6a）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NAC和SiO2NPs聯(lián)合處理可以顯著緩解SiO2NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖6b，c）。

3 討 論

睪丸支持細(xì)胞參與精子發(fā)生過程的啟動(dòng)和維持，支持細(xì)胞的異常變化與精子發(fā)生障礙和男性不育密切相關(guān)［22，24］。基于實(shí)施難度和倫理道德等多方面綜合考慮，在過去的幾十年中，毒理學(xué)的研究重點(diǎn)已經(jīng)逐漸從基于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)變?yōu)轶w外研究。在諸多研究環(huán)境因素與男性生育力關(guān)系的模型中，TM4細(xì)胞系是應(yīng)用最為廣泛的體外模型。TM4細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)持續(xù)表達(dá)睪丸支持細(xì)胞特有的一些標(biāo)志分子，例如分泌轉(zhuǎn)鐵蛋白和纖溶酶原激活物，同時(shí)表達(dá)雄激素和雌激素受體，對(duì)卵泡刺激素也有一定反應(yīng)［25］。因此，本研究以TM4細(xì)胞為模型，研究納米材料對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用及其機(jī)制。

在本研究中，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示TM4細(xì)胞存活率隨SiO2NPs濃度增高而逐漸下降，表明SiO2NPs對(duì)TM4細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖有顯著抑制作用。顯微鏡視野下處理組TM4細(xì)胞數(shù)量下降，形態(tài)皺縮以及細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的減少進(jìn)一步證實(shí)SiO2NPs可以引起TM4細(xì)胞損傷。已有研究表明，由于活性表面存在抗氧化劑功能基團(tuán)，納米材料可以直接誘導(dǎo)ROS和自由基的產(chǎn)生，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。為明確TM4引起細(xì)胞損傷的機(jī)制，本文檢測(cè)了ROS、SOD和MDA等直接或間接反映細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的分子指標(biāo)。ROS是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱，生理?xiàng)l件下主要來自于線粒體呼吸過程中生物氧化的副產(chǎn)物。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和抗氧化酶類（GSH-PX，SOD）可清除ROS，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。當(dāng)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)失衡時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激［26］。MDA是ROS攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA），引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。檢測(cè)MDA的含量可以反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接地反映細(xì)胞損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，SiO2NPs可以顯著增加TM4細(xì)胞中ROS和MDA的含量以及抗氧化酶SOD的活性。結(jié)果提示，納米二氧化硅可能通過破壞ROS和抗氧化防御系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡而誘導(dǎo)小鼠TM4細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。

持續(xù)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷，當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重到無法修復(fù)時(shí)會(huì)可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡或衰老等信號(hào)通路［27］。據(jù)報(bào)道，納米材料可以通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在冠心病細(xì)胞中，SiNPs通過調(diào)控miR-22小分子RNA的表達(dá)激活Wnt-1信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［28］。在肺泡巨噬細(xì)胞中，SiNPs通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，SiO2NPs可以顯著增加TM4細(xì)胞凋亡率并激活Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路［30-31］。多項(xiàng)研究表明，納米材料的細(xì)胞毒性作用可能與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。為進(jìn)一步闡明納米材料在TM4細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的分子機(jī)制，使用抗氧化劑NAC對(duì)SiO2NPs處理細(xì)胞進(jìn)行了挽救治療。NAC是一種抗氧化劑和自由基清除劑，被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的治療，然而其對(duì)生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用目前尚未有報(bào)道。在本研究中，將NAC和SiO2NPs聯(lián)合處理后可以顯著緩解SiO2NPs造成的細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，SiO2NPs通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激激活Fas/FasL信號(hào)通路促進(jìn)TM4細(xì)胞凋亡，而該過程可以被抗氧化劑NAC阻斷（圖7）。

4 結(jié) 論

綜上所述，本文以TM4細(xì)胞為模型，研究了納米二氧化硅對(duì)小鼠睪丸支持細(xì)胞的毒性作用及分子機(jī)制，并利用NAC挽救模型對(duì)該機(jī)制進(jìn)行了驗(yàn)證。這些發(fā)現(xiàn)為納米材料在生物體內(nèi)的生殖毒性作用分子機(jī)制提供了新的證據(jù)，加深了我們對(duì)納米材料在生物醫(yī)藥和其他等領(lǐng)域安全應(yīng)用的理解。