基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機制

詹潔瑩，李國全，滕希峰,4，李芷瑤，張軼君，何琳,2*

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東中山 528458；3.廣州市慈善服務(wù)中心（廣州市慈善醫(yī)院），廣東廣州 510030；4.國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東廣州 510006）

鹽酸雷洛昔芬（Raloxifene Hydrochloride，RLX）是第一個被美國FDA 批準(zhǔn)用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的第二代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（Selective Estrogen Receptor Modulators，SERMs）[1]。它對骨組織的雌激素受體表現(xiàn)為促進作用，而對乳腺及子宮的雌激素受體表現(xiàn)為抑制作用[2]，能發(fā)揮類似雌激素減少骨量流失作用，且對乳腺及子宮內(nèi)膜無副作用，不會引起乳腺癌及子宮癌的發(fā)生，可作為預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物。目前認(rèn)為鹽酸雷洛昔芬主要通過與親和力高的雌激素受體結(jié)合以及基因表達的調(diào)節(jié)兩方面發(fā)揮作用，其作用機制還有待進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種與系統(tǒng)生物學(xué)、計算機科學(xué)、藥理學(xué)及生物信息學(xué)等結(jié)合的新興學(xué)科，基于“疾病-基因-靶點-藥物”的共同網(wǎng)絡(luò)，可推測藥物與疾病的關(guān)系，節(jié)省藥物研發(fā)時間及費用[3]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，將藥物（鹽酸雷洛昔芬）的靶點與疾?。ń^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥）的靶點進行交集靶點的匹配，采用生物信息學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建“鹽酸雷洛昔芬-絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥-靶點”網(wǎng)絡(luò)及可視化的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度展開科學(xué)闡述，為探究作用機制及新藥研發(fā)思路提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 鹽酸雷洛昔芬、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的靶點挖掘

搜索GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），以“Raloxifene Hydrochloride”“postmenopausal osteoporosis”作為關(guān)鍵詞分別檢索相關(guān)靶點,并將檢索后的結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化處理及統(tǒng)計分析，篩選得到Relevance score ≥1 的藥物及疾病的靶點。

1.2 交集靶點的獲取

將1.1 項下得到藥物靶點及疾病靶點，通過軟件Venny 2.1 得到交集靶點，并繪制韋恩圖。

1.3 可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.2 項下的結(jié)果輸入String 11.0 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org），蛋白種類設(shè)置為人類，最低交互要求分?jǐn)?shù)參數(shù)設(shè)置為高可行度（0.900），隱藏網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中斷開連接的節(jié)點，其余參數(shù)均選擇默認(rèn)設(shè)置，導(dǎo)出PPI 的數(shù)據(jù)文件，構(gòu)建蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)。下載TSV 格式的蛋白互作關(guān)系文件導(dǎo)入可視化Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建PPI，并篩選核心靶點和關(guān)鍵靶點。

1.4 Hub 基因挖掘

通過Cytoscape 3.9.1 軟件中Cytohubba 插件的MCC 算法，計算篩選得到排名前10 位的Hub 基因。

1.5 靶點的GO 分析及KEGG pathway 分析

將1.4 項下的結(jié)果輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），通過基因本體（Gene Ontology，GO）分析及KEGG pathway 信號通路分析，得到目標(biāo)基因在細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）和生物過程（Biological Process，BP）3 個層面上的定位以及主要參與的信號通路。以P＜0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05作為篩選條件，篩選具有顯著差異的結(jié)果。通過氣泡圖的形式，以Rich Factor 為X 軸，以GO term 名稱為Y 軸，將富集結(jié)果的P值以顏色表示，基因數(shù)（Count）用氣泡大小表示，其中顏色由淺變深代表P值逐漸減小，富集的程度越顯著；氣泡由小到大代表富集到該條目的基因數(shù)逐漸增加。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點預(yù)測

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫獲得鹽酸雷洛昔芬的靶點310 個，獲得絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的靶點1 198 個，經(jīng)過Relevance score ≥1 篩選后，得到鹽酸雷洛昔芬靶點268 個，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點944 個。采用Venny 2.1軟件繪制韋恩圖，篩選出168 個共有靶點，即鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點有168 個，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 鹽酸雷洛昔芬與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點韋恩圖

2.2 藥物-疾病共同靶點相互作用分析

通過String 11.0 數(shù)據(jù)庫繪制PPI，收集到149 條交集靶點的相互作用關(guān)系，該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系包括149 個節(jié)點和1 224 條邊，說明靶點之間存在緊密的聯(lián)系。將上述靶點信息用TSV 格式導(dǎo)入可視化Cytoscape 3.9.1軟件中，構(gòu)建藥物-疾病共同靶點相互作用關(guān)系圖，見圖2。節(jié)點代表靶點蛋白，邊代表各靶點蛋白之間的相互關(guān)系，節(jié)點連接邊數(shù)越多則代表其在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，節(jié)點的大小及顏色的深淺則與該靶點蛋白的中心度（Degree Centrality，DC）呈正相關(guān)。

圖2 鹽酸雷洛昔芬與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥共同靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 Hub 基因挖掘結(jié)果

通過可視化軟件Cytoscape 3.9.1 中Cytohubba 插件的MCC 算法計算得到排名前10 的Hub 基因分別為信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、肉瘤基因（SRC）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、雌激素受體1（ESR1）、JUN 原癌基因（JUN）、磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）、FOS 原癌基因（FOS）、SP1 轉(zhuǎn)錄因子（SP1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）和MYC 原癌基因（MYC），即鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵基因，以上靶點相互作用關(guān)系如圖3 所示。其中顏色深淺與MCC 算法結(jié)果呈正相關(guān)，節(jié)點大小則與度中心性呈正相關(guān)。

圖3 排名前10 的Hub 基因相互作用關(guān)系圖

2.4 靶點的GO 分析及KEGG pathway 分析結(jié)果

將2.1 項下預(yù)測得到的168 個共同靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行GO 分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05和FDR＜0.05作為篩選條件，得到結(jié)果如下。GO 分析收集到541 個條目，其中BP 有428 個條目、CC 有38 個條目、MF 有75 個條目；KEGG 通路分析得到146 條通路。利用R 語言通過R studio 軟件對以上各項P值排名前10 的條目進行可視化，即圖中氣泡越大、顏色越深，則富集的基因數(shù)目越多，富集越顯著，見圖4、圖5。

圖4 鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的靶點的GO 分析

圖5 KEGG 通路富集分析

在BP 中，涉及藥物的反應(yīng)、基因表達的正調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控、脂多糖反應(yīng)等；在CC 中，鹽酸雷洛昔芬與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的共同靶點大多存在于細胞外間隙以及胞膜外區(qū)；在MF 中，主要涉及類固醇的結(jié)合、酶的結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、相同蛋白質(zhì)的結(jié)合等，這些信息都提示了鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能通過多靶點多種生物學(xué)功能整體調(diào)節(jié)。KEGG 富集分析表明信號通路與癌癥、內(nèi)分泌抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt 等相關(guān)，這些信號通路可能是鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，非受體酪氨酸激酶（SRC）的c-Src蛋白是破骨細胞活化所必需的物質(zhì)，且可對成骨細胞活化進行負(fù)調(diào)控，其高度活化或過量表達可促進骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。目前，將c-Src 蛋白抑制劑應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松癥還處于臨床實驗和動物實驗階段，有望成為新的研究趨勢[4]。此外，異常激活的SRC 蛋白與許多腫瘤相關(guān)，并且其活性的高低與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，具體機制包括促進癌細胞增殖、對癌細胞激動蛋白骨架的重組、引發(fā)生長機制侵襲轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)血管形成等[5]。

絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）與絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAP）家族的成員。雌激素通過激活靶向軟骨細胞內(nèi)雌激素受體，改變相關(guān)酶活性如MAPK，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。ERK 信號作為絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）家族成員中的一員，在參與調(diào)控細胞的凋亡與增殖過程中發(fā)揮重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)MAPK 信號通路既可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化和增殖、阻斷破骨細胞的生成，還可提高與成骨相關(guān)的因子如堿性磷酸酶（ALP）、Runx2、Ⅰ型膠原蛋白等表達從而治療骨質(zhì)疏松癥[7]。

雌激素受體1（ESR1）是由雌激素介導(dǎo)、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑發(fā)揮生物學(xué)作用的核內(nèi)生物大分子，具有雌激素結(jié)合域。雌激素受體分布在人的成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞中。雌激素具有提高骨密度、防止絕經(jīng)后骨丟失的作用。通常雌激素受體結(jié)合雌激素后，可抑制破骨細胞的溶酶體活性，降低破骨細胞在骨表面產(chǎn)生陷窩的能力。有研究報道，軟骨細胞中的雌二醇（E2）靶向激活ESR1 后，可抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK2）的磷酸化，通過增加自身自噬通量，減少軟骨細胞的凋亡[6,8-9]。

原癌基因JUN 具有轉(zhuǎn)錄水平快、快速激活的特點?？梢酝ㄟ^與自身JUN 蛋白形成同源二聚體或與Fos 蛋白形成二聚體AP-1，起到轉(zhuǎn)錄因子的作用。該轉(zhuǎn)錄因子與靶基因上調(diào)節(jié)區(qū)AP-1 位點結(jié)合后作用于成骨細胞中，調(diào)控成骨細胞相關(guān)基因的表達，影響著成骨細胞的分化、成熟及功能[10]。JUN 屬于AP-1 轉(zhuǎn)錄因子家族，是Jak/Stat 信號通路上的基因，具有促進成骨細胞增殖、分化的作用，可以補償骨缺損部位的骨量并促進其骨鈣化組織形成，加速骨折愈合[11]。

磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3R1）與胰島素的代謝有關(guān)，在本研究中可猜測PIK3R1 與內(nèi)分泌抵抗通路相關(guān)，通過激活內(nèi)分泌抵抗通路調(diào)控骨代謝。

PI3K/Akt 信號通路在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮著重要作用，既參與調(diào)控成骨細胞的增殖、分化，又是RANKL 誘導(dǎo)破骨細胞生成的重要通路。RANKL/RANK 復(fù)合物可導(dǎo)致破骨細胞PI3K 激活和Akt 磷酸化，進一步上調(diào)破骨細胞相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子c-Fos，介導(dǎo)破骨細胞分化和成熟，Akt1 在成骨細胞和破骨細胞分化中發(fā)揮著重要作用，Akt1 敲低會升高Runx2 水平，促進成骨細胞分化，還能降低破骨細胞特異性mRNA 表達、抑制破骨細胞分化[12]。

KEGG 通路分析鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥與AGE-RAGE 信號通路相關(guān)，但是沒有找到直接證據(jù)推測AGE/RAGE 信號通路是否具有增加成骨的功能。文獻報道脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路可誘導(dǎo)炎癥細胞因子、TNF-α 和IL-1 的產(chǎn)生及增加，衰老誘發(fā)氧化應(yīng)激，更年期因為性激素減少導(dǎo)致了RANKL 激活劑增加，引起骨質(zhì)疏松和血管鈣化，導(dǎo)致鈣從骨骼轉(zhuǎn)移到血管壁[6]。

4 結(jié)論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段預(yù)測了鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用靶點以及可能參與的信號通路，篩選出藥物與疾病有168 個共同靶點；關(guān)鍵靶點涉及STAT3、SRC、MAPK1、ESR1、JUN、PIK3R1、FOS、SP1、MAPK14 和MYC 等。鹽酸雷洛昔芬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能是通過調(diào)節(jié)STAT3、SRC、MAPK1、ESR1 和JUN 等關(guān)鍵基因，這些結(jié)果為下一步實驗研究提供了理論參考，后續(xù)會采用模型動物、細胞等藥理學(xué)媒介在體內(nèi)外進一步探討其作用機制。