RNA 結(jié)合蛋白LIN28 對糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制研究

王艷麗,李 雁,葉 芳,孫 燕,侯俊霞,程潔萍,艾比班,李金峰,張新菊

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830002）

糖尿病的特征是胰島素分泌缺陷、胰島素作用缺陷或兩者兼有導(dǎo)致的慢性高血糖癥[1-2]。全球范圍內(nèi)每年約有160 萬人死于糖尿病，有超過4.22 億人患有2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）[3-5]。T2DM的不利健康風(fēng)險因素包括腦卒中、心臟病、聽力損失、失明、高血壓、腎病和神經(jīng)損傷[4-5]。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是慢性腎病的主要原因，高血糖與慢性腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。

RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）對基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控至關(guān)重要[9]。RNA 必須與不同的RBPs 相結(jié)合才能夠完成RNA 的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，最終完成蛋白質(zhì)的表達(dá)[9]。LIN28 是一種RBP，其主要功能是通過改變microRNA（miRNA）let7 的表達(dá)從而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[10]。LIN28 通過多種途徑密切參與胰島素抵抗和T2DM[11-12]。本研究擬探討LIN28 在DN 發(fā)病進(jìn)程中的作用，以期為制定以LIN28為靶點的DN治療策略奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DNA 酶Ⅰ（批號：10553214）、D-核糖（批號：V37891235）購自美國Sigma-Aldrich 公司。pADVmCMV-EGFP-3xFLAG 購自上海和元生物有限公司。KCTM Stranded mRNA Library Prep Kit for Illumina（批號：203341256）購自美國ABclonal 公司。人晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）ELISA 測定試劑盒（批號：J-3154398730）購自上海江萊生物有限公司。兔抗人晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)單抗（批號：E352117109）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）單抗（批號：E3814238961）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 單抗（批號：E2811841146）及兔抗人GAPDH 多抗（批號：E5643526761）均購自美國Abcam 公司，工作濃度分別為1∶1 500、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000；山羊抗兔IgG(H+L) HRP 二抗（批號：7-G354623）購自杭州聯(lián)科生物有限公司，工作濃度為1∶10 000。RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析委托武漢生命之美科技有限公司代為完成。

測序儀（Novaseq 6000）購自美國Illumina 公司，全功能酶標(biāo)儀（Synergy H4）購自美國BioTek 公司，凝膠成像系統(tǒng)（SH-520）購自杭州申花有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎細(xì)胞HEK 293T培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL青霉素-鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃恒溫、濕潤的孵育箱中維持培養(yǎng)。

1.3 腺病毒感染

過表達(dá)LIN28：擴(kuò)增LIN28 的開放閱讀框（open reading frame，ORF），上游引物為5'-ATGACCGCCCG CGCCGGGGT-3'，下游引物為5'-CTACCCTCCCGCCC CATAA-3'；然后克隆至腺病毒載體pADV-mCMVEGFP-3xFLAG 中，制備Adv-LIN28-OE 腺病毒，或空載體對照組Adv-LIN28-NC腺病毒。

敲低LIN28：將shRNA LIN28 5'-TTAAGTATAAG ACCAGATTCA-3'，或shRNA NT 5'-AGTACGATACTA CGTGAGACG-3'克隆至腺病毒載體pADV-U6-shRNACMV-EGFP 中，制備Adv-shRNA LIN28腺病毒，或?qū)φ战MAdv-shRNA NT腺病毒。

然后經(jīng)腺病毒包裝，制備對應(yīng)的腺病毒顆粒并感染HEK 293T細(xì)胞。

1.4 實驗分組和細(xì)胞處理

RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒瀸EK 293T 細(xì)胞分為Adv-LIN28-NC 組（腺病毒過表達(dá)對照）和Adv-LIN28-OE組（腺病毒LIN28過表達(dá)）。

生化指標(biāo)測定實驗分組為Control組（HEK 293T細(xì)胞+10 μL PBS），Treatment組（HEK 293T細(xì)胞+20 mmol/L D-核糖溶解于10 μL PBS），Adv-LIN28-OE+D-核糖組（腺病毒LIN28 過表達(dá)+20 mmol/L D-核糖溶解于10 μL PBS），Adv-LIN28-NC+D-核糖組（腺病毒過表達(dá)+20 mmol/L D-核糖溶解于10 μL PBS），Adv-shRNA LIN28+D-核糖組（Adv-shRNA LIN28腺病毒+20 mmol/L D-核糖溶解于10 μL PBS），Adv-shRNA NT+D-核糖組（Adv-shRNA NT 腺病毒+20 mmol/L D-核糖溶解于10 μL PBS）[13]。

1.5 RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序

使用TRIzol 裂解和提取緩沖液提取總RNA。然后向總RNA 中加入DNA 酶Ⅰ裂解殘存的DNA。取2 μg 總RNA，使用KCTM Stranded mRNA Library Prep Kit for Illumina 制備單鏈RNA 測序文庫。操作方法按照試劑盒中的說明書進(jìn)行。隨后富集200～500 bp 的PCR 產(chǎn)物。然后上機(jī)Novaseq 6000 測序儀，使用PE150模塊進(jìn)行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析RNA-Seq 測序原始數(shù)據(jù)的清潔和比對

使用FASTX-Toolkit（v0.0.13）工具包去除原始測序讀數(shù)中的接頭序列和低質(zhì)量堿基讀數(shù)。之后，設(shè)置允許4個堿基錯配的條件，通過HISAT2法將清潔的讀數(shù)比對至人GRCh38 基因組[14]。使用具有唯一映射的讀數(shù)用于基因讀數(shù)計數(shù)和FPKM計算[15]。

1.7 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分析

使用R Bioconductor 包DESeq2 法篩選DEGs[16]。校正P＜0.05，倍數(shù)變化＞2或＜0.5則識別為DEGs。

1.8 基因本體（gene ontology，GO）分析與京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析

使用KOBAS 2.0 服務(wù)器識別GO 術(shù)語和KEGG 通路。使用超幾何測試和Benjamini-Hochberg FDR 控制程序定義每個術(shù)語的富集程度。

1.9 AGEs測定

使用ELISA 測定試劑盒對細(xì)胞上清液中的AGEs進(jìn)行測定。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用全功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長為355 nm、發(fā)射波長為460 nm條件下測定吸光值。

1.1 0 Western blot

使用RIPA 裂解和提取緩沖液對HEK 293T 細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取總蛋白。使用10%脫脂奶粉對PVDF膜進(jìn)行封閉。然后向PVDF 膜上滴加一抗工作液，于4 ℃孵育過夜；次日向PVDF 膜上滴加二抗工作液，于室溫孵育1 h。使用ECL 超敏化學(xué)發(fā)光底物對目的條帶進(jìn)行顯影。使用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描并拍照。使用Image J（v 1.8.0）對圖像進(jìn)行灰度測定和分析。

1.1 1 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism v8軟件對計量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理和分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIN28 過表達(dá)處理導(dǎo)致數(shù)千種基因發(fā)生顯著性差異表達(dá)

Adv-LIN28-OE組顯著上調(diào)表達(dá)的基因共4 255個。對這4 255 個基因進(jìn)行GO 分析，顯著上調(diào)表達(dá)的基因主要富集到肌絲滑動、肌肉收縮、纖毛運(yùn)動等信號通路，見圖1a。KEGG 分析結(jié)果顯示，顯著上調(diào)表達(dá)的基因主要富集到p53 信號通路、突觸囊泡循環(huán)、Ⅰ型單純皰疹病毒感染等信號通路，見圖1b。Adv-LIN28-OE 組顯著下調(diào)表達(dá)的基因共3 437 個。對這3 437 個基因進(jìn)行GO 分析，顯著下調(diào)表達(dá)的基因主要富集到蛋白質(zhì)磷酸化、磷酸化反應(yīng)、細(xì)胞黏附等信號通路，見圖1c。KEGG 分析結(jié)果顯示，顯著下調(diào)表達(dá)的基因主要富集到癌癥信號通路、ECM-受體相互作用、軸突導(dǎo)向等信號通路，其中AGE-RAGE 信號通路為第6 位顯著下調(diào)的KEGG 通路，見圖1d。

圖1 對LIN28過表達(dá)的HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析的結(jié)果圖

2.2 過表達(dá)LIN28 能夠抑制HEK 293T 細(xì)胞產(chǎn)生AGEs并下調(diào)RAGE的表達(dá)

與Control組比較，Treatment組細(xì)胞上清液中AGEs的水平顯著升高（P＜0.05）；而與Treatment 組相比，Adv-LIN28-OE+D-核糖組細(xì)胞上清液中AGEs 的水平顯著降低（P＜0.05），Adv-LIN28-NC+D-核糖組則無顯著差異（P＞0.05），見圖2a。 與Control 組相比，Treatment 組細(xì)胞內(nèi)RAGE 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；而與Treatment 組相比，Adv-LIN28-OE+D-核糖組細(xì)胞內(nèi)RAGE 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Adv-LIN28-NC+D-核糖組則無顯著差異（P＞0.05），見圖2b。

圖2 過表達(dá)LIN28對HEK 293T細(xì)胞上清液AGEs水平和細(xì)胞內(nèi)RAGE表達(dá)水平的影響

2.3 過表達(dá)LIN28 能夠下調(diào)NF-κB 的活化和MMP-2的表達(dá)

與Control 組相比，Treatment 組細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MMP-2的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；而與Treatment組相比，Adv-LIN28-OE+D-核糖組細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MMP-2 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Adv-LIN28-NC+D-核糖組則無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 過表達(dá)LIN28對HEK 293T細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MMP-2表達(dá)水平的影響

2.4 敲低LIN28 能促進(jìn)HEK 293T 細(xì)胞產(chǎn)生AGEs 并上調(diào)RAGE的表達(dá)

與Control組相比，Treatment組細(xì)胞上清液中AGEs的水平顯著升高（P＜0.05）；而與Treatment 組相比，Adv-shRNA LIN28+D-核糖組細(xì)胞上清液中AGEs 的水平進(jìn)一步顯著升高（P＜0.05），Adv-shRNA NT+D-核糖組則無顯著差異（P＞0.05），見圖4a。與Control 組相比，Treatment 組細(xì)胞內(nèi)RAGE 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；而與Treatment 組相比，Adv-shRNA LIN28+D-核糖組細(xì)胞內(nèi)RAGE 的表達(dá)水平進(jìn)一步顯著升高（P＜0.05），Adv-shRNA NT+D-核糖組則無顯著差異（P＞0.05），見圖4b。

圖4 敲低LIN28對HEK 293T細(xì)胞上清液AGEs水平和細(xì)胞內(nèi)RAGE表達(dá)水平的影響

2.5 敲低LIN28 能夠促進(jìn)NF-κB 的活化和MMP-2 的表達(dá)

與Control 組相比，Treatment 組細(xì)胞內(nèi)NF-κB 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；而與Treatment 組相比，Adv-shRNA LIN28+D-核糖組細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MMR-2 的表達(dá)水平進(jìn)一步顯著升高（P＜0.05），Adv-shRNA NT+D-核糖組則無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 敲低LIN28對HEK 293T細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MMP-2表達(dá)水平的影響

3 討論

目前對LIN28的研究仍然主要集中在以秀麗隱桿線蟲為模型的胚胎發(fā)育領(lǐng)域[17-18]。少數(shù)研究顯示，LINC00355 通過LIN28a 增強(qiáng)鳥嘌呤核苷酸交換因子T（guanine nucleotide exchange factor T，GEFT）的表達(dá)[19]。GEFT 在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并與結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差密切相關(guān)[19]。另有體外實驗顯示，二甲雙胍通過抑制AMPKα/LIN28通路上調(diào)8-氧鳥嘌呤DNA 糖基化酶抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的氧化自由基水平[20]。本研究通過在人胚腎細(xì)胞HEK 293T 中過表達(dá)LIN28，并進(jìn)行RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析。經(jīng)KEGG 分析顯示，過表達(dá)LIN28后的HEK 293T細(xì)胞內(nèi)糖尿病-并發(fā)癥相關(guān)AGE-RAGE 信號通路被顯著抑制。這是一項重要的新發(fā)現(xiàn)，因為AGE-RAGE 信號通路在糖尿病及其各種并發(fā)癥中扮演著重要的角色。

基于上述結(jié)果，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證實驗：對高糖培養(yǎng)條件下的HEK 293T 細(xì)胞進(jìn)行了腺病毒LIN28 過表達(dá)或敲低處理。結(jié)果顯示，與Treatment 組相比，Adv-LIN28-OE+D-核糖組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AGEs的水平顯著降低，細(xì)胞內(nèi)RAGE 的表達(dá)水平顯著降低；Adv-shRNA LIN28+D-核糖組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AGEs的水平進(jìn)一步顯著升高，細(xì)胞內(nèi)RAGE 的表達(dá)水平也進(jìn)一步顯著升高，說明糖尿病-并發(fā)癥相關(guān)AGERAGE信號通路受控于LIN28。

慢性高血糖會引起DN，但其具體的致病機(jī)制仍未十分明確[21]。病理學(xué)上，高血糖相關(guān)的AGEs大量形成和其介導(dǎo)的RAGE 積累在DN 的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。AGE-RAGE 信號通路的上調(diào)會引發(fā)持續(xù)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，這是AGEs 在糖尿病患者腎和腸道微環(huán)境中產(chǎn)生的主要有害影響[22-24]。AGEs 介導(dǎo)的RAGE激活和積累可引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶誘導(dǎo)的活性氧和活性氮的產(chǎn)生，隨后在DN和衰老腎中引起氧化應(yīng)激[25]。AGEs 通過增加腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的通透性、改變內(nèi)皮糖萼以最終誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，顯著誘導(dǎo)腎小球濾過屏障的改變[26-27]。AGEs還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣化[28]。本研究結(jié)果顯示，在腎細(xì)胞中過表達(dá)LIN28能夠顯著抑制AGE-RAGE信號通路，提示這種過表達(dá)LIN28的策略或許能夠?qū)N起到保護(hù)作用。

我們進(jìn)一步對高糖培養(yǎng)條件下的HEK 293T 細(xì)胞進(jìn)行LIN28 過表達(dá)或敲低處理，并測定處理前后細(xì)胞內(nèi)NF-κB 和MMP-2 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與Treatment 組相比，Adv-LIN28-OE+D-核糖組細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MMP-2的表達(dá)均顯著降低，Adv-shRNA LIN28+D-核糖組細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MMP-2的表達(dá)均進(jìn)一步顯著升高，說明過表達(dá)/敲低LIN28將通過抑制/增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MMP-2的表達(dá)抑制/促進(jìn)DN疾病進(jìn)展。

NF-κB是DN疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵信號通路，可通過GSDMD 激活腎小管上皮細(xì)胞焦亡，加重DN[29]。炎癥和腎小球內(nèi)皮功能障礙會促進(jìn)DN 進(jìn)展。二甲雙胍可抑制TLR4/NF-κB p65 通路緩解DN 的炎癥和纖維化[30]。內(nèi)皮糖萼是腎小球濾過屏障的關(guān)鍵組成部分。MMP-2、MMP-9 和MMP-14 在孤立的腎小球中表達(dá)上調(diào)并介導(dǎo)多配體蛋白聚糖-4 脫落，是體外腎小球內(nèi)皮糖萼損傷的機(jī)制，將導(dǎo)致白蛋白通透性增加。有研究使用MMP-2/9 抑制劑治療1 型糖尿病小鼠21 d，恢復(fù)了內(nèi)皮糖萼的深度和細(xì)胞表面覆蓋率，減輕了糖尿病誘導(dǎo)的白蛋白尿和腎小球白蛋白通透性[31]。高血糖上調(diào)外泌體中環(huán)狀RNA circ_DLGAP4的水平，circ_DLGAP4通過海綿化miR-143 上調(diào)ERBB3/NF-κB/MMP-2 軸，促進(jìn)腎系膜細(xì)胞的增殖和纖維化[32]。因此，抑制NF-κB/MMP-2 軸對于緩解DN 的炎癥水平、減輕腎小管損傷、抑制腎纖維化至關(guān)重要。而本研究結(jié)果證明，通過腺病毒過表達(dá)LIN28 的治療策略，在體外細(xì)胞水平上能夠通過下調(diào)AGE-RAGE 信號通路發(fā)揮抑制NF-κB/MMP-2軸的作用。

綜上，通過體外腺病毒過表達(dá)LIN28，能夠?qū)е聰?shù)千種基因發(fā)生顯著性差異表達(dá)，特別是能夠抑制在DN 疾病進(jìn)展中十分關(guān)鍵的糖尿病-并發(fā)癥相關(guān)AGERAGE信號通路，發(fā)揮保護(hù)DN的作用。