“金花”菌的鑒定及接種發(fā)酵六堡茶的品質(zhì)變化

吳新惠，杜金杰，劉曉純，廖楷濱，覃玉娜，張瑜容，張靈枝，龍志榮，邱瑞瑾

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.梧州市茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，廣西 梧州 543000；3.梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543003）

六堡茶屬黑茶，是中國(guó)歷史名茶、國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，素以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱(chēng)，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、保護(hù)肝臟等保健功效[1-2]。微生物對(duì)六堡茶品質(zhì)形成具有重要影響。但目前，傳統(tǒng)六堡茶生產(chǎn)仍存在發(fā)酵菌種難以控制、渥堆發(fā)酵及陳化時(shí)間長(zhǎng)、品質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題。因此，亟須對(duì)傳統(tǒng)六堡茶發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，控制參與發(fā)酵的微生物種類(lèi)、穩(wěn)定六堡茶產(chǎn)品品質(zhì)，使六堡茶產(chǎn)品生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化。

“金花”菌多為曲霉屬（Aspergillus）、散囊菌屬（Eurotium）和青霉屬（Penicillium）[3]，能在茶葉表面產(chǎn)生金黃色閉囊殼，其質(zhì)量和數(shù)量是衡量茯磚茶品質(zhì)的重要指標(biāo)[4-5]。前人研究表明，六堡茶中存在多種“金花”菌[6-8]，能夠分泌淀粉酶和氧化酶，對(duì)六堡茶的香氣、滋味等物質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮一定作用。“金花”的數(shù)量是判定六堡茶品質(zhì)的依據(jù)之一，也是六堡茶特色保健功效的基礎(chǔ)[9]。六堡茶的“金花”在陳化過(guò)程中隨機(jī)發(fā)生，陳化環(huán)境中的溫、濕度條件對(duì)六堡茶發(fā)花影響很大，而六堡茶制作工藝中沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的發(fā)花工序。為提高“金花”數(shù)量，也有人對(duì)六堡茶的“發(fā)花”工藝進(jìn)行優(yōu)化[10]，但仍然難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)“金花”六堡茶。近幾年也有不少學(xué)者對(duì)六堡茶“金花”菌進(jìn)行相關(guān)研究。毛彥等[11]從廣西銀泰六堡茶廠(chǎng)中分離得到一株雪黃散囊菌（E.niveoglaucum）。徐書(shū)澤[12]利用高通量測(cè)序技術(shù)從梧州茶廠(chǎng)成品茶中分離到一株阿姆斯特丹散囊菌（E.amstelodami），歐惠算[8]在梧州中茶茶廠(chǎng)剛壓好的茶中也分離到阿姆斯特丹散囊菌，發(fā)現(xiàn)該菌在茶葉液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中能降低茶多酚、黃酮類(lèi)、氨基酸以及可溶性糖的含量，使茶褐素含量總體增加；陳然等[7]對(duì)多家梧州六堡茶龍頭企業(yè)生產(chǎn)的六堡茶的真菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌種為散囊菌屬，不同廠(chǎng)家真菌種類(lèi)各有差異，都檢測(cè)出不同含量的“金花”菌，主要是冠突散囊菌（E.cristatum）和謝瓦氏散囊菌（E.chevalieri）；蘇贊等[13]從廣西梧州六堡茶中分離到兩株謝瓦氏曲霉（A.chevalieri），能分泌一定量的果膠酶、纖維素酶和淀粉酶。在六堡茶渥堆過(guò)程中也有“金花”菌參與，黃紫衡等[14]從不同渥堆階段的六堡茶中分離到冠突曲霉（A.cristatus），這說(shuō)明六堡茶“金花”菌貫穿發(fā)酵過(guò)程，但對(duì)于渥堆過(guò)程“金花”菌的相關(guān)研究有限，“金花”菌的發(fā)酵機(jī)理在六堡茶中鮮有報(bào)道，利用“金花”菌固態(tài)發(fā)酵六堡毛茶的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究根據(jù)分離培養(yǎng)特征、光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)特征和內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列比對(duì)分析，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析等多種鑒定手段，對(duì)渥堆過(guò)程六堡茶中的“金花”菌進(jìn)行分離鑒定。將分離到的“金花”菌接種至滅菌六堡毛茶中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，研究不同“金花”菌對(duì)六堡茶滋味品質(zhì)的影響，探索不同“金花”菌之間的差異，篩選優(yōu)良菌株，以期為六堡茶“金花”菌的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵茶樣：蒼梧縣群體種六堡毛茶；“金花”菌：從廣西梧州中茶茶廠(chǎng)2020年9月渥堆茶樣中分離得到。

沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）、兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin，GC）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（catechin gallate，CG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和咖啡因 遠(yuǎn)野生物（上海）有限公司；真菌DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、查氏瓊脂（Czapek-Dox agar，CA）培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；本研究中使用的所有化學(xué)品和試劑均為分析試劑級(jí)；超純水由Milli-Q水凈化系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

HSG-GIIC-4電熱恒溫水浴鍋 上海儀表供銷(xiāo)公司；WFJ7200可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；PL303電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；TD-5Z低速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；GXZ-250A 恒溫光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠(chǎng)；ALANCE E295高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Waters公司；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美國(guó)旭日公司；NRB290JD-XN立式冰箱 松下家電（中國(guó)）有限公司；Milli-Q-B超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipoe公司；血球計(jì)數(shù)板上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離鑒定

參照文獻(xiàn)[5]的方法，真菌采用引物ITS1和ITS4進(jìn)行分析，測(cè)定序列。將得到的序列在NCBI上用BLAST軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，選擇相似性大于97%的序列作為菌種鑒定參考，用MEGA-X軟件構(gòu)建參考菌與鑒定菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2 菌懸液的制備

將4 株菌接種于PDA培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d。用無(wú)菌生理鹽水洗脫孢子，轉(zhuǎn)移至錐形瓶（帶滅菌玻璃珠）充分振蕩搖勻（1 h），采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)孢子濃度約為1×107CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 接種菌懸液

稱(chēng)取100 g六堡毛茶置于500 mL三角瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻備用。按照1×107CFU/mL的接種濃度接種菌懸液至滅菌毛茶培養(yǎng)，同時(shí)調(diào)整發(fā)酵含水量（渥堆潮水量）為25%，于28 ℃、相對(duì)濕度80%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵，期間每7 d搖瓶一次，使茶樣發(fā)酵均勻，28 d后取出用微波固樣后保存待用；以不接種只加無(wú)菌純水發(fā)酵的滅菌毛茶作為對(duì)照（CK）。每組樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)發(fā)酵。

1.3.4 主要化學(xué)成分的檢測(cè)

水浸出物總含量測(cè)定參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》[15]；游離氨基酸總含量測(cè)定參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》[16]；黃酮類(lèi)化合物總含量測(cè)定采用三氯化鋁比色法；可溶性糖總含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法；茶黃素、茶紅素、茶褐素總含量測(cè)定采用文獻(xiàn)[17]所述方法；咖啡堿總含量測(cè)定參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測(cè)定》[18]；茶多酚含量、兒茶素類(lèi)組分、GA含量測(cè)定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》[19]。

1.3.5 HPLC分析

樣品制備：稱(chēng)取0.2 g茶粉加入5 mL在70 ℃水浴鍋中預(yù)熱過(guò)的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液，浸提10 min后3 500 r/min離心10 min，收集上清液至10 mL定容瓶。茶渣重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液定容，搖勻，0.45 μm膜過(guò)濾后上機(jī)。

檢測(cè)條件：流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)90%甲醇（平衡柱子）；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)5%甲醇溶液；流動(dòng)相C：體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液；流動(dòng)相D：乙腈；流速1 mL/min；波長(zhǎng)280 nm；后運(yùn)行時(shí)間5 min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。洗脫條件：A：0～3 min、95%～90%，3～6 min、90%，6～8 min、90%～80%；C：0～30 min、93.5%～84.0%，30～34 min、84.0%～80.0%，34～39 min、80.0%～80.0%，39～40 min、80.0%～93.5%，40～45 min、93.5%～93.5%；D：0～30 min，6.5%～16.0%，30～34 min、16.0%～20%，34～39 min、20%～20%，39～40 min、20.0%～6.5%，40～45 min、6.5%～6.5%。

1.3.6 感官審評(píng)

按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》中的黑茶（散茶）的審評(píng)方法，感官審評(píng)小組由5 位具有專(zhuān)業(yè)茶葉審評(píng)資格的小組成員（2 男3 女）組成，用專(zhuān)業(yè)的茶葉審評(píng)術(shù)語(yǔ)得出審評(píng)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)定結(jié)果取3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 24進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 8進(jìn)行作圖，采用Origin 2021軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 株“金花”菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1 “金花”菌的形態(tài)學(xué)特征

從渥堆六堡茶中分離純化得到4 株“金花”菌，分別命名為L(zhǎng)B-22、LB-32、LB-35、LB-55。采用三點(diǎn)法將4 株“金花”菌接種到CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d，如圖1所示，LB-35在CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快；LB-22菌落質(zhì)地緊密，較平整，圓形絨狀，整體呈金黃色泛綠，中間部位顏色較淺；菌落背面光滑，顏色同正面；LB-32質(zhì)地密集，正面中心灰綠色，外圍淺綠色，邊沿淺杏色，圓形，背面光滑，有黃色閉囊殼；LB-35菌落質(zhì)地緊密，圓形有脊，呈放射狀，正面背面金色，邊沿顏色較淺；LB-55菌落質(zhì)地緊密，圓形，正面同背面，金黃色，中心顏色稍深，黃色閉囊殼豐富。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀(guān)察結(jié)果，初步將LB-22鑒定為青霉屬，LB-32、LB-35和LB-55鑒定為曲霉屬。

圖1 菌株在CA培養(yǎng)基平板上正面（A）、反面（B）及其在光學(xué)顯微鏡下分生孢子形態(tài)（C）、菌絲形態(tài)（D）Fig.1 Fron (A) and back view (B) of strains cultured on CA medium plates;and morphology of conidial head (C) and mycelium (D) under light microscope

2.1.2 “金花”菌的分子生物學(xué)鑒定

將菌株測(cè)序所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2所示。結(jié)合表1可知，菌株LB-22為芒果青霉（P.manginii）、LB-32為赤曲霉（A.ruber）、LB-35為間型曲霉（A.intermedius）、LB-55為阿姆斯特丹曲霉（A.amstelodami）。

表1 真菌的ITS序列分子鑒定結(jié)果Table 1 ITS molecular identification of fungi

圖2 分離到的真菌與BLAST比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of fungal isolates based on BLAST results

2.2 4 株“金花”菌發(fā)酵對(duì)六堡茶感官品質(zhì)的影響

從表2可知，4 株“金花”菌對(duì)六堡毛茶發(fā)酵均有很大影響，發(fā)酵28 d后，在外形、湯色、香氣和滋味上都有明顯改變。未加菌CK干茶外形烏褐油潤(rùn)，開(kāi)湯后香氣純正、生曬味，湯色橙黃、清澈明亮，滋味濃強(qiáng)、苦澀，葉底綠褐，與毛茶感官品質(zhì)接近，說(shuō)明在無(wú)菌狀態(tài)下僅有濕熱作用，對(duì)六堡茶感官品質(zhì)影響不大。4 株“金花”菌發(fā)酵的茶樣中，LB-22和LB-35發(fā)酵六堡茶外形無(wú)金花，LB-32和LB-55發(fā)酵茶樣表面布滿(mǎn)金花，說(shuō)明“金花”菌需要特定的發(fā)酵環(huán)境中才能產(chǎn)金黃色閉囊殼。4 種發(fā)酵茶樣在香氣方面差異顯著，LB-22發(fā)酵茶樣菌香帶花香；LB-32發(fā)酵茶樣木香；LB-35發(fā)酵茶樣木質(zhì)香帶甜香、清花香；LB-55發(fā)酵茶樣板栗香帶甜花香。4 種發(fā)酵茶樣的湯色都有顯著改善，尤其是LB-32發(fā)酵茶樣湯色紅濃、清澈。在滋味上，LB-35發(fā)酵茶樣滋味醇厚順滑、帶甜；LB-55發(fā)酵茶樣醇滑帶甜；LB-32醇和順滑，有陳味；LB-22發(fā)酵茶樣醇和，稍帶收斂性，帶腥味。葉底上，4 種發(fā)酵茶樣均較柔軟，色澤無(wú)明顯差異?？傮w而言，接種LB-35的茶樣香氣更突出，滋味更醇厚。

表2 “金花”菌發(fā)酵茶葉感官審評(píng)結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of tea fermented by“Golden Flower” fungi

2.3 4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶生化成分的變化

2.3.1 茶多酚、沒(méi)食子酸及兒茶素的變化

茶多酚是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)[20]，在茶湯中呈苦澀味，有較強(qiáng)的刺激性，對(duì)茶葉的色、香、味都有很大影響[21]。從表3可知，與CK相比，在4 株“金花”菌作用下，茶多酚含量呈極顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01），LB-22、LB-32、LB-35和LB-55發(fā)酵組分別降低了37.47%、47.98%、40.02%、23.04%，這與冉莉莎[22]、龔受基[23]等的研究結(jié)論一致。值得注意的是，對(duì)比CK，除茶黃素含量無(wú)顯著性變化外，其余各發(fā)酵組茶褐素含量均極顯著升高（P＜0.01），而茶紅素含量均極顯著降低（P＜0.01），這與單治國(guó)[24]、Wang Zihao[25]等研究結(jié)論一致。4 株“金花”菌發(fā)酵均能將茶多酚主要轉(zhuǎn)化為茶褐素，尤其是LB-35發(fā)酵樣，茶褐素質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)（13.14±0.13）%。

表3 4 株“金花”菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)六堡茶化學(xué)成分的影響Table 3 Effect of solid state fermentation by four “Golden Flower”fungi on chemical composition of Liupao tea

GA屬于茶多酚類(lèi)物質(zhì)，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗突變等生理活性[26-27]。與CK相比，LB-22、LB-35和LB-55發(fā)酵組GA含量極顯著降低（P＜0.01），LB-22、LB-35分別降低了89.26%、94.63%，LB-55發(fā)酵組幾乎檢測(cè)不到，LB-32組GA含量極顯著升高（P＜0.01），達(dá)（8.39±0.05）mg/g，這與Ma Cunqiang等[28]的研究結(jié)果類(lèi)似。

兒茶素是茶苦味的重要來(lái)源，是茶多酚中最重要的一種，占茶多酚總量的70%～80%，具有廣泛的藥理活性，是茶葉中重要的非揮發(fā)性成分[29]。與CK相比，LB-22、LB-32、LB-35和LB-55發(fā)酵組的酯型兒茶素含量均極顯著下降（P＜0.01），其中EGCG含量分別降低了79.91%、86.04%、91.13%、92.84%，使得茶湯苦澀味轉(zhuǎn)化為醇厚，這一結(jié)論與Wang Yali等[29]的研究相似，GCG含量分別降低了71.60%、84.45%、88.91%、92.80%，ECG含量分別降低了76.90%、83.01%、88.06%、87.75%；CG含量分別降低了40.07%、98.37%、96.74%、62.21%。而4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶的非酯型兒茶素中，除EC含量均下降外，GC、EGC、C含量的變化趨勢(shì)各有不同。與CK相比，LB-32發(fā)酵六堡茶的GC含量上升了10.08%（P＜0.01），LB-22、LB-35、LB-55分別降低了46.46%（P＜0.01）、65.91%（P＜0.01）、13.45%（P＜0.01）；LB-22發(fā)酵六堡茶的EGC含量上升了72.59%（P＜0.01），LB-32、LB-35、LB-55分別降低了2.63%、70.26%（P＜0.01）、36.18%（P＜0.01）；LB-22和LB-55發(fā)酵六堡茶的C含量較CK組分別上升了44.00%（P＜0.01）和51.56%（P＜0.01），LB-32和LB-35的C含量較CK組分別降低了23.33%和65.33%（P＜0.01）。4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶的總兒茶素均極顯著降低（P＜0.01），分別降低了44.30%、68.00%、84.61%、73.31%。以上結(jié)果表明，雖然4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶各兒茶素類(lèi)組分含量的變化趨勢(shì)不同，但總兒茶素和酯型兒茶素的含量極顯著下降（P＜0.01），減輕了六堡毛茶的苦澀味和刺激性。

2.3.2 水浸出物、游離氨基酸含量的變化

水浸出物是茶湯主要呈味物質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)，水浸出物含量的高低可作為判斷茶湯厚薄、濃強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)，一定程度反映了六堡茶品質(zhì)的優(yōu)劣[24]。由表3可知，與未接菌CK相比，六堡毛茶經(jīng)不同“金花”菌發(fā)酵28 d后，茶葉中水浸出物含量變化也各不相同，LB-22與LB-32發(fā)酵茶樣水浸出物含量顯著下降（P＜0.05），而LB-35和LB-55樣含量顯著上升（P＜0.05），接種LB-55發(fā)酵的六堡茶水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到39.77%，明顯高于其他3 株“金花”菌發(fā)酵的六堡茶，結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果（表2）可知，LB-55發(fā)酵的六堡茶茶湯滋味醇厚。

游離氨基酸是茶葉滋味與香氣形成的重要前體物質(zhì)。由表3可知，與CK相比，在4 株“金花”菌作用下，游離氨基酸含量呈極顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01），下降幅度最大的是LB-32。造成氨基酸含量下降的原因可能是“金花”菌生長(zhǎng)過(guò)程中利用氨基酸作為生長(zhǎng)氮源，同時(shí)在酶促作用下產(chǎn)生脫氨作用和脫羧作用，將氨基酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性或非揮發(fā)性芳香物質(zhì)[32]。

2.3.3 咖啡堿含量的變化

由表3可知，與CK相比，4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶的咖啡堿含量變化各異，LB-32和LB-55發(fā)酵六堡茶咖啡堿含量呈極顯著增加趨勢(shì)（P＜0.01），LB-55發(fā)酵茶樣中咖啡堿含量達(dá)（53.74±0.06）mg/g，LB-22和LB-35發(fā)酵組呈下降趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，咖啡堿在六堡茶成品茶中的含量一般為28.30～29.30 mg/kg[31]。研究表明，霉菌類(lèi)可以提高后發(fā)酵過(guò)程中茶葉的咖啡堿含量[33]。

2.3.4 黃酮和可溶性糖含量的變化

茶葉中的黃酮類(lèi)化合物主要是黃酮醇及其苷類(lèi)，是多酚類(lèi)物質(zhì)的一部分，能溶于熱水，對(duì)茶的色澤和滋味均有一定影響。由表3可知，與CK相比，在4 株“金花”菌作用下，總黃酮含量極顯著下降（P＜0.01），但4 種發(fā)酵茶之間差異不顯著。

可溶性糖具有甜味，對(duì)咖啡堿的苦澀味有一定的抑制和協(xié)調(diào)作用，可溶性糖含量越高茶葉滋味越甘醇。由表3可知，與CK相比，LB-22、LB-32和LB-35發(fā)酵組可溶性糖含量呈極顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01），其原因可能是發(fā)酵菌種生長(zhǎng)繁殖時(shí)需要大量的可溶性糖作為碳源和能量來(lái)源[34]，另外糖類(lèi)物質(zhì)在微生物發(fā)酵作用下，與兒茶素生成糖苷化兒茶素，也可能導(dǎo)致茶中可溶性糖含量降低[35]；LB-55發(fā)酵組可溶性糖含量呈極顯著增加趨勢(shì)（P＜0.01），結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果（表2）可知，LB-55茶樣在滋味審評(píng)中帶甜味。

2.3.5 PCA

為探究“金花”菌對(duì)六堡茶主要化學(xué)品質(zhì)的影響，基于19 種檢測(cè)成分進(jìn)行PCA 和層次聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。如圖3所示，4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶和CK差異顯著。PCA將5 個(gè)處理組劃分為2 組，組1包括CK組，組2包括LB-22、LB-32、LB-35、LB-55組，PC1和PC2分別解釋總方差的49.53%和19.78%，CK與4 株“金花”菌發(fā)酵茶樣相比，在PC1上被區(qū)分；LB-22和LB-32與LB-35和LB-55發(fā)酵樣品在PC2上被區(qū)分，表明不同“金花”菌發(fā)酵對(duì)六堡茶品質(zhì)成分影響各異。茶黃素、GCG、ECG、EGCG和總兒茶素分別是PC1的前5 位貢獻(xiàn)物質(zhì)，水浸出物、EGC、茶紅素、黃酮和GA是PC2的前5 位貢獻(xiàn)物質(zhì)。此外，HCA表明這些化學(xué)成分也聚為兩簇，茶褐素和水浸出物聚為一簇，其他17 種化合物聚為另一簇。

圖3 4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶與CK茶樣中19 種特定化學(xué)成分的PCA（A）和HCA（B）Fig.3 PCA plot (A) and HCA heatmap (B) of 19 specific chemical components in Liupao tea fermented by four “Golden Flower” fungi and control samples

3 結(jié)論

從廣西六堡茶渥堆過(guò)程的茶樣中分離出4 株“金花”菌，通過(guò)菌落形態(tài)、光學(xué)顯微鏡特征和分子生物學(xué)鑒定繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，4 株“金花”菌分別鑒定為L(zhǎng)B-22P.manginii、LB-32A.ruber、LB-35A.intermedius和LB-55A.amstelodami。其中，A.ruber和A.amstelodami是六堡茶渥堆及陳化過(guò)程中曾報(bào)道過(guò)的“金花”菌[7-8]，而P.manginii和A.intermedius與以往所報(bào)道的六堡茶“金花”菌不同，曾出現(xiàn)于茯磚茶和普洱茶中，對(duì)茶葉品質(zhì)成分轉(zhuǎn)化有重要影響[28,35-36]，P.manginii為“金花”普洱茶中曾報(bào)道過(guò)的優(yōu)勢(shì)菌，Zhou Binxing等[37]通過(guò)對(duì)比貯藏過(guò)程中“金花”普洱茶和普洱茶的化學(xué)成分和真菌群落，發(fā)現(xiàn)P.manginii與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

為探索4 株“金花”菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)六堡茶品質(zhì)的影響，分別通過(guò)感官審評(píng)和HPLC法，分析測(cè)定了4 種“金花”菌發(fā)酵六堡茶中的感官品質(zhì)及主要化學(xué)成分，包括水浸出物、可溶性糖、游離氨基酸、茶多酚、3 種茶色素、8 種兒茶素類(lèi)物質(zhì)、總黃酮類(lèi)化合物、GA和咖啡堿含量。PCA和HCA揭示了4 株“金花”菌發(fā)酵與CK之間的差異。特別是通過(guò)PCA，LB-22、LB-32、LB-35和LB-55發(fā)酵六堡茶聚為一組，與CK表現(xiàn)出明顯差異。六堡毛茶經(jīng)過(guò)4 株“金花”菌發(fā)酵后，總黃酮、總游離氨基酸、茶多酚、茶紅素、兒茶素類(lèi)（EC、CG、C、EGCG、GCG、ECG）和總兒茶素含量極顯著降低（P＜0.01），而茶褐素含量極顯著升高（P＜0.01），結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果，4 株“金花”菌發(fā)酵均能明顯改善六堡茶品質(zhì)，使毛茶的品質(zhì)在相對(duì)較短的時(shí)間接近成品茶，即湯色由橙黃轉(zhuǎn)為紅濃、紅棕，增加了陳香、木質(zhì)香、菌花香，滋味由濃強(qiáng)苦澀轉(zhuǎn)為醇厚順滑。4 株“金花”菌發(fā)酵六堡茶感官品質(zhì)各有不同，增添了六堡茶新的風(fēng)味，特別是LB-35A.intermediu發(fā)酵的六堡茶滋味醇厚順滑帶甜，木質(zhì)香帶甜花香，湯色紅棕明亮，可作為六堡茶發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種應(yīng)用于生產(chǎn)。本研究結(jié)果有助于六堡茶“金花”菌的開(kāi)發(fā)和利用，可為六堡茶產(chǎn)業(yè)化研究、產(chǎn)品定向開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。