功能菌株復配對發(fā)酵香腸抗氧化特性及風味的作用

王雍雍，陳 磊，魏從嬌，葛慶豐，吳滿剛，趙 寧，席 軍，單艷琴，何旭東，于 海,*，劉 瑞

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇省淮揚菜工業(yè)化工程中心，文化和旅游部中餐非遺技藝傳承重點實驗室，江蘇 揚州 225127；2.江蘇長壽集團有限公司，江蘇 南通 226500；3.江蘇興野食品有限公司，江蘇 興化 225700；4.揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225001）

發(fā)酵香腸是指將瘦肉絞碎、肥肉切丁，加入發(fā)酵劑、糖、鹽和香辛料等混合均勻后灌入腸衣，在人工或自然條件下發(fā)酵形成具有特征性發(fā)酵香味的發(fā)酵肉制品[1]。肉中的脂肪和蛋白質(zhì)在肌肉內(nèi)源酶及外源微生物的共同作用下被分解為脂肪酸、多肽和氨基酸等物質(zhì)，進一步分解形成發(fā)酵香腸的風味物質(zhì)。由于香腸在制備過程中受到加工環(huán)境和貯藏條件的影響，蛋白質(zhì)會發(fā)生不同程度的氧化，適度氧化有利于香腸風味的形成，但過度氧化會對香腸的顏色、質(zhì)地、滋味、保水性和消化性等品質(zhì)造成不良的影響[2]，所以具有抗氧化作用的微生物成為了研究的熱點。Luan Xiaoxu等[3]從發(fā)酵香腸中分離出的植物乳植桿菌CD 101具有較高的抗氧化性，能有效抑制發(fā)酵香腸的氧化，從而延長香腸的貨架期。本實驗選用的植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarumNJAU-01，LpN）是1 株分離自金華火腿的具有高抗氧化性且具備優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌[4]。

此外，發(fā)酵劑的添加還可以改善產(chǎn)品的風味與品質(zhì)。趙銀峰等[5]篩選出的1 株植物乳植桿菌M-25能有效提升香腸品質(zhì)和風味特性。本實驗選用的植物乳植桿菌（L.plantarumCGMCC 18217，Lp10）已被證明具有優(yōu)良的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶活力，可以應用到發(fā)酵香腸中提高特征性風味化合物如3-甲基丁醛、2-甲基丙醇和2-甲基丁醛的含量[6]。葡萄球菌通過產(chǎn)生的蛋白酶水解原料肉中的蛋白質(zhì)，釋放的肽和游離氨基酸能改善發(fā)酵香腸的滋味、提高風味物質(zhì)的含量。有研究表明接種腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticCGMCC 3475，Ss）不僅促進了發(fā)酵香腸中的蛋白質(zhì)降解，而且提高了直鏈醛和酮的含量，賦予了發(fā)酵香腸優(yōu)良的風味[7]。而在發(fā)酵香腸中接種復配發(fā)酵劑，通過不同發(fā)酵劑之間的協(xié)同作用可以彌補單一菌種的單調(diào)性，充分利用各菌株的優(yōu)點，提高和改善產(chǎn)品品質(zhì)[8]，本研究旨在利用不同功能菌株進行復配以提高發(fā)酵香腸的風味和降低其蛋白質(zhì)的氧化程度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lp10、LpN和Ss由揚州大學食品科學與工程學院畜產(chǎn)加工實驗室從火腿中分離并保藏；豬肉和香辛料購于揚州大潤發(fā)超市；豬腸衣由江蘇省如皋壩新腸衣公司提供。

MRS培養(yǎng)基 青島海博生物有限公司；磷酸二氫鈉合二水、磷酸氫二鈉合十二水、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇、甘油、溴酚藍 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

205便攜式pH計 德國Testo公司；LabSwift-aw便攜式水分活度儀 瑞士NOVASINA公司；TA.XT.plus質(zhì)構儀 英國Stable Micro System公司；手持式CR-400色差儀 日本Konica Minolta公司；easySpiral全自動稀釋接種儀 法國Interscience公司；Mini-PROTEAN Tetra cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；Trace DSQ II氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與制備

將Lp10、LpN和Ss3 株菌分別以1%的接種量加到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，重復活化2 次后，4 ℃、6 000×g離心10 min，菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌后重懸。

1.3.2 菌株之間的拮抗作用

用接種環(huán)挑取活化后的菌株，在MRS固體培養(yǎng)基上劃一條直線，37 ℃培養(yǎng)24 h，再用接種環(huán)挑取另一菌株沿菌落邊緣從垂直方向接種，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察劃線交界處是否存在抑菌區(qū)[9]。

1.3.3 發(fā)酵香腸制備及處理組設計

將瘦肉絞碎，肥肉切丁，肥瘦比為3∶7，每千克肉中加入糖7%、鹽3%、味精0.2%、五香粉0.1%、生姜粉0.15%、大曲20 mL，混合均勻后進行灌腸和結扎，發(fā)酵時間為28 d，接菌處理組的菌株接種總量為1×107CFU/g。

發(fā)酵條件：溫度（30±0.5）℃，相對濕度95%，發(fā)酵時間1 d；溫度16 ℃，相對濕度80%，發(fā)酵時間1 d；溫度16 ℃，相對濕度70%，發(fā)酵時間1 d；溫度16 ℃，相對濕度60%，發(fā)酵時間25 d。

發(fā)酵香腸處理組：CK：不接種發(fā)酵劑的空白組；Lp10：只接種Lp10的處理組；Lp10＋Ss：以1∶1比例接種Lp10和Ss的處理組；Lp10＋LpN＋Ss：以1∶1∶1比例接種Lp10、LpN和Ss的處理組。

4 個處理組的發(fā)酵香腸取樣時間分別是0、7、14、21、28 d。

1.3.4 發(fā)酵香腸理化指標的測定

1.3.4.1 發(fā)酵香腸乳酸菌總數(shù)的測定

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，將MRS固體培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3.4.2 發(fā)酵香腸pH值的測定

使用三點校準后的手持便攜式pH計，插入去除腸衣的發(fā)酵香腸內(nèi)部測定[5]。

1.3.4.3 發(fā)酵香腸水分活度（aw）的測定

根據(jù)GB 5009.238—2016《食品水分活度的測定》第二法，稱取5.0 g去除腸衣并切碎的香腸樣品置于校準后的水分活度儀測定平皿中，記錄儀器顯示的測量值。

1.3.4.4 發(fā)酵香腸質(zhì)構的測定

參考李俊霞等[10]方法，將香腸樣品去除腸衣后切成邊長為1 cm的正方體，質(zhì)構儀設置感應源1 000 N，初始力0.3 N，壓縮比60%，測定前、中、后速率分別為2、2、1 mm/min，循環(huán)2 次。測定指標為硬度（N）和彈性（mm）。

1.3.4.5 發(fā)酵香腸色澤的測定

將發(fā)酵香腸切成3.0 mm的薄片，用校正后的色差儀測量樣品隨機點的L*、a*和b*值。

1.3.5 發(fā)酵香腸蛋白降解和氧化指標的測定

1.3.5.1 肌原纖維蛋白的提取

取5.0 g去除腸衣并切碎的香腸樣品加入50 mL磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.4），勻漿60 s，然后12 000×g、4 ℃離心20 min，取沉淀重懸于50 mL含0.1%（V/V）Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（0.03 mol/L，pH 7.4），勻漿60 s，再次12 000×g、4 ℃離心20 min，取沉淀，離心重復3 次。所得沉淀用50 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5，含0.7 mol/L KI）勻漿5 min，靜置待蛋白充分溶解后12 000×g、4 ℃離心20 min，最終所得上清液即肌原纖維蛋白。提取的蛋白用雙縮脲法測定濃度，再用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）調(diào)整為2 mg/mL。

1.3.5.2 肌原纖維蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

將500 μL肌原纖維蛋白樣品與500 μL 2×Loading Buffer上樣緩沖液（1 g/100 mL溴酚藍、200 mmol/L Tris-HCl pH 6.8、8 g/100 mL SDS、40 g/100 mL甘油和1%（V/V）β-巰基乙醇）混勻，在95 ℃加熱10 min。待樣品冷卻至室溫后，取20 μL加入到由12.5%分離膠和4%濃縮膠組成的SDS-PAGE凝膠孔道上。然后在Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)上以90 V恒壓模式下進行30 min后，再在120 V恒壓模式下進行60 min。電泳結束后，將凝膠在含有0.1 g/100 mL考馬斯亮藍G-250、45%（V/V）甲醇和10%（V/V）乙酸的溶液中進行染色，染色時間為40～60 min，然后在加入10%乙酸、10%甲醇的溶液中進行脫色，直至觀察到清晰蛋白條帶，再使用Bio-Rad成像系統(tǒng)對凝膠進行掃描分析。

1.3.5.3 游離氨基酸的測定

參照柴利等[11]的方法，精確稱取切碎的發(fā)酵香腸2.5 g，加入10 mL 3.5%（V/V）高氯酸溶液，4 700 r/min均質(zhì)60 s，均質(zhì)后10 000×g、4 ℃離心10 min，離心后取上清液。用適量高氯酸溶液洗滌沉淀物再次離心，合并2 次上清液并用5%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0，用純水定容至25 mL。取1.5 mL過0.22 μm濾膜后用全自動氨基酸分析儀檢測。

1.3.5.4 總巰基含量的測定

取0.2 mL 2 mg/mL所提的肌原纖維蛋白液，加入1.8 mL脲緩沖液和80 μL 2-硝基苯甲酸，在40 ℃反應25 min，然后冷卻至室溫，于412 nm波長處測定吸光度?？値€基單位用每毫克蛋白巰基物質(zhì)的量表示，摩爾吸光系數(shù)為13 600 L/（mol·cm）。

1.3.5.5 表面疏水性的測定

取2 mL 2 mg/mL所提的肌原纖維蛋白液，加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液，充分混勻后10 000×g、4 ℃離心15 min，于595 nm波長處測定吸光度（A），磷酸鹽緩沖液作為空白對照組。表面疏水性按下式計算：

1.3.6 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

將發(fā)酵結束后的香腸去除腸衣并切碎，取10 g于250 mL萃取瓶中，加入20 μL用甲醇稀釋的辛酸甲酯內(nèi)標溶液。萃取瓶在60 ℃水浴鍋中平衡5 min后，插入固相微萃取萃取頭吸附40 min，然后將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進樣口解吸5 min。

檢測條件：氣相色譜：非極性柱D B-5 M S（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氮氣（99.999%），恒流，流量為1.0 mL/min，不分流進樣。輔助載氣為高純氫氣（99.999%），檢測器溫度280 ℃，進樣口溫度250 ℃。初始溫度40 ℃，保持1 min，5 ℃/min升溫至100 ℃，保持8 min，8 ℃/min升溫至240 ℃，保持5 min。質(zhì)譜：離子化方式為電子電離源，電子能量70 eV，掃描時間0.2 s，檢測器電壓500 V，掃描范圍m/z30～500。

定性定量分析：以Wiley、Nistdemo質(zhì)譜庫進行定性分析，匹配度大于等于800為鑒定依據(jù)，結合解析譜圖，確定風味物質(zhì)。采用內(nèi)標法進行定量，內(nèi)標物質(zhì)為辛酸甲酯。

1.3.7 發(fā)酵香腸的感官評價

參照曹辰辰等[12]的方法，選擇10 名（男女各5 人）經(jīng)過專業(yè)感官培訓的食品專業(yè)研究生成立感官評定小組，以色澤、香味、形態(tài)及滋味為評價指標對發(fā)酵香腸樣品進行評分，評分標準如表1所示。

表1 發(fā)酵香腸感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented sausage

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 菌株間的拮抗作用

如圖1所示，3 株菌株沒有產(chǎn)生拮抗作用，它們在劃線交叉處共同生長，沒有出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象。因此這3 株菌株可以聯(lián)合復配，應用到發(fā)酵香腸中。

圖1 菌株間的拮抗作用Fig.1 Antagonism among strains

2.2 香腸發(fā)酵過程中理化指標的變化

2.2.1 香腸發(fā)酵過程中乳酸菌總數(shù)的變化

如圖2所示，乳酸菌總數(shù)整體呈先迅速增加后緩慢減少的趨勢。發(fā)酵0 d，CK組在MRS固體培養(yǎng)基上的計數(shù)約為4.64（lg（CFU/g））。接菌的3 個處理組在發(fā)酵7～14 d乳酸菌總數(shù)不斷增加到達最高水平（108～109CFU/g），說明乳酸菌能夠利用發(fā)酵香腸中的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長繁殖。隨后，在發(fā)酵結束時（28 d）下降到107～108CFU/g，這可能是由于乳酸菌產(chǎn)物有機酸的不斷積累抑制了它自身的生長繁殖[13]，也與發(fā)酵的溫濕度等變化有關。

圖2 發(fā)酵過程中香腸乳酸菌總數(shù)的變化Fig.2 Change in total number of lactic acid bacteria in fermented sausage during fermentation

2.2.2 香腸發(fā)酵過程中pH的變化

如圖3所示，香腸發(fā)酵成熟過程中pH值呈先下降后上升的趨勢。在發(fā)酵0 d，各組的pH值均在5.6～5.7。發(fā)酵7 d后，各處理組的pH值均顯著下降（P＜0.05），直至發(fā)酵14 d后pH值降到最低，CK、Lp10、Lp10＋Ss、Lp10＋LpN＋Ss組分別降至5.24、5.04、4.83、4.95。在發(fā)酵初期，迅速降低的pH值有助于抑制香腸中有害微生物的生長[14]，降低蛋白質(zhì)的水結合能力，加快干燥進程。處理組Lp10＋Ss的pH值在14 d顯著低于其余各組（P＜0.05），這是由于Ss具有較強的酸化活性[6]。發(fā)酵14 d后各組pH值回升，其中接菌的3 個處理組在發(fā)酵過程中pH值始終比CK組低，而接種復配菌株的處理組在發(fā)酵過程中pH值始終顯著低于接種單菌株的處理組（P＜0.05）。這與Lorenzo等[15]的研究結果一致，其認為微生物產(chǎn)生的蛋白酶誘導蛋白降解，產(chǎn)生肽和胺等堿性物質(zhì)緩沖了發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸，導致發(fā)酵后期pH值回升。

圖3 發(fā)酵過程中香腸pH值的變化Fig.3 Changes in pH of fermented sausage during fermentation

2.2.3 香腸發(fā)酵過程中aw的變化

如圖4所示，所有處理組的香腸aw在成熟過程中均發(fā)生顯著下降（P＜0.05），最終各組的aw值范圍為0.64～0.67，此時大多數(shù)微生物將停止生長[16]。發(fā)酵21 d后，接菌處理組aw值比CK組低（P＜0.05），而較低的aw值有利于香腸的保存。這與Sun Qinxiu等[17]的研究結果一致，微生物的快速生長可以加速香腸的脫水[18-19]，因此接菌會降低香腸的水分含量和aw。

圖4 發(fā)酵過程中香腸aw的變化Fig.4 Changes in aw of fermented sausage during fermentation

2.2.4 香腸發(fā)酵過程中質(zhì)構的變化

品質(zhì)優(yōu)良的香腸應該具有軟硬適中、結實、富有彈性等特點。表2是發(fā)酵過程中香腸質(zhì)構的變化，各個處理組硬度均隨著發(fā)酵時間的延長顯著增加（P＜0.05），發(fā)酵結束后接菌處理組硬度高于CK組，這是因為接種的乳酸菌和葡萄球菌生長繁殖導致pH值下降，而發(fā)酵香腸pH值與硬度具有較強負相關性[20]。發(fā)酵結束后香腸的彈性較發(fā)酵0 d顯著提高（P＜0.05），可能是由于pH值和aw降低，游離氨基酸含量升高，蛋白質(zhì)的變性和凝固程度升高，香腸的持水性變低，使得香腸的結構更加緊密，更加結實具有彈性[21-23]，提升了香腸的口感。

表2 發(fā)酵過程中香腸質(zhì)構的變化Table 2 Changes in texture of fermented sausage during fermentation

2.2.5 香腸發(fā)酵過程中色澤的變化

色澤是消費者評判香腸品質(zhì)的第一標準，香腸發(fā)酵過程中的顏色變化如表3所示。各處理組的亮度值（L*）在發(fā)酵過程中發(fā)生了顯著變化（P＜0.05），除處理組Lp10＋Ss的L*不斷下降，其他處理組的L*均在發(fā)酵結束時略有上升。L*下降是由于水分流失而形成深色，處理組Lp10＋Ss的L*不斷下降可能是由于葡萄球菌的添加，這與夏讓等[24]的研究一致。為了減少評判的誤差，在評價香腸的色澤時可以通過紅度值（a*）/黃度值（b*）的大小判斷，a*/b*越大，產(chǎn)品的紅色越鮮艷[25-27]。從表3可以看出，處理組Lp10＋LpN＋Ss的a*/b*顯著高于處理組CK和Lp10（P＜0.05），說明該組香腸的紅色最鮮艷。不同發(fā)酵劑對香腸色澤有不同程度的影響，且復配發(fā)酵劑的發(fā)色效果優(yōu)于單一發(fā)酵劑。這可能是由于復配發(fā)酵劑中的腐生葡萄球菌能夠產(chǎn)生硝酸鹽或亞硝酸鹽還原酶，通過這些酶的作用還原硝酸鹽，再將亞硝酸鹽分解成NO，NO和肌紅蛋白結合形成了亮紅色的亞硝基肌紅蛋白，從而提高了發(fā)酵香腸的色澤[28]。

表3 發(fā)酵過程中香腸色澤的變化Table 3 Changes in color of fermented sausage during fermentation

2.3 香腸發(fā)酵過程中蛋白降解程度的變化

2.3.1 香腸發(fā)酵過程中肌原纖維蛋白的變化

香腸發(fā)酵過程中，在肌肉內(nèi)源酶和微生物外源酶的共同作用下，蛋白質(zhì)會發(fā)生不同程度的降解。由圖5可以看出蛋白條帶在發(fā)酵過程中變化明顯。發(fā)酵0 d，各處理組蛋白條帶相對強度最大，CK組與各接菌組的蛋白條帶基本一致，說明蛋白起始條件接近。隨著發(fā)酵時間的延長，條帶相對強度減弱，且條帶數(shù)量也逐步減少。發(fā)酵至28 d，如圖5e所示，接菌處理組蛋白條帶強度進一步減弱，并且多處條帶已經(jīng)消失。接菌處理使蛋白降解發(fā)生得更快，且接種復配菌株促進了肌原纖維蛋白的降解?？梢钥闯?，Lp10＋LpN＋Ss處理組降解肌原纖維蛋白效最好。

圖5 發(fā)酵過程中香腸肌原纖維蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE patterns of myofibrillar protein in fermented sausage during fermentation

2.3.2 發(fā)酵香腸游離氨基酸含量分析

在香腸的發(fā)酵過程中，肌肉蛋白經(jīng)菌株產(chǎn)生的蛋白酶及肉本身的內(nèi)源酶降解產(chǎn)生多肽，多肽進一步被降解成更小的多肽和游離氨基酸，而游離氨基酸是誘導味覺化合物和其他風味化合物的前體物質(zhì)[29]，在發(fā)酵香腸的風味形成中起重要作用。

香腸發(fā)酵結束后各處理組游離氨基酸和總游離氨基酸含量如表4所示。發(fā)酵結束后，香腸的游離氨基酸中Ala和Glu含量較高，在所有處理組中均占較大比例，Ala有助于產(chǎn)生甜味，Glu水平的增加可能是由于谷氨酰胺脫氨基[30]，除有助于鮮味，還可以在支鏈氨基酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用時提供氨基受體α-酮戊二酸，促進特征性風味的產(chǎn)生[31]。各接菌處理組的Ala和Glu含量顯著高于CK組（P＜0.05），與王琴等[32]的研究結果一致。處理組Lp10＋LpN＋Ss的游離氨基酸含量最高，該結果可以與肌原纖維蛋白降解程度相互驗證。

表4 發(fā)酵結束后香腸中游離氨基酸含量Table 4 Contents of free amino acids in fermented sausage

2.4 香腸發(fā)酵過程中蛋白氧化程度的變化

2.4.1 香腸發(fā)酵過程中總巰基含量的變化

蛋白質(zhì)表面的Cys殘基氧化導致巰基被氧化成二硫鍵、磺酸、次磺酸等，因此巰基值可以表示蛋白氧化的程度，巰基值越低則氧化程度越高。如圖6所示，隨著發(fā)酵時間的延長，各處理組發(fā)酵香腸的巰基值均呈現(xiàn)下降趨勢，說明蛋白不斷被氧化。但是接菌處理可以抑制巰基的減少，尤其是復配處理組Lp10＋LpN＋Ss，其總巰基含量在整個發(fā)酵過程中均顯著高于其他處理組（P＜0.05）。表明接菌可能對降低發(fā)酵香腸的蛋白氧化程度有貢獻，接種LpN的復配處理組抗氧化能力更強（P＜0.05）。

圖6 發(fā)酵過程中香腸總巰基含量的變化Fig.6 Changes in total sulfhydryl content in fermented sausage during fermentation

2.4.2 香腸發(fā)酵過程中表面疏水性的變化

表面疏水性是指在蛋白質(zhì)分子表面所發(fā)現(xiàn)的疏水基團的數(shù)量[33]，它能反映出蛋白質(zhì)構象的變化并表征蛋白質(zhì)中疏水位點的表面暴露[34]，一般用蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸與溴酚藍結合量表示表面疏水性的大小，表面疏水性越大說明蛋白質(zhì)的變性程度越大。如圖7所示，發(fā)酵香腸的蛋白表面疏水性隨發(fā)酵時間的延長而逐漸升高。接菌處理組的表面疏水性整個發(fā)酵過程中均顯著低于CK組（P＜0.05），表面疏水性最低的是接種了LpN的復配處理組。上述結果表明接菌處理特別是接種LpN能顯著降低發(fā)酵香腸蛋白的表面疏水性（P＜0.05），在一定程度上降低了發(fā)酵香腸的蛋白質(zhì)氧化程度，對提高發(fā)酵香腸的品質(zhì)有利。

圖7 發(fā)酵過程中香腸表面疏水性的變化Fig.7 Changes in surface hydrophobicity of proteins in fermented sausage during fermentation

2.5 發(fā)酵香腸的揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對發(fā)酵28 d后的香腸進行揮發(fā)性化合物的鑒定和定量。各個處理組分別檢出32、40、41 種和43 種揮發(fā)性化合物，主要為酯類、醛類、醇類、酸類、烷烴類、烯烴類、酮類和其他化合物。相較于CK組，接菌處理增加了揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類和含量，各組揮發(fā)性化合物的組成和含量如表5所示。

表5 發(fā)酵結束后香腸的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量Table 5 Volatile flavor substance contents in fermented sausage

接菌處理組的酯類含量都高于CK組，而發(fā)酵香腸的典型風味主要來源于酯類，這表明接種發(fā)酵劑能夠促進發(fā)酵香腸風味的形成[35]。酯類物質(zhì)由醇類和酸類物質(zhì)經(jīng)過酯化作用生成，多具有芳香風味，含有短鏈酸的酯類大多帶有水果香氣，含有長鏈酸的酯類大多呈現(xiàn)較淡的油脂味[36]，脂肪水解產(chǎn)生的游離脂肪酸會與醇反應生成酯類物質(zhì)，這也對香腸的獨特風味具有重要貢獻[37]。添加LpN處理組中的酯類物質(zhì)總含量明顯高于其他處理組，表明接種LpN提高了香腸的品質(zhì)，這與葛慶豐[38]的研究結果一致。

醛類是發(fā)酵香腸中重要的風味化合物，風味閾值較低，主要來源于油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化以及氨基酸的降解[39]。其中含量最高的是壬醛，它會散發(fā)出康乃馨、柑橘和月桂樹的氣味[40]，2-庚烯醛具有燒烤及黃油味[41]，己醛具有清香青草氣味。醛類能夠反應脂肪的氧化程度，對發(fā)酵肉制品特殊的風味的形成具有重要貢獻。酮類化合物能夠促進奶香味生成，3-羥基-2-丁酮是測得含量最高的酮類化合物，它揮發(fā)性較強，具有黃油香味和干酪香味，對發(fā)酵香腸的風味形成具有重要意義。處理組Lp10＋Ss和Lp10＋LpN＋Ss較其他2 個處理組有更高的醛和酮含量，證明Ss對肉制品的風味起到了較好促進作用，這與李想等[7]研究結果一致。

醇類物質(zhì)具有較高的閾值[42]，乙醇在醇類中的含量最高，作為碳水化合物代謝產(chǎn)物中的主要化合物，它可以防止香腸在加工過程中發(fā)生變質(zhì)。2,3-丁二醇、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇等發(fā)酵香腸中常見的醇類物質(zhì)含量在復配處理組中均顯著提高（P＜0.05）。添加植物乳桿菌CGMCC 18217可以增加醇類物質(zhì)的產(chǎn)生，進而改善香腸的風味[43]。

酸類是發(fā)酵香腸中重要且具有代表性的風味物質(zhì)之一，在酯的形成中起重要作用。酸類物質(zhì)主要來源于脂肪的降解、氨基酸脫氨反應或者由微生物的生長代謝產(chǎn)生。一般認為一些低分子質(zhì)量的有機酸如乙酸、丙酸、丁酸等是來自于微生物的作用。乙酸和己酸來自于碳水化合物的發(fā)酵，接菌處理組的乙酸含量顯著高于CK組（P＜0.05）。

烷烴類和烯烴類由于閾值較高，所以不是風味的主要貢獻者。接種復配菌株發(fā)酵處理組中β-倍半水芹烯、D-檸檬烯、β-石竹烯等烴類化合物含量顯著高于CK組（P＜0.05），烯烴類可能來自蔥姜粉、辣椒等香辛料。

2.6 發(fā)酵香腸感官評價

對發(fā)酵28 d的香腸進行感官評價，評價指標包括色澤、形態(tài)、香味和滋味，各處理組得分結果如圖8所示。其中接種復配菌株的處理組Lp10＋Ss和Lp10＋LpN＋Ss在香腸色澤、形態(tài)和滋味3 個方面都顯著高于CK組和接種單菌株的處理組Lp10（P＜0.05）。在香腸香味評分結果中，接菌處理組Lp10和Lp10＋LpN＋Ss表現(xiàn)出良好的風味，評分顯著高于CK組和Lp10＋Ss組（P＜0.05）。CK組的感官評分低于接菌處理組，可能是接菌加速了蛋白質(zhì)的水解，產(chǎn)生了更多能促進風味物質(zhì)生成的游離氨基酸，更好地形成發(fā)酵香腸的風味和滋味。此外，通過酸誘導的蛋白質(zhì)變性可以改善香腸結構。結合感官結果和上述揮發(fā)性風味分析結果，可以看出接種發(fā)酵劑顯著提高了香腸的風味感官品質(zhì)，尤其是接種復配菌株的處理組Lp10＋LpN＋Ss不僅產(chǎn)生更高含量的特征性風味物質(zhì)，并且在色澤、香味和滋味方面優(yōu)于其他的處理組。

圖8 發(fā)酵香腸感官得分Fig.8 Sensory scores of fermented sausage

3 結論

在香腸發(fā)酵成熟的過程中，接種3 株菌株的復配處理組Lp10＋LpN＋Ss能夠賦予發(fā)酵香腸更好的色澤，改善發(fā)酵香腸的質(zhì)構特性，同時降低發(fā)酵香腸的蛋白氧化程度以及增加揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類和含量，得到的成品獲得了較高的感官評價得分。說明LpN、Lp10和Ss聯(lián)合復配在改善發(fā)酵香腸品質(zhì)及風味的同時降低了蛋白氧化程度，可以作為發(fā)酵香腸的優(yōu)良發(fā)酵劑。