Bifidobacterium pseudolongum JNFEN6低聚木糖利用效率評價及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

章潔瑜，仝艷軍，楊瑞金

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

雙歧桿菌是一種桿狀、不產(chǎn)氣的革蘭氏陽性厭氧菌，它可以通過產(chǎn)生有機(jī)酸和抗菌肽抑制腸道病原體，是一類公認(rèn)安全的益生菌[1]。雙歧桿菌可以利用各種在上消化道中不被降解的膳食纖維，其中大部分是植物來源的多糖和低聚糖[2]。低聚木糖（xylooligosaccharide，XOS）是由D-木糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的線性低聚糖，其聚合度為2～12[3]。XOS是益生元的一種，存在于蜂蜜、水果、蔬菜和麥麩中[4]，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、調(diào)節(jié)血糖和改善脂質(zhì)代謝等生理功能[5-7]。研究表明，益生元可以促進(jìn)益生菌在人體中增殖、抑制有害菌生長，從而改善人體腸道微生態(tài)、提高人體免疫力[8-9]。

XOS可以使部分雙歧桿菌增殖，具有很強(qiáng)的雙歧特性，且不同的雙歧桿菌對XOS的利用也存在差異。M?kel?inen等[10]對雙歧桿菌和乳桿菌在XOS、木聚糖、低聚半乳糖等唯一碳源培養(yǎng)基上的生長特性進(jìn)行測定，結(jié)果表明，Bifidobacterium animalissubsp.lactisHN019、B.animalissubsp.lactisBB12、B.animalissubsp.lactisBi-07等乳雙歧桿菌能夠利用不同聚合度的XOS，而B.breveBb-03、B.longumsubsp.longumKC-1、B.longumsubsp.infantisDSM20088等雙歧桿菌不能有效利用XOS。Palframan等[11]對不同雙歧桿菌碳水化合物偏好性進(jìn)行探究，結(jié)果表明，B.bifidum能在XOS唯一碳源培養(yǎng)基中生長且生長趨勢優(yōu)于在木糖唯一碳源培養(yǎng)基，這種生長優(yōu)勢與體內(nèi)發(fā)酵及特殊的寡糖轉(zhuǎn)運機(jī)制有關(guān)。在細(xì)胞生理學(xué)方面，通過XOS增殖的雙歧桿菌具有木糖苷酶活性并可以產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸。Hyun等[12]從B.breveK-110中分離出一種木糖苷酶，其Km和Vmax分別為1.45 mmol/L和10.75 μmol/（min·mg）。Usta-Gorgun等[13]發(fā)現(xiàn)，用含蘭花塊莖粉末的培養(yǎng)液對不同種類的雙歧桿菌進(jìn)行發(fā)酵后，其發(fā)酵液中含有乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面，Song Angxin等[14]探究長雙歧桿菌在阿拉伯木聚糖唯一碳源培養(yǎng)基上的攝取機(jī)制，結(jié)果表明，長雙歧桿菌對阿拉伯木聚糖的攝取過程分為特定結(jié)構(gòu)被細(xì)胞表面的結(jié)合蛋白識別及通過ABC（ATP binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白直接轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中兩部分。Yang Jian等[15]研究B.adolescentis15703代謝XOS的機(jī)制，結(jié)果表明，XOS可以增強(qiáng)ABC轉(zhuǎn)運蛋白、半乳糖苷酶、木糖苷酶、葡萄糖苷酶、淀粉酶等參與碳水化合物轉(zhuǎn)運代謝的基因的表達(dá)?；陔p歧桿菌選擇性利用XOS的詳細(xì)機(jī)制仍存在研究空白，本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，對篩得的一株高效利用XOS的假長雙歧桿菌進(jìn)行研究，旨在為雙歧桿菌高效利用XOS的機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B.breveJNFE6、B.breveJNFE8、B.pseudolongumJNFE5、B.pseudolongumJNFE6、B.adolescentJNFE4、B.adolescentJNFE5、B.longumsubsp.longumJNFE2、B.longumsubsp.longumJNFE3、B.pseudocatenulatumJNFE15、B.bifidumJNFE3、B.longumsubsp.infantisJNFE3均為實驗室在前期研究中分離并保存的菌株。

MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；XOS河南益常青生物科技有限公司；乙酸、丙酸（均為色譜級）上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯酚-β-D-木糖苷 生工生物工程（上海）股份有限公司；溶菌酶（20 kU/mg）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 翌圣生物科技（上海）有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒 日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AW200SG厭氧工作站 英國Electrotek公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；酶標(biāo)儀 南京拜爾沃克公司；GC-2010PLUS氣相色譜儀 日本島津公司；H-7000FA透射電子顯微鏡 日本日立公司；LightCycler 480 II全自動熒光定量PCR系統(tǒng)美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 不同菌株利用XOS生長特性的測定

將不同菌株的菌懸液以3%的接種量接種于改良MRS培養(yǎng)基（2% XOS）中，并于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)，在培養(yǎng)24 h時測定不同菌株的OD600nm和pH值。分別以普通MRS液體培養(yǎng)基和無碳源MRS培養(yǎng)基為陽性對照和陰性對照，分析不同菌株利用XOS的差異性[16]。

1.3.2B.pseudolongumJNFE6生長曲線的測定

將菌懸液以3%的接種量接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)，每間隔4 h測定培養(yǎng)基的OD600nm和pH值。分別以普通MRS液體培養(yǎng)基和不添加葡萄糖的MRS培養(yǎng)基作為陽性對照和陰性對照，繪制生長曲線。

1.3.3 短鏈脂肪酸測定

取500 μL發(fā)酵液置于離心管中，加入40 μL體積分?jǐn)?shù)10%H2SO4溶液振蕩30 s，提取發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸。隨后加入1 mL乙醚，振蕩30 s，4 ℃、3 000×g離心5 min。向樣品中加入0.25 g無水Na2SO4，靜置15 min后取200 μL上清液用于氣相色譜分析[17]。

1.3.4 胞形態(tài)觀察

參考Booyens等[18]的方法，取1 mL菌液以3 000×g離心5 min。將離心得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）洗滌兩次，并緩慢加入4 ℃固定液進(jìn)行保存。用蒸餾水漂洗樣品，并將其置于不同梯度體積分?jǐn)?shù)（50%、70%、90%和100%）乙醇溶液中脫水，每個梯度處理15 min，最后用丙醇處理20 min，包埋劑處理后在70 ℃加熱過夜。將樣品切片后染色，用于透射電子顯微鏡觀察。

1.3.5β-木糖苷酶的活性測定

胞內(nèi)粗酶提取物的制備：稱取1 g菌泥，加入110 μL磷酸鹽緩沖液和70 μL 50 mg/mL溶菌酶溶液，37 ℃水浴30 min，獲得粗酶提取物。

對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[19]：配制濃度為1 mmol/L的對硝基苯酚溶液，用水稀釋制備系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在200 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入600 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止顯色，在405 nm波長處測定吸光度。以A405nm為縱坐標(biāo)，對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

菌體胞內(nèi)β-木糖苷酶活力測定：反應(yīng)體系包含10 μL 20 mmol/L的對硝基苯酚-β-D-木糖苷、185 μL 100 mmol/L的鄰苯二甲酸氫鉀和5 μL粗酶提取物。將混合物在65 ℃中水浴5 min后加入600 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。測定405 nm波長處的吸光度，計算對硝基苯酚產(chǎn)量。一個酶活力單位定義為在該反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

1.3.6 總RNA的提取與測序文庫構(gòu)建

選取以葡萄糖為碳源的對照組和以XOS為碳源的實驗組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)測定。將B.pseudolongumJNFE6在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)21 h。在4 ℃、8 000×g離心10 min收集細(xì)胞。收集沉淀并使用AxygenTM總mRNA提取試劑盒提取總細(xì)菌mRNA。采用TruSeqTMStranded Total RNA Library Prep Kit試劑構(gòu)建文庫。

1.3.7 轉(zhuǎn)錄組測序和功能注釋

使用Illumina HiSeq平臺進(jìn)行測序。使用DESeq2軟件對raw counts進(jìn)行統(tǒng)計分析，基于差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2且P＜0.05的條件篩選比較組間差異表達(dá)基因[20]。將差異表達(dá)基因映射到基因本體論（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫以分析其功能和途徑。

1.3.8 real-time PCR驗證

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，對關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證。通過MEGA軟件比對NCBI數(shù)據(jù)庫中雙歧桿菌共有序列并采用oligo軟件設(shè)計引物。引物序列如表1所示。取不同發(fā)酵時間的RNA樣本，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成并用于real-time PCR驗證。采用2－ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR analysis of gene expression

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。采用單因素方差分析比較組間差異，采用t檢驗進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雙歧桿菌在XOS唯一碳源培養(yǎng)基上的生長特性

通過體外厭氧發(fā)酵探究XOS作為唯一碳源對7 種雙歧桿菌增殖的影響。以XOS為唯一碳源組作為實驗組，葡萄糖為唯一碳源組作為對照組。通過發(fā)酵24 h時pH值和OD600nm的變化評價菌株利用XOS的能力。如圖1所示，不同雙歧桿菌對XOS的利用能力不同。B.breve、B.adolescent、B.longumsubsp.longum幾乎不能直接利用XOS生長，這種菌株利用XOS能力的差異可能與糖苷酶有關(guān)[21]。實驗組中B.longumsubsp.infantisJNFE3在24 h時的OD600nm為0.517，對照組B.infantisJNFE3在24 h時的OD600nm為2.417，是實驗組的4.68 倍。實驗組中B.pseudolongumJNFE6在24 h時的OD600nm為0.44，對照組B.pseudolongumJNFE6在24 h時的OD600nm為0.59，是實驗組的1.1 倍，與實驗組差異較小。B.pseudolongumJNFE6在24 h時pH值最低，為4.93；B.pseudolongumJNFE5在24 h時pH值為5.45，均低于其他菌株。B.pseudocatenulatum和B.bifidum均能利用XOS，但其OD600nm均小于0.4。由此可知，假長雙歧菌株對于XOS的利用具有特異性，其中B.pseudolongumJNFE6對XOS有較好的利用能力。Hopkins等[22]研究表明，B.adolescentisNCFB 2230、B.bifidumDSM 20082、B.longumsubsp.longumNCFB 2259對XOS利用率很低，僅B.pseudolongumNCFB 2244有明顯生長現(xiàn)象，該結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。

圖1 XOS碳源培養(yǎng)基中不同雙歧桿菌的OD600nm（A）和pH值變化（B）Fig.1 Changes in OD600nm (A) and pH (B) after 24 h culture of different Bifidobacteria strains using XOS as carbon source

2.2 B.pseudolongum JNFE6生長動力學(xué)及發(fā)酵液中短鏈脂肪酸分析

為進(jìn)一步探索B.pseudolongumJNFE6菌株利用XOS的能力，分析該菌株的生長動力學(xué)。如圖2A所示，B.pseudolongumJNFE6在葡萄糖培養(yǎng)基和XOS培養(yǎng)基中的生長過程相似，菌體均在發(fā)酵培養(yǎng)44 h時達(dá)到生長穩(wěn)定期，其OD600nm分別為0.59和0.46，且發(fā)酵體系的pH值分別為4.61和4.7。實驗組和對照組的OD600nm相差較大，而pH值卻較為接近。XOS進(jìn)入細(xì)胞后，pH值的改變與菌株代謝XOS產(chǎn)生小分子酸相關(guān)，間接說明B.pseudolongumJNFE6對XOS的代謝能力很強(qiáng)[23]。

圖2 B.pseudolongum JNFE6生長曲線（A）及其在不同底物中產(chǎn)生的總短鏈脂肪酸含量（B）Fig.2 Growth curve of B.pseudolongum JNFE6 (A) and amounts of total short-chain fatty acids produced by B.pseudolongum JNFE6 utilizing different substrates (B)

如圖2B所示，在以XOS為碳源時，其發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的總含量明顯高于以葡萄糖為碳源時；在XOS培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24 h時，發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸總質(zhì)量濃度為1 531.87 μg/mL，是葡萄糖碳源培養(yǎng)基的1.29 倍。并且在以XOS和葡萄糖為碳源發(fā)酵時，乙酸在短鏈脂肪酸中含量最高，24 h時其質(zhì)量濃度分別為1 351.12 μg/mL和867.24 μg/mL。同時，以XOS為碳源時可產(chǎn)生大量的丙酸，24 h時其質(zhì)量濃度為85.26 μg/mL，是以葡萄糖為碳源時的1.93 倍。乙酸含量的升高與雙歧桿菌獨特的代謝途徑有關(guān)[24]，該代謝能夠產(chǎn)生乙酸而不產(chǎn)生氣體，以此提高碳的轉(zhuǎn)化率[25]。

2.3 細(xì)胞形態(tài)及木糖苷酶活性分析

通過透射電子顯微鏡對不同碳源培養(yǎng)條件下菌體形態(tài)進(jìn)行觀察，如圖3所示，在XOS碳源培養(yǎng)基和葡萄糖碳源培養(yǎng)基上生長的菌株細(xì)胞膜、細(xì)胞壁均保持完整。細(xì)胞為橢圓狀，邊緣光滑完整，無運動性，表明XOS對于B.pseudolongumJNFE6不會造成損害。

圖3 B.pseudolongum JNFEN6在葡萄糖碳源（A）和XOS碳源（B）培養(yǎng)基生長后的形態(tài)Fig.3 Morphology of B.pseudolongum JNFEN6 cultured on glucose (A) or XOS (B) as carbon source

β-木糖苷酶是XOS降解的關(guān)鍵酶之一，XOS進(jìn)入細(xì)胞后被β-木糖苷酶水解為木糖[26]。B.pseudolongumJNFE6在XOS培養(yǎng)基中的β-木糖苷酶活力在24～36 h逐漸升高，然后隨發(fā)酵時間延長而降低（圖4），在36 h時β-木糖苷酶活力最高，為0.97 U/mL，是對照組的4.85 倍。葡萄糖培養(yǎng)基中的β-木糖苷酶活力較低。因此，XOS的存在可能對β-木糖苷酶活力的提高有誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖4 B.pseudolongum JNFE6中β-木糖苷酶活力在葡萄糖碳源和XOS碳源培養(yǎng)基生長期間的變化Fig.4 Changes in β-xylosidase activity during the growth of B.pseudolongum JNFE6 on glucose or XOS as carbon source

2.4 Illumina HiSeq mRNA測序及質(zhì)量評估

將Illumina HiSeq測序得到的原始圖像轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后，結(jié)果如表2所示。原始堿基錯誤率均小于0.1%，Q20和Q30均高于90%，表明該文庫堿基質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控Table 2 Quality control of transcriptome sequencing data

飽和度曲線表示絕大多數(shù)表達(dá)基因的覆蓋量，基因覆蓋率分析評估所得序列的基因分布程度。如圖5所示，飽和度總體質(zhì)量較高，測序能覆蓋絕大多數(shù)的表達(dá)基因。由圖6可知，測序所得序列在基因上均勻分布，無偏向性。

圖5 XOS組（A～C）及葡萄糖組（D～F）的測序飽和度曲線Fig.5 Sequencing saturation curves of XOS (A-C) and glucose groups (D-F)

圖6 測序覆蓋度Fig.6 Sequencing coverage analysis

2.5 差異表達(dá)基因分析

菌體在對數(shù)生長中期產(chǎn)生的多糖及次級代謝物較少，因此選擇培養(yǎng)時間為21 h的總RNA構(gòu)建cDNA文庫。如圖7所示，對照組有1 832 個表達(dá)基因，實驗組有1 840 個表達(dá)基因。兩組表達(dá)基因共有數(shù)為1 831，表現(xiàn)出99.57%的相似性。使用DESeq2進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。如圖7所示，共有297 個差異表達(dá)基因，其中有136 個上調(diào)基因，占總差異表達(dá)基因的45.79%；161 個下調(diào)基因，占總差異表達(dá)基因的54.21%。

圖7 差異表達(dá)基因樣本間Venn圖（A）及火山圖（B）Fig.7 Venn diagram (A) and volcano map (B) of differentially expressed genes between samples

2.6 轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)全局分析

通過GO注釋分析對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋。如圖8所示，差異表達(dá)基因分別屬于生物過程、細(xì)胞成分、分子功能3 個部分。在生物過程中，主要包括碳水化物代謝、翻譯、跨膜運輸、糖酵解過程，其占比分別為0.033、0.026、0.020、0.013。在細(xì)胞成分中，主要包括膜組成、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、核糖體，其占比分別為0.157、0.057、0.046、0.020。在分子功能中，主要包括ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、水解酶活性、金屬離子結(jié)合等功能，其占比分別為0.067、0.043、0.036、0.023。其中，基因占比前3的功能分別是細(xì)胞膜組成（15.7%）、ATP結(jié)合（6.7%）和細(xì)胞質(zhì)膜（5.7%）。其中，細(xì)胞膜組成中上調(diào)倍數(shù)最多的5 個基因包含2 個ABC轉(zhuǎn)運蛋白滲透酶相關(guān)基因（msmG、msmF）、2 個結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因（comEA、comEC）和1 個系統(tǒng)內(nèi)膜組分家族蛋白相關(guān)基因（lplB）。下調(diào)倍數(shù)最多的5 個基因分別編碼ABC轉(zhuǎn)運滲透酶蛋白（gguB）、ATP結(jié)合蛋白（ecfTA）、膜反應(yīng)蛋白（yeaQ）、DUF1295結(jié)構(gòu)域蛋白（ymgE）和FtsX滲透酶蛋白（lolE）。

圖8 GO注釋分析Fig.8 GO annotation analysis

通過KEGG顯著性富集進(jìn)一步探究差異表達(dá)基因參與的途徑。與葡萄糖利用途徑相比，差異表達(dá)基因主要富集在ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、糖酵解、甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝及戊糖磷酸途徑等過程，分別富集到16、9、7、12、5 個差異表達(dá)基因（圖9）。ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中，13 個基因表達(dá)存在顯著性差異：msmE（編碼胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白），lplB（編碼轉(zhuǎn)運系統(tǒng)依賴結(jié)合蛋白），lplA（編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物結(jié)合蛋白），efrB（編碼ATP結(jié)合蛋白），znuA（編碼金屬結(jié)合蛋白），msmG、msmF、lplC、ssuC、lplB（編碼ABC轉(zhuǎn)運滲透酶蛋白）顯著上調(diào)；同時，3 個編碼ABC轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的基因在XOS干預(yù)后顯著下調(diào)。

圖9 KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment analysis

2.7 XOS轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)差異表達(dá)基因

轉(zhuǎn)錄組中涉及XOS轉(zhuǎn)運主要差異表達(dá)基因如表3所示。雙歧桿菌主要通過ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、PEP-PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、MFS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)攝取碳水化合物。ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要包括糖特異性溶質(zhì)結(jié)合蛋白、滲透酶和ATP酶[27]。B.pseudolongumJNFEN6經(jīng)過XOS培養(yǎng)后，多個ABC轉(zhuǎn)運滲透酶基因上調(diào)。其中，msmG、msmF、lplC、ssuC顯著表達(dá)，F(xiàn)C值分別為26.884、16.746、4.302和3.596。同時，底物結(jié)合蛋白基因msmE、lplA（FC值分別為37.685和2.92）和ATP結(jié)合蛋白基因lnrL、efrB、msmX（FC值分別為2.834、2.086、1.771）均有不同程度的上調(diào)趨勢。Webb等[28]報道，多糖代謝轉(zhuǎn)運蛋白MsmEFGK屬于ABC超家族，其中msmK編碼ATP酶，msmE編碼溶質(zhì)結(jié)合蛋白，msmF和msmG為膜蛋白。因此，多糖代謝轉(zhuǎn)運蛋白MsmEFGK可能參與了XOS的轉(zhuǎn)運過程。在其他轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中，編碼MFS轉(zhuǎn)運體的相關(guān)基因araJ、lacY、mef、ydjE（FC值分別為2.1、1.365、1.268、1.22）表達(dá)上調(diào)而PTS代謝系統(tǒng)相關(guān)基因bglF下調(diào)，F(xiàn)C值為0.917。戚家明等[29]報道，P.acidilacticiBCC-1和B.lactisB1-04僅通過ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運XOS，而在W.confusaXU1菌株中MFS轉(zhuǎn)運蛋白參與XOS運輸，且MFS轉(zhuǎn)運蛋白利用質(zhì)子動力驅(qū)動轉(zhuǎn)運過程。因此，B.pseudolongumJNFEN6可能主要通過ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和MFS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)攝取XOS。

表3 XOS轉(zhuǎn)運及代謝相關(guān)基因Table 3 XOS transport and metabolism-related genes

XOS是由木糖基通過β-1,4糖苷鍵連接組成的低聚物。糖苷水解酶（EC 3.2.1.x）是一組廣泛的酶，可以水解兩種或多種碳水化合物之間的糖苷鍵[30]。轉(zhuǎn)錄組中涉及碳水化合物代謝主要差異表達(dá)基因如表3所示。與對照組相比，實驗組中編碼GH43糖苷水解酶家族的基因（xynB）顯著上調(diào)，其FC值為26.729。同時，XOS代謝相關(guān)水解酶xylA、xylB、abnA基因表達(dá)顯著上調(diào)，其FC值分別為48.168、20.318和2.719。通過KEGG數(shù)據(jù)庫查詢，XOS在GH43家族水解酶（xynB）的作用下水解為木糖，隨后在木糖異構(gòu)酶（xylA）和木酮糖激酶（xylB）作用下轉(zhuǎn)化為5-磷酸-木酮糖。Zhao Lei等[31]對Pediococcus acidilacticiBCC-1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，XOS利用相關(guān)酶包括木聚糖酶、木糖苷酶、木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶。因此，水解酶在XOS代謝過程中具有比較重要的作用。

araA和araD基因的FC值分別為2.347和4.311，它們促進(jìn)了D-木酮糖-5-磷酸的生成。同時，D-木酮糖-5-磷酸被進(jìn)一步代謝為乳酸和乙酸。Pontonio等[32]研究L.rossiaeDSM 15814利用XOS、木聚糖、D-木糖等的能力發(fā)現(xiàn)，L.rossiaeDSM 15814中存在與XOS代謝相關(guān)的ara基因簇。其中，araA編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，araD編碼磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶。這兩個基因共同參與L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖-5-磷酸的代謝途徑，與本研究結(jié)果趨勢一致。

雙歧桿菌采用“雙歧分流”的方式進(jìn)行代謝。在該種代謝途徑中，XOS被轉(zhuǎn)化為己糖發(fā)酵途徑的中間體，并最終轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸和其他有機(jī)化合物[33]。轉(zhuǎn)錄組中涉及短鏈脂肪酸生成的主要差異表達(dá)基因如表3所示。許多腸道細(xì)菌可以通過乙酰輔酶A由丙酮酸生成乙酸，同時也可以通過乳酸由丙酮酸生成乙酸[34]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，乙酸轉(zhuǎn)移酶（pta）和乙酸激酶（ackA）參與乙酰輔酶A和乙酸的轉(zhuǎn)化并顯著下調(diào)，而參與乳酸和乙酸轉(zhuǎn)化的乳酸脫氫酶（ldh）顯著上調(diào)。乳酸脫氫酶的較高表達(dá)說明B.pseudolongumJNFE6可能更加傾向于通過乳酸產(chǎn)生乙酸。細(xì)菌主要通過琥珀酸途徑產(chǎn)生丙酸。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ppc）在XOS干預(yù)后下調(diào)，F(xiàn)C值為0.817。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶受磷酸烯醇丙酮酸羧激酶控制。琥珀酸鹽是丙酸鹽的前體，在磷酸烯醇式丙酮酸激酶被抑制的條件下積累。因此，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶相關(guān)基因的下調(diào)有利于丙酸的生成[35]。在丁酸轉(zhuǎn)化過程中，3-羥基丁酰輔酶A脫水酶（HACD）上調(diào)，F(xiàn)C值為1.344。丁酸由丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化而來，3-羥基丁酰輔酶A脫水酶促進(jìn)了3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為巴豆酰輔酶A，從而進(jìn)一步生成丁酰輔酶A，有利于丁酸的生成。

2.8 real-time PCR驗證

在B.pseudolongumJNFE6發(fā)酵培養(yǎng)24、36、48 h后，對FC值分別為48.168和26.729的xylA和xynB基因進(jìn)行real-time PCR驗證。結(jié)果表明，擴(kuò)增曲線僅有一個尖峰，反應(yīng)產(chǎn)物單一。

如圖10所示，xylA基因在不同發(fā)酵時間的相對表達(dá)量分別為8.15、18.6和13.2。xynB基因在不同發(fā)酵時間的相對表達(dá)量分別為7.8、13.1和10.8?；虮磉_(dá)顯著上調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。因此，轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)量具有可靠性。

圖10 real-time PCR驗證Fig.10 Real-time PCR verification

3 結(jié)論

首先，基于生長動力學(xué)、木糖苷酶活力、短鏈脂肪酸、透射電子顯微鏡等從多維度探究B.pseudolongumJNFE6高效利用XOS的機(jī)制。其次，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)對XOS干預(yù)后B.pseudolongumJNFE6差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，有136 個上調(diào)基因和161 個下調(diào)基因。這些基因主要集中在XOS的轉(zhuǎn)運和代謝過程中。XOS轉(zhuǎn)運過程中，ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和MFS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)基因顯著上調(diào)；XOS代謝過程中，水解酶相關(guān)基因和乙酸、丙酸、丁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)顯著變化。最后，通過real-time PCR驗證了轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。