基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的痹祺膠囊治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的配伍規(guī)律研究

李 新 ，韓彥琪 ，張祥麒，許 浚 ，王春芳 , ，王 磊，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評(píng)價(jià)與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

4.天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

5.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

6.津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300193

中藥復(fù)方物質(zhì)組成復(fù)雜，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的闡釋帶來(lái)很大困難，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起為中藥復(fù)方機(jī)制的研究提供了一個(gè)全新的角度，借助網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)中藥的作用機(jī)制可從新的角度詮釋中醫(yī)理論。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)及多向藥理學(xué)等學(xué)科理論，運(yùn)用組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)可視化等技術(shù)揭示藥物、基因、疾病、靶點(diǎn)之間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的學(xué)科，可在此基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)藥物的藥理學(xué)機(jī)制[1]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從藥物、靶點(diǎn)與疾病相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物、靶點(diǎn)與疾病的關(guān)系，應(yīng)用于中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，反映和闡釋中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用關(guān)系[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥靶點(diǎn)研究中應(yīng)用廣泛，且對(duì)于闡釋中藥作用機(jī)制具有較大的指導(dǎo)意義[3]。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”，中醫(yī)認(rèn)為痹證的發(fā)生，是因正虛為本，外邪入侵所致，痹祺膠囊具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效，方中黨參、白術(shù)、茯苓健脾、益氣養(yǎng)血，丹參、三七、川芎、牛膝、地龍活血化瘀、通絡(luò)止痛，馬錢(qián)子、甘草配伍散結(jié)消腫、通絡(luò)止痛，10 味藥配伍既可補(bǔ)虛固本，又可活血通絡(luò)、止痛，針對(duì)痹證對(duì)因?qū)ΠY治療。因此本研究將痹祺膠囊按照功能藥味分組，在前期功能配伍實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度，進(jìn)一步闡釋痹祺膠囊配伍合理性，為進(jìn)一步作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

ChemBio Office 2014；TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）；CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://ctdbase.org）；PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）；TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab.net/ttd/）；DisGeNet 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.disgenet.org/home/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）；PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（ https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；UNIPROT 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）；KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）；STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)（ http://string-db.org/ ）；Omicsbean 在線分析軟件（http://www.omicsbean.cn/）；Omicshare Tools 在線制圖軟件（https://www.omicshare.com）；Cytoscape3.6.0 軟件。

2 方法

2.1 目標(biāo)化合物的選取

在前期對(duì)痹祺膠囊化學(xué)物質(zhì)組及血中移行成分研究的基礎(chǔ)上，以10 味藥材的各結(jié)構(gòu)類(lèi)型代表成分為主，選擇痹祺膠囊中各藥材的代表性成分為后續(xù)研究的目標(biāo)化合物，共選取了39 個(gè)化合物為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

益氣養(yǎng)血組包括黨參中的3 個(gè)成分（黨參炔苷、黨參苷I、黨參苷II）；白術(shù)中的4 個(gè)成分（白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、蒼術(shù)酮）；茯苓中的4 個(gè)成分（土莫酸、茯苓酸、去氫土莫酸、茯苓酸B），化合物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 益氣養(yǎng)血組化合物信息Table 1 Compound information of supplementing qi and nourishing blood herbs

活血通絡(luò)組包括丹參中的7 個(gè)成分（丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參新酮）；三七中的4 個(gè)成分（人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷CK）；川芎中的4 個(gè)成分（阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I）；牛膝中的4 個(gè)成分（牛膝皂苷II、牛膝皂苷IV、25S-牛膝甾酮、20-羥基蛻皮激素）；地龍中的1 個(gè)成分（次黃嘌呤），化合物詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 活血通絡(luò)組化合物信息Table 2 Compound information of promoting blood circulation and dredging collaterals herbs

抗炎鎮(zhèn)痛組包括馬錢(qián)子中的5 個(gè)成分（士的寧、馬錢(qián)子堿、番木鱉苷酸、咖啡酸、奎寧酸）；甘草中的3 個(gè)成分（甘草苷、異甘草素、甘草次酸），化合物詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

2.2 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)選取

以“類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”為關(guān)鍵詞，從OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNet 數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)，并借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)校正其靶標(biāo)蛋白為官方名。

2.3 各拆方組靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及分析

將3 個(gè)拆方組中的化合物英文名稱(chēng)或CAS 號(hào)輸入TCMSP、CTD 等數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選與該方適應(yīng)癥密切相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)名稱(chēng)。然后，把蛋白名稱(chēng)輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得其相應(yīng)靶點(diǎn)的人源的基因名稱(chēng)。將整合的基因?qū)隨TRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）關(guān)系數(shù)據(jù)，通過(guò)將數(shù)據(jù)表導(dǎo)入Cytoscape 軟件，并進(jìn)行Network Analyzer 分析，篩選得到各拆方組的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.4 各拆方組靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用Omicsbean 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)基因本體（gene ontology，GO）分析，包括細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及生物過(guò)程（biological process，BP）。同時(shí)在STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中可得到與蛋白靶點(diǎn)相關(guān)的信號(hào)通路，通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)得到的通路進(jìn)行注釋分析。

2.5 各拆方組作用特點(diǎn)分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)查閱數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)，對(duì)痹祺膠囊各拆方組進(jìn)行作用特點(diǎn)分析，構(gòu)建藥材-化合物、化合物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-功效、靶點(diǎn)-通路關(guān)系，將其對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件中，構(gòu)建痹祺膠囊各拆方組“藥材-化合物-靶點(diǎn)-通路-功效”網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)整合網(wǎng)絡(luò)分析，探究痹祺膠囊各拆方組通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制，并闡釋其配伍規(guī)律。

3 結(jié)果

3.1 益氣養(yǎng)血組作用特點(diǎn)分析

痹祺膠囊益氣養(yǎng)血組由黨參、茯苓、白術(shù)組成，本研究選取了黨參、茯苓、白術(shù)中包含黨參炔苷、黨參苷I、黨參苷II、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、蒼術(shù)酮、土莫酸、茯苓酸、去氫土莫酸、茯苓酸B 的11 個(gè)化合物，通過(guò)TCMSP、TCD、PharmMapper 等數(shù)據(jù)庫(kù)得到了67 個(gè)靶點(diǎn)。將67 個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到了蛋白間相互作用關(guān)系（圖1-A），將PPI 核心靶點(diǎn)投射至OmicsBean 在線分析軟件中對(duì)益氣養(yǎng)血組進(jìn)行功能注釋分析（圖2-A）和KEGG 通路分析，并經(jīng)Omicshare 工具對(duì)前20 條通路進(jìn)行可視化（圖3-A）。最后，通過(guò)Cytoscape 軟件，得到藥材-化合物-靶點(diǎn)-通路-功效網(wǎng)絡(luò)（圖4-A）。

圖2 益氣養(yǎng)血組 (A)、活血通絡(luò)組 (B)、抗炎止痛組 (C) 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 功能分析Fig.2 GO function analysis of key targets in supplementing qi and nourishing blood group (A), promoting blood circulation and dredging collaterals group (B), and anti-inflammatory and analgesic group (C)

圖3 益氣養(yǎng)血組 (A)、活血通絡(luò)組 (B)、抗炎止痛組 (C) 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of key targets in supplementing qi and nourishing blood group (A), promoting blood circulation and dredging collaterals group (B), and anti-inflammatory and analgesic group (C)

圖4 益氣養(yǎng)血組 (A)、活血通絡(luò)組 (B)、抗炎止痛組 (C) 的“藥材-化合物-靶點(diǎn)-通路-功效”網(wǎng)絡(luò)Fig.4 “Medicinal material-compound-target-pathway-efficiency” network of supplementing qi and nourishing blood group(A), promoting blood circulation and dredging collaterals group (B), and anti-inflammatory and analgesic group (C)

對(duì)核心靶點(diǎn)分析結(jié)果顯示，處于益氣養(yǎng)血組PPI 網(wǎng)絡(luò)中心的白蛋白（albumin，ALB，度值30）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF，度值28）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL6，度值26）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA，度值23）、IL1B（度值22）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3，度值 22）、造血前列腺素合成酶 D（hematopoietic prostaglandin D synthase，HPGDS，度值19）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1，度值19）、MAPK14（度值19）、MAPK8（度值19）、雄激素受體（androgen receptor，AR（度值15）、β2 腎上腺素能受體（Beta-2 adrenergic receptor，ADRB2，度值12）等擁有較多蛋白間相互作用，提示益氣養(yǎng)血組藥材藥效機(jī)制可能與這些蛋白相關(guān)性較大。

將靶點(diǎn)投射于String 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到40 條通路，經(jīng)分析相關(guān)通路過(guò)程發(fā)現(xiàn)，主要涉及骨髓造血系統(tǒng)、免疫抗炎、骨形成與代謝、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)系統(tǒng)等方面，說(shuō)明益氣養(yǎng)血藥材可能作用于ALB、TNF、IL6、CASP3、MAPK1、MAPK14、MAPK8、AR、ADRB2、絲氨酸/蘇氨酸激酶 pim1（serine/threonine-protein kinase pim-1，PIM1）、FKBP 脯氨酸異構(gòu)酶1A（peptidyl-prolylcis-transisomerase FKBP1A，F(xiàn)KBP1A）、醛固酮類(lèi)還原酶家族1 成員C3（aldo-keto reductase family 1 member C3，AKR1C3）等蛋白，進(jìn)而通過(guò)T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路、造血細(xì)胞譜系、催乳素信號(hào)通路等調(diào)控骨髓造血細(xì)胞增殖、凋亡，維持骨髓造血微環(huán)境；通過(guò)破骨細(xì)胞分化、MAPK 信號(hào)通路、環(huán)磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、黏著斑、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路等通路調(diào)控骨形成與代謝，抑制血管翳形成，維持關(guān)節(jié)微環(huán)境穩(wěn)定；通過(guò)NOD 樣受體信號(hào)通路、Th1 和Th2 細(xì)胞分化等通路調(diào)控免疫過(guò)程等發(fā)揮益氣養(yǎng)血作用。

3.2 活血通絡(luò)組作用特點(diǎn)分析

痹祺膠囊活血通絡(luò)組由丹參、三七、川芎、川芎和地龍組成，本研究選取了丹參、三七、川芎、白術(shù)和地龍中包含丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、丹參酮IIA、人參皂苷Rg1、阿魏酸、25S-牛膝甾酮、20-羥基蛻皮激素、牛膝皂苷II、次黃嘌呤等在內(nèi)的20 個(gè)化合物，通過(guò)TCMSP、TCD、PharmMapper 等數(shù)據(jù)庫(kù)得到了117 個(gè)靶點(diǎn)。將117 個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到了蛋白間相互作用關(guān)系（圖1-B），將PPI 核心靶點(diǎn)投射至OmicsBean 在線分析軟件中對(duì)活血通絡(luò)組進(jìn)行功能注釋分析（GO 分析，圖2-B）和KEGG 通路富集分析，并經(jīng)Omicshare工具對(duì)前20 條通路進(jìn)行可視化（圖3-B）。最后，通過(guò)Cytoscape 軟件，得到化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖4-B）。

對(duì)核心靶點(diǎn)分析結(jié)果顯示，處于活血通路組PPI 網(wǎng)絡(luò)中心的AKT1（度值86）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9，度值79）、趨化因子配體8（chemokine ligand 8，CXCL8，度值76）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53，度值76）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N1，度值75）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activators of transcription 3，STAT3，度值75）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（proto-oncogene tyrosineprotein kinase Src，SRC，度值74）、C-C 基序趨化因子（C-C motif chemokine 2，CCL2，度值73）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR，度值73）、MMP2（度值64）等擁有較多蛋白間相互作用，提示活血通絡(luò)組藥材藥效機(jī)制可能與這些蛋白相關(guān)性較大。

將靶點(diǎn)投射于String 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到77 條通路，經(jīng)分析相關(guān)通路過(guò)程發(fā)現(xiàn)，涉及血液微循環(huán)、凝血和纖溶系統(tǒng)、免疫抗炎、血管內(nèi)皮損傷、骨代謝等方面，說(shuō)明活血通絡(luò)藥材可能作用于凝血因子Ⅲ（coagulation factor Ⅲ，F(xiàn)3）、FN1、金屬羧肽酶CPX1（probable carboxypeptidase X1，CPX1）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、細(xì)胞間黏附因子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）、磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 3-激酶催化亞單位 γ 亞型（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform，PIK3CG）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）等蛋白，通過(guò)流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化代謝通路、血小板激活、醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic 3′,5′-monophosphate，GMP）-蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）信號(hào)通路等通路調(diào)控血流動(dòng)力學(xué)、凝血系統(tǒng)等過(guò)程；通過(guò)PI3K-Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、血管平滑肌收縮等通路調(diào)控血管內(nèi)皮增生、血管收縮等過(guò)程；通過(guò)IL-17 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等通路調(diào)控淋巴細(xì)胞分化、抑制炎癥因子釋放等發(fā)揮抗免疫炎癥、軟骨保護(hù)等作用。

3.3 抗炎鎮(zhèn)痛組作用特點(diǎn)分析

痹祺膠囊抗炎鎮(zhèn)痛組由馬錢(qián)子和甘草組成，本研究選取了馬錢(qián)子、甘草中包含士的寧、馬錢(qián)子堿、甘草苷、甘草次酸在內(nèi)的8 個(gè)化合物，通過(guò)TCMSP、TCD、PharmMapper 等數(shù)據(jù)庫(kù)得到了180 個(gè)靶點(diǎn)。將180 個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到了蛋白間相互作用關(guān)系（圖1-C），將PPI 核心靶點(diǎn)投射至OmicsBean 在線分析軟件中對(duì)抗炎鎮(zhèn)痛組進(jìn)行功能注釋分析（GO 分析，圖2-C）和KEGG 通路分析，并經(jīng)Omicshare 工具對(duì)前20 條通路進(jìn)行可視化（圖3-C）。最后，通過(guò)Cytoscape 軟件，得到化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖4-C）。

對(duì)核心靶點(diǎn)分析結(jié)果顯示，處于抗炎鎮(zhèn)痛組PPI 網(wǎng)絡(luò)中心的TNF（度值124）、AKT1（度值123）、IL6（度值122）、TP53（度值114）、IL1B（度值111）、VEGFA（度值104）、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2，度值95）、CCL4（度值47）、CCL3（度值47）等擁有較多蛋白間相互作用，提示抗炎鎮(zhèn)痛組藥材藥效機(jī)制可能與這些蛋白相關(guān)性較大。

將靶點(diǎn)投射于String 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到77 條通路，經(jīng)分析相關(guān)通路過(guò)程發(fā)現(xiàn)，涉及中樞鎮(zhèn)痛、外周抗炎鎮(zhèn)痛、免疫炎癥調(diào)節(jié)、骨代謝平衡等方面，說(shuō)明抗炎鎮(zhèn)痛藥材可能作用于TNF、IL6、PTGS2、OPRM1、OPRD1 等蛋白，通過(guò)Toll 樣受體信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、血清素能突觸、長(zhǎng)時(shí)程抑制、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、趨化因子信號(hào)通路等通路抑制中樞敏化調(diào)控中樞鎮(zhèn)痛過(guò)程；通過(guò)C 型凝集素受體信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、FcεRI 信號(hào)通路、花生四烯酸代謝等抑制炎癥因子釋放及外周疼痛感受器敏化調(diào)控外周抗炎鎮(zhèn)痛過(guò)程；通過(guò)IL-17信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、抗原加工和呈遞、cGMP-PKG 信號(hào)通路等通路抑制抗原遞呈、滑膜中炎癥細(xì)胞募集、血管翳形成、軟骨破壞等過(guò)程發(fā)揮免疫抗炎、骨保護(hù)等作用。

4 討論

中醫(yī)對(duì)復(fù)雜疾病的辨證施治，本表結(jié)合，強(qiáng)調(diào)整體性，這一思想決定了中藥復(fù)方的組方原則，中藥復(fù)方發(fā)揮藥理作用，具有多組分、多靶點(diǎn)的綜合優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于復(fù)方配伍機(jī)制的本質(zhì)認(rèn)識(shí)和微觀闡述仍然比較模糊。痹祺膠囊由馬錢(qián)子、黨參、白術(shù)等10 味藥物組成，諸藥配伍具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕、活血止痛的作用，切合痹證本需不固，外邪留滯致痰瘀水濕的病因病機(jī)。

研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）可通過(guò)直接接觸造血細(xì)胞或分泌多種調(diào)控造血細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖、分化及凋亡[4]。BMSCs 本身的增殖、凋亡受到如紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、集落形成刺激因子（colony-stimulating factor，CSF）及IL-3、AKR1C3 等多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，在實(shí)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)的信號(hào)通路中，PI3K-Akt-FoxO 信號(hào)通路、Caspase-3 細(xì)胞凋亡通路、Janus 激酶（Janus kinase，JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路等具有重要作用。四物湯可能通過(guò)激活PI3K-Akt-FoxO信號(hào)通路，下調(diào)Bim基因表達(dá)，從而抑制小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡[5]。骨形成蛋白表達(dá)于骨髓造血微環(huán)境，在造血調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、BMP4和BMP7 參與誘導(dǎo)造血細(xì)胞的分化，是重要的誘血因子，主要通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路、Smad 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等[6]，促進(jìn)EPO-R的釋放和下調(diào)內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄因子GATA-2（endothelial transcription factor GATA-2，GATA-2）而促進(jìn)造血[7]。活化的淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，研究發(fā)現(xiàn)，再生障礙性貧血患者造血負(fù)調(diào)控處于主導(dǎo)地位[8]，IL-17 等負(fù)性細(xì)胞因子分泌的減少，可以促進(jìn)骨髓造血功能的恢復(fù)。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特征主要是炎癥細(xì)胞向滑膜關(guān)節(jié)浸潤(rùn)增多，最終導(dǎo)致軟骨和骨骼損傷，Th1 和Th17 T 細(xì)胞亞群是炎癥滑膜組織中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞類(lèi)型。Th17 細(xì)胞主要分泌IL-17，能夠誘導(dǎo)發(fā)生自身免疫性疾病，激活的T 淋巴細(xì)胞可以引起造血干細(xì)胞的過(guò)度凋亡[9]，IL-17 可進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌高水平的TNF-α、IL-6 和IL-8 等，從而抑制造血祖細(xì)胞的增殖[10-11]。以上的研究表明造血微環(huán)境、免疫細(xì)胞的激活、細(xì)胞因子的釋放等均是造成患者正氣虛弱的原因。本研究發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)血組可維持骨髓造血微環(huán)境、調(diào)控骨形成與代謝和免疫過(guò)程等發(fā)揮益氣養(yǎng)血作用。

痰濁、瘀血、水濕在痹證的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血液及關(guān)節(jié)局部的纖凝異常是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎一個(gè)重要病理特征[12]。血小板聚集性增高是血瘀證臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。研究表明，在血瘀證形成過(guò)程中，血小板異?；罨?，血小板平均體積、血小板體積分布寬度較正常人明顯增高，使血液處于“高聚”狀態(tài)[14]。談冰等[15]認(rèn)為機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期慢性炎癥導(dǎo)致細(xì)胞因子失衡及免疫紊亂，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而直接或間接激活凝血-纖溶系統(tǒng)，會(huì)導(dǎo)致微循環(huán)障礙的發(fā)生。RA 滑膜的各類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、TNF-α、IL-17 等，其中TNF-α、IL-17 等炎癥因子的升高，引起NF-κB 信號(hào)通路異?；罨?，而活化后的NF-κB 信號(hào)通路又可以引起IL-1、TNF-α 及VEGF 的大量釋放，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，激活凝血系統(tǒng)并抑制纖溶，促使血管翳的形成。賈杰芳等[16]發(fā)現(xiàn)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清細(xì)胞間黏附分子-1 （ intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）異常升高，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而加劇血瘀的發(fā)生?；ぶ挟惓１磉_(dá)VEGF促進(jìn)血管生成和誘導(dǎo)血管發(fā)生，形成血管翳，引起骨、軟骨和關(guān)節(jié)的破壞，導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)功能喪失。PI3K-Akt 作為VEGF 的下游信號(hào)通路，可經(jīng)下游分子mTOR 和Fos 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生，參與血瘀狀態(tài)的維持[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)驗(yàn)證丹參中丹參素、丹參酮類(lèi)成分具有抗血小板聚集、抗凝血、鈣拮抗等作用[18-19]。三七中的人參三醇皂苷能降低腦血管阻力，增加腦血流量，對(duì)血壓無(wú)影響，抑制對(duì)二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集，從而抑制大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓的形成。川芎中的有效成分藁本內(nèi)酯、阿魏酸等具有抗血小板聚集、延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間等作用[20]。牛膝具有顯著降低血小板聚集性、改善紅細(xì)胞變形能力、降低纖維蛋白原水平的作用[21-22]。地龍中蚓激酶能降低血液黏稠度，改善微循環(huán)，可使體外血栓形成的時(shí)間延長(zhǎng)，既抗凝又不影響止血，有利于血栓的防治[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，活血通絡(luò)組可調(diào)控血流動(dòng)力學(xué)、凝血系統(tǒng)，抑制血管增生，抑制炎癥因子釋放等發(fā)揮活血通絡(luò)、止痛的作用。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中，關(guān)節(jié)軟骨的退化、破壞最為重要的原因之一就是大量炎癥因子（TNFα、IL-1、IL-6、IL-17、IL-15 等）的侵襲，可促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生、軟骨細(xì)胞凋亡等，進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)軟骨。IL-1β 在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎啟動(dòng)中發(fā)揮較為關(guān)鍵的作用，IL-1β 可促進(jìn)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、膠原酶的釋放等。IL-6 不僅能促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的增殖和活化，誘導(dǎo)肝臟合成急性反應(yīng)蛋白及類(lèi)風(fēng)濕因子，從而促使炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。IL-17與受體結(jié)合后，通過(guò)MAPK 和NF-κB 等途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[24]，其中NF-κB 信號(hào)通路的激活使脊髓內(nèi)炎癥反應(yīng)加重、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量増加、離子通道功能改變，脊髓背角內(nèi)炎癥的持續(xù)存在，甚至?xí)?dǎo)致神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)結(jié)構(gòu)性的改變，最終產(chǎn)生慢性、難治性和神經(jīng)病理性疼痛[25]。中樞μ-阿片受體系統(tǒng)與降低對(duì)疼痛刺激的疼痛反應(yīng)有關(guān)。腦啡肽是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的一種多肽激素，屬內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)，存在于大腦功能區(qū)的腦啡肽具有廣泛的鎮(zhèn)痛作用[26]。中縫大核內(nèi)5-羥色胺受體2A（5-hydroxytryptamine receptor 2A，5-HT2A）主要分布在非5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）神經(jīng)元，且隨外周炎癥的發(fā)展，5-HT2A 的合成增加。外周5-HT 通過(guò)激活5-HT2A 參與了角叉菜膠的炎癥痛，阻斷5-HT2A 會(huì)內(nèi)源性阿片肽及阿片受體表達(dá)量的升高，從而發(fā)揮一定的鎮(zhèn)痛作用[27]。研究發(fā)現(xiàn)，馬錢(qián)子堿能抑制外周炎癥組織PGE2的釋放，抑制大鼠血漿5-HT、6-酮前列腺素F1a 與血栓烷素炎癥介質(zhì)的釋放，降低感覺(jué)神經(jīng)末梢對(duì)痛覺(jué)敏感性及抑制鈣激活鉀離子通道發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[28-29]，還可增加大腦功能區(qū)腦啡肽的含量而鎮(zhèn)痛[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗炎鎮(zhèn)痛組可通過(guò)抑制免疫細(xì)胞的激活、炎癥因子釋放、抑制中樞和外周敏化發(fā)揮（除濕）抗炎鎮(zhèn)痛的作用。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法基于配伍理論分析了痹祺膠囊3 個(gè)功能拆方組的作用靶點(diǎn)及途徑（圖5），3 組之間既有共同的作用靶點(diǎn)和通路，又各有側(cè)重，協(xié)同發(fā)揮治療RA 的效果，結(jié)合前期對(duì)痹祺膠囊的拆方研究發(fā)現(xiàn)，痹祺膠囊中黨參、白術(shù)、茯苓可提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的外周血細(xì)胞數(shù)量、EPO 含量及脾臟T 細(xì)胞分型，主要發(fā)揮益氣養(yǎng)血作用，丹參、三七、川芎、牛膝和地龍可抑制微循環(huán)障礙大鼠血液流速、全血黏度，主要發(fā)揮活血化瘀作用，馬錢(qián)子、甘草可抑制炎癥和疼痛反應(yīng)，初步闡述了痹祺膠囊的配伍規(guī)律，進(jìn)一步顯示了中醫(yī)治療疾病的整體觀念。

圖5 痹祺膠囊各拆方組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Network analysis of pharmacological characteristics of BiQi Capsule and cits disassembled formulas

但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)畢竟基于數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)，在痹祺膠囊配伍機(jī)制的研究中具有一定的局限性，后續(xù)仍然需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞/分子水平進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突