基于功能模型的痹祺膠囊配伍規(guī)律研究

王春芳 ，李 新, ，張祥麒，姚鵬飛 ，韓彥琪, ，王 磊，徐 旭, ，許 浚, ，趙專友, ，張鐵軍, *，劉昌孝, *

1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

2.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標志物重點實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國重點實驗室，天津 300462

4.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300462

5.天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

6.津藥達仁堂集團股份有限公司，天津 300193

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性自身免疫疾病，以關(guān)節(jié)腫痛、關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)進行性破壞為特征。RA 幾乎見于各個地區(qū)和種族，2019 年患病人數(shù)約占世界總?cè)丝诘?.0%，多發(fā)于中老年人[1]。風濕、RA 均屬中醫(yī)學“痹證”范疇。中醫(yī)認為，痹證的發(fā)生，“皆因體虛，腠理空疏，受風寒濕氣而成”，可見痹證的發(fā)生是由于機體氣血失衡、內(nèi)臟衰弱，風寒濕熱等襲擊肌膚表層、經(jīng)絡等，內(nèi)外兼侵的結(jié)果。針對如此復雜的疾病而言，藥物單用顯然無法應對復雜的疾病狀態(tài)，并且難以避免不良反應的發(fā)生，因此往往需要將2 種以上的藥物配合使用，即中藥復方。中藥復方集中體現(xiàn)了中醫(yī)理論的治則治法、配伍理論和組方原則，其中中藥配伍理論在辨證立法的基礎上，以法立方、以方遣藥的系統(tǒng)理論和實踐，體現(xiàn)了中醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢。痹祺膠囊由馬錢子、黨參、白術(shù)等10 味藥材組成，其處方來源于華佗所創(chuàng)“一粒仙丹”[2]，具有益氣養(yǎng)血、祛風除濕、活血止痛的作用，體現(xiàn)了內(nèi)外并重、標本兼治的組方理念[3]。

中藥復方配伍規(guī)律一直是歷代醫(yī)家探討的重點，古代醫(yī)家主要采用理論思辨和臨床驗證的方式進一步指導臨床實踐，隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展，采取體內(nèi)、體外的方式從藥效物質(zhì)基礎、復方藥動學、有效組分配伍等多角度、多學科融合的方式探討中藥復方的作用機制，為進一步研究中藥的臨床應用、劑型改良、質(zhì)量提升等提供科學實驗依據(jù)。本研究依據(jù)痹祺膠囊的功效并結(jié)合單味藥材功效、配伍等，將痹祺膠囊分為益氣養(yǎng)血組（黨參、茯苓、白術(shù)）、活血通絡組（川芎、丹參、三七、地龍、牛膝）與抗炎止痛組（馬錢子、甘草）。其中益氣養(yǎng)血組黨參、茯苓、白術(shù)為四君子湯加減，具有補氣健脾的功效；氣行血，血載氣，氣血同源，補氣以養(yǎng)血?；钛ńj組川芎、丹參、牛膝為均活血藥，三七可化瘀止血，加之地龍可通絡、息風止痙，遂將此5 味藥歸為活血通絡組。馬錢子功善止痛，為傷科療傷止痛要藥；甘草可調(diào)和藥性，緩急止痛，配伍馬錢子可緩和馬錢子的毒性，二者相使為用亦可增強止痛功效，因此將此2 味藥歸為抗炎止痛組。本研究通過環(huán)磷酰胺誘導的大鼠氣血兩虛模型、高分子右旋糖苷誘導的微循環(huán)障礙模型、巴豆油致小鼠耳腫模型、醋酸致小鼠扭體實驗和小鼠熱板致痛實驗分別考察痹祺膠囊功能藥效歸屬。

1 材料

1.1 藥品

痹祺膠囊（0.3 g/粒，批號408700）由天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供；制馬錢子粉、黨參、白術(shù)、地龍（制）、茯苓、川芎、丹參、三七、牛膝、甘草，購自天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，經(jīng)天津藥物研究院中藥首席專家張鐵軍研究員分別鑒定為馬錢子科植物馬錢Strychnosnux-vomicaL.的干燥成熟種子、桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.的干燥根、菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖、鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier.)的干燥體、多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核、傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖、唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖、五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根莖、莧科植物牛膝AchyranthesbidentataBl.的干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖，批號分別為 1-2012001、1-2009007-5G1、1-2008043、1-2101020、1-2007004-3GI、1-2007005-5GI、1-2008036、1-2009002、1-2008044-3、1-2008053-7。黨參、茯苓、白術(shù)、丹參、三七、川芎、牛膝、地龍、甘草藥材粉碎后過200 目篩。

利可君片（20 mg/片，批號211006）購自江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司；復方丹參片（0.32 g/片，批號20200910）購自湖南時代陽光藥業(yè)有限公司；醋酸地塞米松（質(zhì)量分數(shù)為95%～98%）由天津藥物研究院自制；羅通定片（30 mg/片，批號201102）購自四川迪菲特藥業(yè)有限公司；阿司匹林腸溶片（25 mg/片，批號018200837）購自石藥集團歐意藥業(yè)有限公司。

1.2 試劑

注射用環(huán)磷酰胺（0.2 g/瓶，批號1B453A）購自Baxter Oncology GmbH；高分子右旋糖苷（葡聚糖T500，批號H20M10B88790）購自上海源葉生物科技有限公司；巴豆油由天津藥物研究院自制；冰醋酸（批號210312）購自天津市康科德科技有限公司；大鼠促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）ELISA 試劑盒（批號B354857）購自Biolegend 公司；紅細胞裂解液（批號20211202）購自北京索萊寶科技有限公司；FITC 標記抗大鼠CD3 抗體（批號213048）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；FITC 標記小鼠IgG3 κ 鏈同型對照（批號208209）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；PE 標記CD4單克隆抗體（批號1921506）、PE 標記大鼠IgG2a κ鏈同型對照（批號2330503）、PerCP 標記CD8a 單克隆抗體（批號2290323）、PerCP 標記小鼠IgG1 κ鏈同型對照（批號2335792）購自賽默飛世爾科技公司；凝血酶時間（thrombin time，TT）測定試劑盒（批號032106A）購自美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司。

1.3 儀器

BDLSR fortessa 流式細胞儀（美國BD 公司）；BI-2000A＋型醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；LG-R-80F 型全自動血液黏度分析儀（北京普利生儀器有限公司）；LG-Paker 1 型凝血因子分析儀（北京普利生儀器有限公司）；SpectraMax M5型酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；Sorvall ST 8R 型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BC-2800Vet 型全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；YLS-6B 型智能熱板儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）。

1.4 動物

SPF 級SD 大鼠，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。SPF級ICR 小鼠，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)在天津天誠新藥評價有限公司實驗動物屏障系統(tǒng)[合格證SYXK（津）2011-0005]，溫度、濕度、換氣次數(shù)由中央系統(tǒng)自動控制，溫度維持在20～26 ℃，相對濕度維持在40%～70%，通風次數(shù)為10～15 次/h 全新風，光照為12 h 明、12 h 暗，自由攝食飲水。實驗動物的使用經(jīng)天津藥物研究院新藥評價有限公司實驗動物倫理委員會批準（ IACUC ：No.2022030301、2022031001、2022031501、2022050703）。

2 方法

2.1 受試藥配制

2.1.1 大鼠受試藥配制 痹祺膠囊（1.60 g/kg）組：取痹祺膠囊15 粒，取粉，研磨混懸于28 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液中，即得。益氣養(yǎng)血（0.60 g/kg）組：分別稱取藥材粉末黨參、白術(shù)、茯苓各0.56、0.56、0.56 g，混合研磨混懸于28 mL 0.5% CMC-Na 溶液中，即得?；钛ńj（0.67 g/kg）組：分別稱取藥材粉末川芎、丹參、三七、牛膝、地龍各0.74、0.37、0.37、0.37、0.04 g，混合研磨混懸于28 mL 0.5%CMC-Na 溶液中，即得。抗炎止痛（0.33 g/kg）組：分別稱取藥材粉末馬錢子、甘草各0.37、0.56 g，混合研磨混懸于28 mL 0.5% CMC-Na 溶液中，即得。大鼠ig 體積為10 mL/kg。

2.1.2 小鼠受試藥配制 痹祺膠囊（1.20 g/kg）組：取痹祺膠囊1粒，取粉，研磨混懸于5 mL 0.5% CMCNa 溶液中，即得。益氣養(yǎng)血（0.45 g/kg）組：分別稱取藥材粉末黨參、白術(shù)、茯苓各37、37、37 mg，混合研磨混懸于5 mL 0.5% CMC-Na 溶液中，即得。活血通絡（0.50 g/kg）組：分別稱取藥材粉末川芎、丹參、三七、牛膝、地龍各50、25、25、25、2 mg，混合研磨混懸于5 mL 0.5% CMC-Na 溶液中，即得?？寡字雇矗?.25 g/kg）組：分別稱取藥材粉末馬錢子、甘草各25、37 mg，混合研磨混懸于28 mL 0.5%CMC-Na 溶液中，即得。小鼠ig 體積為20 mL/kg。

痹祺膠囊（0.60 g/kg）組、益氣養(yǎng)血（0.22 g/kg）組、活血通絡（0.25 g/kg）組、抗炎止痛（0.13 g/kg）組同上述配制方法，濃度減半即可。

2.2 實驗分組、造模與給藥

2.2.1 益氣養(yǎng)血功能實驗 雄性SD 大鼠70 只，體質(zhì)量200～220 g，隨機分為7 組，每組10 只，分別為空白組、模型組、利可君（0.40 g/kg）組、痹祺膠囊（1.60 g/kg）組、益氣養(yǎng)血（0.60 g/kg）組、活血通絡（0.67 g/kg）組、抗炎止痛（0.33 g/kg）組。除空白組外，其余大鼠分別以環(huán)磷酰胺40、40、30 mg/kg 劑量連續(xù)3 d ip 誘導氣血兩虛模型，于第5天眼眶采血檢測外周血細胞數(shù)量判斷模型建立情況。模型建立成功后將動物分組并分別ig 給藥，連續(xù)給藥7 d。

2.2.2 活血通絡功能實驗 雄性SD 大鼠70 只，體質(zhì)量200～220 g，隨機分為7 組，每組10 只，分別為空白組、模型組、復方丹參片（0.30 g/kg）組、痹祺膠囊（1.60 g/kg）組、益氣養(yǎng)血（0.60 g/kg）組、活血通絡（0.67 g/kg）組、抗炎止痛（0.33 g/kg）組。各組ig 給藥，1 次/d，連續(xù)給藥7 d。空白組和模型組給予同等體積的動物專用飲用水。末次給藥30 min 后，每組以3 mL/kg ip 1%異戊巴比妥鈉麻醉后，除空白組外，其余各組均以3 mL/kg 經(jīng)iv 10%高分子右旋糖苷，誘導大鼠血循環(huán)障礙。

2.2.3 抗炎功能實驗 雄性ICR 小鼠60 只，體質(zhì)量18～20 g，隨機分為6 組，每組10 只，分別為模型組、地塞米松（3 mg/kg）組、痹祺膠囊（0.60 g/kg）組、益氣養(yǎng)血（0.22 g/kg）組、活血通絡（0.25 g/kg）組、抗炎止痛（0.13 g/kg）組。痹祺膠囊及其各拆方組ig 給藥，1 次/d，連續(xù)給藥7 d，陽性對照組ig 給藥，1 次/d，連續(xù)給藥3 d，模型組給予同等體積0.5%CMC-Na 溶液。末次給藥30 min 后，各組以巴豆油50 μL 均勻涂抹于小鼠右耳廓內(nèi)外兩面，誘導耳腫脹模型。

2.2.4 鎮(zhèn)痛功能實驗

（1）熱板致痛實驗：將ICR 小鼠置于（55.0±0.5）℃的熱板儀上，記錄小鼠首次舔后足所需的時間為小鼠的正常痛閾值。選擇正常痛閾值在5～30 s內(nèi)的小鼠（將喜跳躍小鼠剔除）。按照痛閾值將小鼠分為6 組，每組10 只，分別為空白組、羅通定（50 mg/kg）組、痹祺膠囊（1.20 g/kg）組、益氣養(yǎng)血（0.45 g/kg）組、活血通絡（0.50 g/kg）組和抗炎止痛（0.25 g/kg）組。痹祺膠囊及各拆方組每天ig 給藥1 次，連續(xù)給藥7 d，陽性藥在測定前單次給藥。

（2）醋酸扭體實驗：將ICR 小鼠隨機分為6 組，每組10 只，分別為模型組、阿司匹林（0.12 g/kg）組、痹祺膠囊（1.20 g/kg）組、益氣養(yǎng)血（0.45 g/kg）組、活血通絡（0.50 g/kg）組和抗炎止痛（0.25 g/kg）組。對照組給予0.5% CMC-Na 懸液，陽性藥組給予阿司匹林0.12 g/kg，陽性藥組每日給藥1 次，連續(xù)給藥3 d；痹祺膠囊組及各拆方組每日給藥1 次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后1 h，小鼠ip 0.6%醋酸溶液（0.2 mL/只），誘導小鼠產(chǎn)生扭體反應。

2.3 樣品采集與指標檢測

2.3.1 益氣養(yǎng)血功能實驗 第7 天末次給藥1 h 后，腹主動脈采血，分別收集各組脾臟用于計算臟器指數(shù)，并用流式細胞術(shù)檢測脾臟中CD4+/CD8+細胞比例。其中部分全血用于檢測血細胞數(shù)目；另一部分經(jīng)4 ℃、3000 r/min 離心10 min，分離得到血漿樣品，于?80 ℃保存?zhèn)溆茫珽LISA 法檢測血漿中EPO含量。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量

2.3.2 活血通絡功能實驗 注射10%高分子右旋糖苷30 min 后，首先采集大鼠腹腔腸系膜微循環(huán)圖像及視頻用于測定腸系膜毛細血管體積流量，然后腹主動脈采血于枸櫞酸鈉抗凝管中，部分用于全血檢測全血血液流變學指標，包括全血不同切速（200、30、3、1 s?1）下的全血黏度及紅細胞聚集指數(shù)；另一部分全血經(jīng)4 ℃、3000 r/min 離心10 min，分離得到血漿樣品，?80 ℃保存?zhèn)溆茫珽LISA 法檢測血漿TT。

2.3.3 抗炎功能實驗 巴豆油造模致炎4 h 后將小鼠左、右耳沿耳廓線剪下，用手動耳腫打孔器（6 mm）沿耳緣相同部位打下左右耳片，稱定質(zhì)量并計算腫脹度和腫脹抑制率。

腫脹度＝右耳質(zhì)量－左耳質(zhì)量

腫脹抑制率＝(模型組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度

2.3.4 鎮(zhèn)痛功能實驗

（1）熱板致痛實驗：記錄末次給藥結(jié)束后60、90 min 小鼠的舔后足反應所需時間，若小鼠在40 s內(nèi)仍未出現(xiàn)舔后足的情況，為防止多次測量下小鼠足爪燙傷，停止計時，時間按40 s 計。

（2）醋酸扭體實驗：注射0.6%醋酸溶液5 min后記錄15 min 內(nèi)發(fā)生扭體反應的次數(shù)，以腹部凹陷、臀部歪扭、身體扭曲、或抽胯為扭體1 次的標準，計算扭體抑制率。

扭體抑制率＝(模型組扭體均數(shù)－給藥組扭體均數(shù))/空白組扭體均數(shù)

2.4 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad prism 7.00 進行分析，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，組間差異性采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 益氣養(yǎng)血功能實驗

3.1.1 痹祺膠囊及其拆方對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠外周血細胞的影響 課題組前期研究中以0.4、0.8、1.6 g/kg 痹祺膠囊對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠的藥效考察發(fā)現(xiàn)，1.6 g/kg 劑量組效果最優(yōu)，因此在考察痹祺膠囊益氣養(yǎng)血功能模型時采用全方1.6 g/kg 下各拆方組對應的劑量考察各組藥效。造模后連續(xù)給藥7 d，結(jié)果如表1 所示，與模型組相比，痹祺膠囊顯著增加外周血細胞白細胞、紅細胞數(shù)量（P＜0.01），還可增加血中血紅蛋白的含量（P＜0.01）；對其各拆方組的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，只有以黨參、茯苓、白術(shù)為組成的益氣養(yǎng)血組可顯著改善環(huán)磷酰胺誘導的外周血象減少（P＜0.01）。

表1 痹祺膠囊拆方配伍對環(huán)磷酰胺誘導的大鼠氣血兩虛模型外周血細胞數(shù)量的影響 (±s, n = 10)Table 1 Effect of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on number of peripheral blood cells in cyclophosphamide induced deficiency of both qi and blood rat model (±s , n = 10)

表1 痹祺膠囊拆方配伍對環(huán)磷酰胺誘導的大鼠氣血兩虛模型外周血細胞數(shù)量的影響 (±s, n = 10)Table 1 Effect of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on number of peripheral blood cells in cyclophosphamide induced deficiency of both qi and blood rat model (±s , n = 10)

與空白組比較：&P＜0.05 &&P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下表同&P < 0.05 &&P < 0.01 vs blank group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg?1) 白細胞/(×109 個·L?1) 紅細胞/(×1012 個·L?1) 血紅蛋白/(g·L?1images/BZ_10_2144_2555_2157_2561.png)空白 — 11.73±0.58 6.94±0.20 149.13±2.45模型 — 8.18±1.09& 4.97±0.14&& 114.88±2.98&&利可君 0.40 13.69±2.18* 6.27±0.45* 139.00±8.07*痹祺膠囊 1.60 14.75±1.58** 6.58±0.38** 147.00±7.74**活血通絡 0.67 10.18±1.56 5.44±0.25 120.75±5.41益氣養(yǎng)血 0.60 14.93±1.16** 6.13±0.19** 135.63±2.95**抗炎止痛 0.33 10.46±0.73 5.38±0.12 120.13±2.35

3.1.2 痹祺膠囊及其拆方對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠血清EPO 含量的影響 如表2 所示，與模型組比較，益氣養(yǎng)血組可進一步增加血清中EPO 含量，其效果與陽性藥利可君相當，但弱于痹祺膠囊；而活血通絡組與抗炎止痛組血清中EPO 含量進一步降低，以黨參、茯苓、白術(shù)組成的益氣養(yǎng)血組為激活EPO 合成并釋放的主要藥味，但全方配伍效果更好。

表2 痹祺膠囊拆方配伍對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠血清EPO 含量的影響 (±s , n = 10)Table 2 Effect of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on EPO content in serum of cyclophosphamide induced deficiency of both qi and blood rat model (±s , n = 10)

表2 痹祺膠囊拆方配伍對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠血清EPO 含量的影響 (±s , n = 10)Table 2 Effect of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on EPO content in serum of cyclophosphamide induced deficiency of both qi and blood rat model (±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) EPO/(pg·mL?1)空白 — 69.23±4.49模型 — 101.41±7.16&利可君 0.40 118.31±12.65*痹祺膠囊 1.60 142.21±10.49**活血通絡 0.67 88.86±8.12*益氣養(yǎng)血 0.60 116.86±12.92*抗炎止痛 0.33 92.06±9.11*

3.1.3 痹祺膠囊及其拆方對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠脾臟指數(shù)的影響 如表3 所示，與空白組比較，模型組脾臟增大，脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；而利可君、痹祺膠囊與益氣養(yǎng)血組給藥7 d后可顯著降低脾臟指數(shù)（P＜0.05、0.01），活血通絡組與抗炎止痛組也可在一定程度上降低脾臟指數(shù)，但無統(tǒng)計學差異，由此可推測，痹祺膠囊中主要以黨參、茯苓、白術(shù)為組成的益氣養(yǎng)血組起到改善環(huán)磷酰胺誘導的脾臟損傷的作用。

表3 痹祺膠囊拆方配伍對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠脾臟指數(shù)的影響 (±s , n = 10)Table 3 Effect of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on spleen index of cyclophosphamide induced deficiency of both qi and blood rat model (±s , n = 10)

表3 痹祺膠囊拆方配伍對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠脾臟指數(shù)的影響 (±s , n = 10)Table 3 Effect of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on spleen index of cyclophosphamide induced deficiency of both qi and blood rat model (±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 脾臟指數(shù)/%空白 — 0.31±0.02模型 — 0.48±0.03&&利可君 0.40 0.36±0.03*痹祺膠囊 1.60 0.36±0.03*活血通絡 0.67 0.45±0.04益氣養(yǎng)血 0.60 0.35±0.03**抗炎止痛 0.33 0.41±0.03

3.1.4 痹祺膠囊及其拆方對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠脾臟T 細胞CD4+/CD8+比例的影響 如圖1 所示，與空白組比較，模型組CD4+/CD8+細胞比例顯著下降（P＜0.05）；連續(xù)給予陽性藥利可君、痹祺膠囊全方及各拆方7 d 后，痹祺膠囊可顯著提高CD4+/CD8+細胞比例（P＜0.05），其各拆方組中只有益氣養(yǎng)血組可顯著提高CD4+/CD8+細胞比例（P＜0.01），即黨參、白術(shù)、茯苓為痹祺膠囊中改善環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制的主要藥味。

圖1 痹祺膠囊拆方配伍對環(huán)磷酰胺誘導氣血兩虛模型大鼠脾臟CD4+/CD8+細胞比例的影響 (±s , n = 10)Fig.1 Effect of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on spleen CD4+/CD8+ ratio of cyclophosphamide induced deficiency of both qi and blood rat model (±s , n = 10)

3.2 活血通絡功能實驗

3.2.1 痹祺膠囊拆方配伍對大鼠腸系膜微循環(huán)的影響 課題組前期研究中以0.4、0.8、1.6 g/kg 痹祺膠囊對高分子右旋糖苷誘導微循環(huán)障礙模型發(fā)現(xiàn)，1.6 g/kg 劑量組效果最優(yōu)，因此在考察痹祺膠囊活血通絡功能時采用全方1.6 g/kg 下各拆方組對應的劑量考察各組藥效。如表4 所示，注射10%高分子右旋糖苷30 min 后，與空白組比較，模型組及各給藥組毛細血管體積流量明顯降低（P＜0.01），可見血管呈現(xiàn)局部深紅色團塊狀聚集，血液流動性降低，血流方向逆向擺動等血液循環(huán)障礙。與模型組比較，除抗炎止痛組外，各給藥組毛細血管血流明顯加快（P＜0.05、0.01），其中復方丹參片組、痹祺膠囊組及活血通絡組血流速度得到明顯的改善（P＜0.01），且活血通絡組毛細血管體積流量改善較接近復方丹參片組。由此可以判斷痹祺膠囊能夠改善由高分子右旋糖苷誘導的大鼠腸系膜毛細血管微循環(huán)障礙，其作用基礎主要依賴于活血通絡組藥物。

表4 痹祺膠囊拆方配伍對高分子右旋糖苷誘導大鼠毛細血管體積流量的影響 (±s , n = 10)Table 4 Effects of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on capillary volume flow rate in rats exposed high molecular dextran (±s , n = 10)

表4 痹祺膠囊拆方配伍對高分子右旋糖苷誘導大鼠毛細血管體積流量的影響 (±s , n = 10)Table 4 Effects of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on capillary volume flow rate in rats exposed high molecular dextran (±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 毛細血管體積流量/(μm·s?1)空白 — 229.34±13.95模型 — 70.66±3.76&&復方丹參片 0.30 192.50±17.00**痹祺膠囊 1.60 168.71±8.51**活血通絡 0.67 178.07±16.14**益氣養(yǎng)血 0.60 90.60±6.70*抗炎止痛 0.33 75.76±6.61

3.2.2 痹祺膠囊拆方配伍對全血黏度的影響 如表5 所示，與空白組比較，注射高分子右旋糖苷后，模型組4 個切速下的全血黏度值及紅細胞聚集指數(shù)均有明顯升高（P＜0.01），表明高分子右旋糖苷可誘導大鼠微循環(huán)障礙。與模型組比較，復方丹參片組、痹祺膠囊全方組及活血通絡組在4 個切速下的全血黏度值及紅細胞聚集指數(shù)均顯著下降（P＜0.01），結(jié)果表明痹祺膠囊的活血通絡功能主要依賴于全方中的活血藥味，即丹參、三七、川芎、牛膝、地龍，其作用機制可能與抑制紅細胞聚集有關(guān)。

表5 痹祺膠囊拆方配伍對高分子右旋糖苷誘導大鼠全血黏度的影響 (±s , n = 10)Table 5 Effects of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on whole blood viscosity in rats exposed high molecular dextran (±s , n = 10)

表5 痹祺膠囊拆方配伍對高分子右旋糖苷誘導大鼠全血黏度的影響 (±s , n = 10)Table 5 Effects of compatibility of Biqi Capsule and its disassembled formula on whole blood viscosity in rats exposed high molecular dextran (±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 全血黏度 紅細胞聚集指數(shù)高切（200 s?1） 中切（30 s?1） 低切（3 s?1） 低切（1 s?1）空白 — 4.09±0.11 6.65±0.17 20.69±0.61 27.38±0.81 5.46±0.36模型 — 6.03±0.20&& 10.42±0.39&& 36.10±1.69&& 47.76±2.24&& 7.87±0.33&&復方丹參片 0.30 5.12±0.14** 8.76±0.33** 28.31±1.57** 37.46±2.07** 6.59±0.26**痹祺膠囊 1.60 4.97±0.13** 8.23±0.26** 26.98±1.09** 35.71±1.45** 6.50±0.27**活血通絡 0.67 4.93±0.21** 8.05±0.25** 26.17±1.01** 34.33±1.10** 6.32±0.21**益氣養(yǎng)血 0.60 5.58±0.10 9.73±0.26 32.31±1.74 42.22±1.66 7.38±0.45抗炎止痛 0.33 5.61±0.20 9.83±0.53 33.79±2.87 43.29±4.01 7.57±0.65

3.2.3 痹祺膠囊拆方配伍對TT 的影響 如表6 所示，與空白組比較，血循環(huán)障礙模型組大鼠TT 有所縮短（P＜0.05）；與模型組比較，痹祺膠囊組及活血通絡組均可顯著延長TT（P＜0.01），益氣養(yǎng)血組和抗炎止痛組藥未表現(xiàn)出對血循環(huán)障礙大鼠TT延長的作用。因此推斷活血通絡組藥可能為痹祺膠囊中主要延緩血凝的藥味組。

表6 痹祺膠囊各拆方組對高分子右旋糖苷誘導大鼠血漿TT 的影響 (±s , n = 10)Table 6 Effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on TT in serum of rats exposed high molecular dextran (±s , n = 10)

表6 痹祺膠囊各拆方組對高分子右旋糖苷誘導大鼠血漿TT 的影響 (±s , n = 10)Table 6 Effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on TT in serum of rats exposed high molecular dextran (±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) TT/s空白 — 35.89±1.38模型 — 31.54±1.14&復方丹參片 0.30 40.16±3.11*痹祺膠囊 1.60 40.96±1.88**活血通絡 0.67 38.40±1.74**益氣養(yǎng)血 0.60 32.87±0.80抗炎止痛 0.33 33.11±0.97

3.3 抗炎功能實驗

課題組前期研究中以0.6、1.2、2.4 g/kg 痹祺膠囊對巴豆油誘導小鼠耳腫模型發(fā)現(xiàn)0.6 g/kg 劑量組效果最優(yōu)，因此在考察痹祺膠囊抗炎功能時采用全方0.6 g/kg 下各拆方組對應的劑量考察各組藥效。如表7 所示，痹祺膠囊全方及各拆方均具有不同程度減輕巴豆油誘導的小鼠耳腫脹的癥狀，其中以馬錢子、甘草配伍的抗炎止痛組抗炎效果顯著（P＜0.01），其腫脹抑制率為59.3%，為痹祺膠囊發(fā)揮抗炎效果的主要功能藥對，此外以丹參、三七、川芎、地龍為組成的活血通絡組也具有抑制巴豆油誘導的小鼠耳腫脹效果（P＜0.05），可能與活血通絡藥味加快血液流速從而加快炎癥因子代謝有關(guān)。

表7 痹祺膠囊各拆方組對巴豆油耳炎的抑制作用 (±s ,n = 10)Table 7 Inhibitory effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on ear edema induced by croton oil in mice (±s , n = 10)

表7 痹祺膠囊各拆方組對巴豆油耳炎的抑制作用 (±s ,n = 10)Table 7 Inhibitory effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on ear edema induced by croton oil in mice (±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 腫脹度/mg 腫脹抑制率/%模型 — 5.40±0.54 0.0地塞米松 0.003 2.00±0.39** 62.9痹祺膠囊 0.60 2.10±0.41** 61.1活血通絡 0.25 4.00±0.30* 25.9益氣養(yǎng)血 0.22 4.60±0.16 14.8抗炎止痛 0.13 2.20±0.25** 59.3

3.4 鎮(zhèn)痛功能實驗

3.4.1 痹祺膠囊及其拆方對熱板所致疼痛的鎮(zhèn)痛作用 課題組前期實驗研究表明痹祺膠囊具有明顯的中樞鎮(zhèn)痛作用，且1.20 g/kg 劑量組效果最優(yōu)，因此以該劑量組進行各拆方組中樞鎮(zhèn)痛作用的研究。如表8 所示，在給藥60 min 后，痹祺膠囊與陽性藥可顯著延長小鼠熱板舔足時間（P＜0.05），但各拆方組與空白組相比無明顯變化，但給藥90 min 時抗炎止痛組的舔足反應時間顯著延長（P＜0.01），即痹祺膠囊的中樞鎮(zhèn)痛作用主要為馬錢子、甘草組成的抗炎止痛組。

表8 痹祺膠囊各拆方組對小鼠熱板致痛的影響 (±s ,n = 10)Table 8 Effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on hot plate induced aching in mice(±s , n = 10)

表8 痹祺膠囊各拆方組對小鼠熱板致痛的影響 (±s ,n = 10)Table 8 Effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on hot plate induced aching in mice(±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 舔足反應時間/s 60 min 90 min空白 — 12.05±0.59 13.75±0.58羅通定 0.05 17.87±1.96& 25.97±2.04&&痹祺膠囊 1.20 15.56±1.39& 22.52±1.45&&活血通絡 0.50 10.41±0.55 13.68±0.56益氣養(yǎng)血 0.45 11.06±0.64 14.70±0.78抗炎止痛 0.25 12.32±1.05 21.66±2.69&&

3.4.2 痹祺膠囊及其拆方對醋酸所致小鼠扭體的鎮(zhèn)痛作用 痹祺膠囊具有明顯的抑制醋酸扭體作用，且1.20 g/kg 劑量組效果最優(yōu)，因此以該劑量組進行各拆方組外周鎮(zhèn)痛作用的研究。如表9 所示，痹祺膠囊各拆方組均可抑制醋酸所致的小鼠扭體反應次數(shù)，其抑制率分別為活血通絡組11.57%、益氣養(yǎng)血組26.17%、抗炎止痛組69.70%，以馬錢子、甘草為組成的抗炎止痛組為痹祺膠囊發(fā)揮抗炎作用的主要藥味（P＜0.01）。

表9 痹祺膠囊各拆方組對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響(±s , n = 10)Table 9 Effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on writhing frequency induced by acetic acid in mice (±s , n = 10)

表9 痹祺膠囊各拆方組對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響(±s , n = 10)Table 9 Effects of Biqi Capsule and its different disassembled formulas on writhing frequency induced by acetic acid in mice (±s , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 扭體次數(shù) 抑制率/%模型 — 36.30±6.44 0.00阿司匹林 0.12 8.50±2.54** 76.58痹祺膠囊 1.20 10.30±3.50** 71.63活血通絡 0.50 32.10±6.78 11.57益氣養(yǎng)血 0.45 26.80±7.18 26.17抗炎止痛 0.25 11.00±4.78** 69.70

4 討論

痹證是指風寒濕熱之邪閉阻經(jīng)絡，導致氣血運行不暢，而引起的以肢體關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、麻木、重著甚至活動不利為主要表現(xiàn)的病證[4]?！稘健分杏小敖砸蝮w虛，腠理空虛，受風寒濕氣而成痹也”，由于患者素體本虛，元氣不足，氣血虧少，使得肢體筋脈失濡，腠理松懈，風寒濕等外邪乘機而入，發(fā)為痹證[5]。正氣虛是痹病發(fā)生的基礎，邪侵是痹病的重要條件?！皻鉃檠畮?，血為氣之母”，氣血相依，氣能生血、氣能行血、氣能攝血，氣虛則血無以推動統(tǒng)攝而易溢于脈外，散于筋骨關(guān)節(jié)，阻塞經(jīng)絡而成血瘀。濕濁血瘀凝滯于經(jīng)絡關(guān)節(jié)，“不通則痛”，病發(fā)則會引起痹證患者肢體關(guān)節(jié)、肌肉、筋骨等處酸麻重著、疼痛、麻木、腫脹、甚至關(guān)節(jié)紅腫熱痛、屈伸不利[6]。關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛是痹證主要的臨床表現(xiàn)，而關(guān)節(jié)炎癥是誘發(fā)關(guān)節(jié)腫脹疼痛的重要原因[7]。

中醫(yī)治療RA，重在扶正，而益氣養(yǎng)血為扶正的關(guān)鍵治法。環(huán)磷酰胺因?qū)ν庵苎蠹肮撬枰种谱饔贸Ｓ糜跇?gòu)建中醫(yī)氣血兩虛模型[8-9]。氣血兩虛與免疫功能下降密切相關(guān)，脾臟是最大的外周免疫器官，具有儲血、造血、免疫應答等生理功能。CD4+和CD8+均為T 淋巴細胞，在正常生理情況下，其比值保持相對穩(wěn)定，共同調(diào)節(jié)免疫應答，其比值降低則考慮機體發(fā)生了免疫抑制[10]，如環(huán)磷酰胺誘導免疫低下，體內(nèi)CD4+/CD8+比值降低[11]。EPO 被認為是紅細胞生成的主要調(diào)控因子，在紅系分化和增殖過程中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，黨參及其主要化合物具有改善造血功能、增強免疫、抗炎、抗氧化等多種作用[12-13]；白術(shù)多糖可以增加動物機體脾臟和胸腺的質(zhì)量，具有免疫器官損傷的拮抗性作用[14]；茯苓有效抑制脾臟增大及胸腺萎縮，增強細胞免疫和體液免疫能力[15-16]。本研究表明，益氣養(yǎng)血組對氣血兩虛模型大鼠改善外周血細胞、升高血清EPO 含量、降低脾臟指數(shù)及升高CD4+/CD8+細胞比例，其藥效作用與痹祺膠囊全方組作用相近。由此推斷痹祺膠囊改善氣血兩虛的功能主要歸因于益氣養(yǎng)血組藥即黨參、白術(shù)、茯苓。

痹證病久邪留傷正，正虛邪戀，導致氣血津液運行無力，血滯為瘀，留滯于筋脈關(guān)節(jié)，痼結(jié)很深，不易祛除，并成為新的致病因素，進一步損壞筋脈關(guān)節(jié)。因此改善“瘀血”在痹證治療中起著重要作用。高分子右旋糖苷引起急性微循環(huán)障礙的主要因素與其作為大分子物質(zhì)激活內(nèi)源性凝血途徑、形成大量微血栓有關(guān)[17]，這與中醫(yī)“血瘀”概念相似。研究表明，川芎中阿魏酸、川芎嗪和川芎揮發(fā)油可以降低纖維蛋白原含量、延長TT 和活化部分凝血活酶時間，改善紅細胞壓積及紅細胞變形指數(shù)，川芎水提物可以抗血小板聚集，川芎甲醇提取部位和川芎揮發(fā)油均可以明顯改善全血黏度和血漿黏度[18-19]。丹參具有激活纖溶酶原的作用，產(chǎn)生纖溶作用，通過溶解血栓發(fā)揮其活血化瘀作用。三七、地龍、牛膝均具可抑制血小板聚集，改善血液流變性，其中地龍具有降解陳舊性血栓的作用[20]。本研究表明，痹祺膠囊全方組和活血通絡組藥可通過提高腸系膜毛細血管體積流量、降低全血黏度及紅細胞聚集指數(shù)，延長血漿TT，抑制纖維蛋白原激活發(fā)揮抗微循環(huán)障礙作用。由此推斷痹祺膠囊發(fā)揮活血功能的核心為活血通絡組，即川芎、丹參、三七、地龍和牛膝。

RA 臨床表現(xiàn)為對稱性及侵蝕性的多關(guān)節(jié)炎，病理特征為滑膜炎癥，其主要癥狀是疼痛[21-22]。炎癥機制在痹證發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，而免疫功能異常是痹證慢性炎癥持續(xù)和加重的重要原因，大量炎癥細胞和炎癥因子破壞患者的自身免疫耐受[23]。炎癥、外周敏化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛調(diào)節(jié)機制的異常，以及隨著疾病的進展，關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)的改變等共同導致了患者對疼痛的感知[24]。研究表明，馬錢子中馬錢子堿可以顯著抑制炎癥組織中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的釋放，并降低醋酸誘導的血管通透性，通過抗炎發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[25]，還可通過增加大腦功能區(qū)腦啡肽的含量，提高小鼠電刺激致痛的痛閾值及大鼠 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）致炎后足壓痛的鎮(zhèn)痛率，發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用[23-27]。甘草中甘草黃酮類成分通過抑制炎癥介質(zhì)的合成與釋放，抑制κB 抑制因子激酶（inhibitor of κB kinase，IKK）激活，從而阻止核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的轉(zhuǎn)錄從而抑制一氧化氮（nitric oxide，NO）和PGE2的產(chǎn)生，降低誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[28]。甘草查耳酮A 還可通過抑制大鼠脊髓背角p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/NF-κB 信號通路，抑制炎性因子的釋放，降低脊髓背角小膠質(zhì)細胞的活化程度，對神經(jīng)病理性疼痛發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[29]。本研究表明痹祺膠囊以馬錢子、甘草配伍的抗炎止痛組為抗炎、鎮(zhèn)痛效果的主要功能藥對。

通過現(xiàn)代藥理學模型方法，闡釋中醫(yī)藥針對疾病的治法原理、配伍理論和方劑的配伍規(guī)律，從而發(fā)展和完善中醫(yī)藥理論，其中把一個處方拆成多個“子方”后進行藥效物質(zhì)基礎研究和療效變化觀察的拆方研究，是說明配伍機制的一個重要方法。本文通過上述功能實驗，基本明確了痹祺膠囊功能藥味配伍關(guān)系，即黨參、白術(shù)、茯苓主要發(fā)揮益氣養(yǎng)血功能，針對痹證內(nèi)因即氣血虧虛或久病氣血不足導致的經(jīng)脈、筋肉失于濡養(yǎng)等癥候；川芎、丹參、三七、地龍和牛膝主要發(fā)揮活血化瘀功能，針對氣血閉阻、環(huán)流不暢、壅閉經(jīng)絡等癥候；馬錢子、甘草主要發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛功能，針對氣血不足、經(jīng)絡瘀閉導致的“不榮則痛”與“不通則痛”等癥候。如此組方，扶正驅(qū)邪，兩擅其功。當然對于痹祺膠囊發(fā)揮不同功能的藥理作用機制還需深入研究，進一步解析痹祺膠囊多途徑、多靶點的作用特點。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突