中醫(yī)藥介導(dǎo)AMPK/mTOR 信號通路治療骨質(zhì)疏松癥的研究進展

張文豪 易林 向文遠 熱米拉·艾買提 鄧迎杰 廖軍 梁志權(quán) 李雷疆 方銳

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種因骨量低下、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞導(dǎo)致的以骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨?。?］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）是最常見的OP 類型。50 歲以上女性O(shè)P患病率高達32%以上［2］。預(yù)計2035 年我國發(fā)生的骨質(zhì)疏松性骨折（腕部、椎體和髖部）將達483萬例次，到2050 年將達599 萬例次［3］。OP 造成的骨折和OP 性疼痛是OP 患者最突出的臨床表現(xiàn)，也是OP 患者生活質(zhì)量和藥物治療效果下降的主要原因。此外OP 引發(fā)的并發(fā)癥可導(dǎo)致患者焦慮、睡眠質(zhì)量降低，甚至出現(xiàn)自閉等嚴(yán)重精神障礙。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于OP 患者的部分癥狀具有緩解作用，但也帶來一定不良反應(yīng)，比如胃腸道反應(yīng)、疼痛緩解性差、價格昂貴等問題［1-2］。目前，選擇不良反應(yīng)小、標(biāo)本兼治、可長期服用、價格合理的中草藥防治OP 方案已得到部分專家推薦［1］。

自噬是通過溶酶體降解消除細胞內(nèi)功能障礙成分和細胞外生物的一種細胞自我保護的分解代謝機制，與成骨和骨骼發(fā)育有關(guān)，越來越多的證據(jù)表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AMPK）和哺乳動物自噬參與骨形成、再吸收，與OP 防治密切相關(guān)［4］。本文對AMPK/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路在OP 發(fā)病中的具體分子靶向機制，以及中醫(yī)藥對于該分子靶向機制的調(diào)節(jié)用于治療OP 的現(xiàn)況做一綜述。

一、AMPK/mTOR 信號通路在OP 產(chǎn)生中的作用

PMOP 與雌激素缺乏、細胞自噬失衡、細胞凋亡增加、活性氧增加等因素有關(guān)［4］。根據(jù)證型，中醫(yī)主要將OP 分為肝腎陰虛、脾腎陽虛、腎虛血瘀、腎陰陽兩虛。OP 的發(fā)生與自噬失衡有關(guān)，自噬及自噬相關(guān)蛋白在骨代謝穩(wěn)態(tài)中起著非常重要的作用。自噬是OP 研究的重要方向，其中AMPK/mTOR 信號通路介導(dǎo)的自噬在骨代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，是各種因素的主要匯聚點之一。AMPK 與mTOR 的活性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，Bai 等（2017 年）的研究顯示活化的AMPK 可磷酸化激活蛋白復(fù)合物TSC1/2 蛋白，進而抑制mTOR 活性，陳知斌等（2021 年）發(fā)現(xiàn)大鼠AMPK mRNA 的表達與蛋白磷酸化水平上調(diào)有關(guān)，mTOR RNA 的表達與蛋白磷酸化水平下調(diào)有關(guān)；左歸丸可以下調(diào)AMPK mRNA 的表達和蛋白磷酸化水平，右歸丸可以上調(diào)mTOR mRNA 的表達和蛋白磷酸化水平。

1.AMPK/mTOR 信號通路在成骨細胞中的作用

AMPK/mTOR 信號通路是自噬的經(jīng)典信號通路，其中AMPK 已被公認是通過各種信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、自噬和線粒體功能的關(guān)鍵能量傳感器和代謝調(diào)節(jié)劑，它不僅能間接調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的功能，而且直接參與成骨細胞礦化和破骨細胞褶皺的形成［5］。AMPK 可通過抑制mTOR 促進自噬的啟動，AMPK 可通過UNC-51 樣激酶1（AMPK-ULK1）-自噬軸促進成骨分化，通過直接磷酸化誘導(dǎo)自噬，直接磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）催化亞基3 型復(fù)合物和BECN1（Ⅲ類PtdIns3K 復(fù)合物的核心成分）來誘導(dǎo)自噬反應(yīng)的發(fā)生［6］。AMPK 是AMP 依賴的蛋白激酶，是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，體內(nèi)AMP/ATP 比例的升高能激活A(yù)MPK，骨基質(zhì)的形成、礦化以及骨吸收需要的大量ATP，因此AMPK的激活可以有效促進骨形成。

Wei 等［7］發(fā)現(xiàn)成骨細胞中的葡萄糖攝取是成骨細胞分化和骨形成的早期決定性因素，成骨細胞對葡萄糖的攝取通過2 種不同的方式，一是通過抑制AMPK 的活性，葡萄糖攝取增強mTORC1通路的活性，從而增強蛋白質(zhì)的合成；二是抑制AMPK 通過SMAD 特異性的e3 泛素蛋白連接酶1（SMURF1）促進Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2，成骨細胞分化的主要決定因素）泛素化的作用，AMPK 的過度激活并不利于成骨，這從某些層面證實了AMPK 與成骨細胞的分化關(guān)系密切。Qu 等（2016 年）發(fā)現(xiàn)AMPK 信號通路可促進成骨細胞分化和血管生成，進而促進骨愈合。

Li 等［8］發(fā)現(xiàn)AMPK 激活可刺激小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（ MC3T3-E1）的成骨分化，使成骨細胞礦化以及堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素和RUNX2 的mRNA 表達上調(diào)，同時AMPK 通過上調(diào)微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3B 增加自噬體密度。mTOR 存在于2 種不同的蛋白復(fù)合物中，即mTORC1 和mTORC2，用雷帕霉素抑制 mTORC1會激活mTORC2，增強自噬并募集抗凋亡信號，從而防止鈣化，故mTORC2 具有促間充質(zhì)干細胞（MSC）成骨細胞分化的作用，mTORC1 與各種衰老過程相關(guān)，如細胞營養(yǎng)、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持、自噬、線粒體功能障礙和細胞衰老。Lu 等［9］發(fā)現(xiàn)敲除長鏈非編碼RNA TUG1（taurine upregulated 1）可延緩骨髓MSC（BMSC）的成骨誘導(dǎo)，RUNX2、骨唾液酸蛋白基因（BSP）、骨鈣素（OCN）和Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈（COL1A1）等成骨相關(guān)標(biāo)志物表達下調(diào)，BMSC 的AMPK 和P53 表達下調(diào)，而TUG1 的過表達則上調(diào)AMPK 和P53 的表達，并下調(diào)BMSC 中 mTOR 的表達，因此認為TUG1 通過AMPK/mTOR/自噬軸促進BMSC 成骨分化。

2.AMPK/mTOR 信號通路在破骨細胞中的作用

破骨細胞屬于多核巨細胞，參與骨吸收過程。破骨細胞的分化和功能實施需要一系列的細胞因子去除舊骨，這與成骨細胞介導(dǎo)的骨形成誘導(dǎo)骨重塑相協(xié)調(diào)，而AMPK 在破骨細胞分化和功能中可起負向調(diào)節(jié)作用。高水平葡萄糖通過降低AMPK磷酸化和自噬水平抑制RAW264.7 細胞來源的破骨細胞的分化和功能［10］。AMPKα 亞基包含α1 和α2亞型，敲除α1 或α2 亞基的AMPK 小鼠通過增強體內(nèi)破骨細胞的分化和功能表現(xiàn)出骨量減少的狀態(tài)。葡萄糖缺乏或低氧誘導(dǎo)因子1α 已被證明可抑制破骨細胞的骨吸收，AMPK 磷酸化可抑制破骨細胞分化，在葡萄糖饑餓條件下，激活的AMPK 通過使mTORC1 失活促進Ser757 位點的UNC-51 樣激酶1（ULK1）磷酸化，隨后在Ser317 和Ser777位點磷酸化的ULK1 通過AMPK-ULK 復(fù)合物啟動自噬［11］。Tong 等［10］發(fā)現(xiàn)骨保護素（OPG）能激活A(yù)MPK。在OPG 介導(dǎo)的破骨細胞分化抑制過程中，激活的AMPK 通過抑制mTOR 和下游靶標(biāo)p70S6K的磷酸化達到抑制破骨細胞分化效果。活性AMPK會導(dǎo)致TSC1/2 復(fù)合物磷酸化和激活，從而通過Ras 超家族的小GTP 酶（Rheb）抑制mTOR 活性［12］。由于破骨細胞在骨髓的前單核細胞前體分化和骨吸收的過程中均需要高水平的葡萄糖，而AMPK與葡萄糖等關(guān)系密切，故AMPK 與破骨細胞的分化和骨吸收存在一定關(guān)聯(lián)，AMPK/mTOR/ULK1 信號通路被認為是葡萄糖饑餓激活的中樞代謝調(diào)節(jié)因子，它可以通過激活自噬促進補償性能量產(chǎn)生過程，參與葡萄糖誘導(dǎo)的破骨細胞生成和調(diào)節(jié)自噬。

二、中醫(yī)藥介導(dǎo)AMPK/mTOR 信號通路防治OP

1.中藥單體

淫羊藿苷（ICT）是從淫羊藿中分離出來的主要生物活性成分，淫羊藿屬小檗科多年生植物，是一種重要的預(yù)防骨代謝紊亂的藥用植物，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，化學(xué)成分包括黃酮類、多糖類、木脂素與生物堿等。淫羊藿具有多種藥理活性，包括刺激神經(jīng)元分化、抑制破骨細胞分化、促進心肌細胞分化、抑制細胞增殖等［13］。Zhao 等（2020 年）發(fā)現(xiàn)經(jīng)ICT 處理肺癌誘導(dǎo)的破骨細胞后，其AMPK mRNA 表達上調(diào)，而mTOR mRNA 表達則下調(diào)，ICT 顯著降低了破骨細胞分化標(biāo)志物如組織蛋白酶K 的表達，可提高細胞誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中AMPK 的磷酸化水平并抑制mTOR 的磷酸化，因此認為ICT 通過抑制AMPK/mTOR 信號通路抑制破骨細胞生成。

人參皂苷（C42H72O13）是人參中最有價值的活性成分，目前科學(xué)家已提取和鑒定了100 多種人參皂苷單體。在這些單體中，人參皂苷Rg3被認為是最有效的甾體皂苷，它在各種模型中均表現(xiàn)出抗氧化、抗炎、抗癌和神經(jīng)保護活性，且在體外具有骨保護作用，可抑制RAW264.7 細胞中的破骨細胞分化［14］。Zhang 等［15］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3能改善雙側(cè)卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的OP 大鼠模型中的骨丟失和骨小梁結(jié)構(gòu)的改變，并認為其可以增強自噬、激活A(yù)MPK 信號、抑制mTOR 信號，從而降低OP 的發(fā)病率。

槲皮素是從蘆丁（蕓香苷）、槲皮苷、金絲桃苷中提取的主要生物活性黃酮類化合物，Guo 等（2017 年）發(fā)現(xiàn)槲皮素使成骨細胞標(biāo)志物如OCN、骨橋蛋白、OPG 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（ BMP-2）的表達上調(diào)。Sun 等［16］通過實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素可改善骨密度及骨小梁骨的微觀結(jié)構(gòu)，以及改善骨質(zhì)硬度、平衡運動能力、腓腸肌的形態(tài)學(xué)等避免骨折的因素，同時提高骨鈣蛋白、RUNX2 和Osterix 蛋白水平，以及促進AMPK 磷酸化并抑制mTOR 磷酸化通路，降低OP 的發(fā)病率。

白藜蘆醇是一種結(jié)構(gòu)類似雌激素己烯雌酚的天然多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中，游麗娟等（2021 年）發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨質(zhì)量，降低血清堿性磷酸酶和骨鈣素水平，使成骨細胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（SIRT1）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）和Beclin-1 的表達上調(diào)，降低AKT 和mTOR 的磷酸化水平，以及通過增強線粒體自噬來保護骨質(zhì)疏松大鼠的成骨細胞。

2.中藥復(fù)方

壯骨止痛膠囊由補骨脂、淫羊藿、川牛膝、枸杞子、狗脊、女貞子、骨碎補等組成，具有補益肝腎、壯骨止痛之效，陳沙等（2022 年）發(fā)現(xiàn)壯骨止痛膠囊可促進BMSC 的增長及升高ALP活性，并通過脂向分化的自噬抑制作用促進成骨。Men 等［17］建 立 了PMOP 小 鼠 模 型，發(fā) 現(xiàn) 壯骨止痛膠囊可提高其疼痛閾值、腰椎骨小梁密度、B-ALP、I 型前膠原氨基端前肽（PINP）和1型前膠原C 端交聯(lián)肽（CTX）的血清水平，抑制TNF-α、IL-17 和IL-1β 的釋放，通過激活A(yù)MPK、抑制mTOR 來提高自噬相關(guān)因子Atg-5、Beclin-1、LC3 Ⅱ、ULK1 的表達，最終起到抗骨質(zhì)疏松作用。AMPK/mTOR 信號通路介導(dǎo)的自噬在鎮(zhèn)痛中起主要作用，Liu 等（2022 年）發(fā)現(xiàn)壯骨止痛膠囊可調(diào)節(jié)AMPK/mTOR 信號通路，從而緩解患者的OP 疼痛以及提高骨密度。

左、右歸丸出自《景岳全書·新方八陣》，《中華人民共和國藥典》指出該藥具有補腎填精、益髓壯骨的作用［18］。在OP 小鼠模型中，左歸丸可使AMPK 基因表達和p-AMPKα 蛋白表達下調(diào)，而右歸丸則起相反作用，表明兩者的作用機制存在差異，中醫(yī)辨證分型認為左歸丸主要應(yīng)用于肝腎陰虛證，而右歸丸主要應(yīng)用于脾腎陽虛證，從中醫(yī)角度可認為2 種證型的差異可能與p-AMPKα 蛋白的水平高低有關(guān)［19-20］。左、右歸丸可通過干預(yù)AMPK/mTOR 信號通路來調(diào)節(jié)骨代謝，抑制破骨細胞分化。從AMPK/mTOR 蛋白磷酸化水平也可驗證中醫(yī)對于OP 的辨證分型的重要性，關(guān)于腎虛血瘀證、腎陰陽兩虛與AMPK/mTOR 的關(guān)系，仍需進一步研究。

總之，AMPK/mTOR 信號通路可調(diào)節(jié)ULK1、OCN、RUNX2、ERK1/2 等來影響OP，但是OP 的發(fā)生是多因素的，在成骨細胞和破骨細胞的調(diào)節(jié)中，中藥具有多成分、多靶點、多途徑的獨特優(yōu)勢，有助于達到骨重建平衡。然而，現(xiàn)階段中醫(yī)藥防治OP 的相關(guān)研究仍存在一些不足：①我國幅員遼闊，中醫(yī)治療一般因地制宜，缺少相應(yīng)的辨證分析；②大多數(shù)OP 模型的建立基于小鼠構(gòu)建，而中醫(yī)復(fù)方和單體中藥的中醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)方多以人為基礎(chǔ)，故可能存在差異，在后期的工作中，可通過人干細胞建立相應(yīng)模型，從發(fā)病機制到藥效學(xué)角度為OP 的治療提供新的思路及理論支撐；③對中藥有效組分應(yīng)進行深入挖掘，闡述中藥有效組分在治療OP 的內(nèi)在機制及相關(guān)通路，弘揚我國中醫(yī)及中藥文化。