黃芩素對黃藥子致肝損傷模型小鼠的防護(hù)作用及其機(jī)制*

朱舒虹，任翠翠，王 冉，段石頑，謝允東

（1.陜西省西安市第一醫(yī)院，陜西 西安 710002； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046）

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬黃獨(dú)Dioscorea bulbiferaL.的地下塊莖，在我國分布廣泛，藥用歷史悠久［1-2］。黃藥子及其制劑用于治療甲狀腺腫大、腫瘤等效果較好，但會引發(fā)肝損傷等不良反應(yīng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷主要是由二萜內(nèi)酯類化合物在肝臟蓄積誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致［4-5］。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）在肝臟組織中高度表達(dá)，在氧化應(yīng)激的作用下，Nrf2 被激活，通過抗炎、抗氧化和調(diào)控細(xì)胞凋亡等機(jī)制，抑制核因子-κB（NF-κB）的激活，是肝損傷防護(hù)作用中重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路［6］；且其下游的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)上調(diào)，加速肝臟中的藥物及其代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)排泄。中藥黃芩具有保肝作用，與黃藥子配伍能減輕后者的肝毒性［7］。黃芩素是黃芩的主要活性成分，對四氯化碳、半乳糖胺、對乙酰氨基酚、卡介苗+ 脂多糖等誘導(dǎo)的肝損傷具有防護(hù)作用。基于此，本研究中探討了黃芩素對黃藥子致肝損傷模型小鼠的防護(hù)作用及其機(jī)制，為黃芩配伍黃藥子的臨床安全應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥及動物

儀器：DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器廠）；ELX-800 型酶標(biāo)儀（美國Bio Tek 公司）；EXICYCLER 96 型熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司）；DP73型顯微鏡拍照系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

試藥：黃芩素（批號為E0804550250，含量≥98%）、水飛薊素（批號為D110160，含量≥98%），均購自安耐吉＜上海＞醫(yī)藥化學(xué)有限公司；黃藥子飲片（陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號為20210610）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號為20211012），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號為20211112），堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號為20211212），總膽紅素（TBiL）試劑盒（批號為20211216），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20211016），過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號為20211112），谷 胱 甘 肽（GSH）試 劑 盒（批 號 為20211116），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20211218），均購自南京建成生物工程研究所；Nrf2 抗體（批號為WL012135），核 因 子（NF）- κB p65 抗 體（批 號 為WL01273b），磷酸化NF - κB p65（p - NF - κB p65）抗體（批號為WL012169），血紅素加氧酶1（HO - 1）抗體（批號為WL02400），腫瘤壞死因子- α（TNF - α）抗體（批號為WL01581），白細(xì)胞介素6（IL-6）抗體（批號為WL02841），β-actin 細(xì)胞抗體（批號為WL01372），組蛋白H3 抗體（Histone H3）抗體（批號為WL0984），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（二抗，批號為WL023），全蛋白提取試劑盒（批號為WLA019），核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（批號為WLA020a），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號為WLA004），BeyoRT ⅡM - MLV反轉(zhuǎn)錄酶（批號為D7160L），均購自沈陽萬類生物科技有限公司；蘇木素（H，批號為H8070）、伊紅（E，批號為A600190），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

動物：健康SPF 級KM 小鼠60 只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，實驗動物合格證號0043206，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）022 - 030。動物實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號SUCMDL20220304009），實驗動物使用許可證號SYXK（陜）2017-004。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗室中，相對濕度45%～65%，溫度22～24 ℃，12 h/12 h明暗交替。

1.2 方法

黃藥子醇提物制備：取藥材飲片樣品細(xì)粉適量，加10倍體積的75%乙醇加熱回流提取3次，每次4 h，合并3 次提取液，減壓濃縮蒸干，得到固體，用研缽研勻，備用。

分組、建模與給藥：將60 只KM 小鼠隨機(jī)分為正常對照組［A組，等體積0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液］，模型組（B 組，等體積0.5%CMC-Na 溶液），水飛薊素組（C 組，200 mg/ kg），黃芩素高、中、低劑量組（D1組、D2組、D3組，10，5，2.5 mg/kg），各10 只。灌胃黃藥子醇提物（3 g/kg），每日上午1 次，連續(xù)14 d，以復(fù)制肝損傷小鼠模型，同期（每日下午）各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物或0.5%CMC-Na 溶液。末次給藥結(jié)束后，禁食不禁飲12 h。

1.3 觀察指標(biāo)

體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量與肝臟系數(shù)：稱定小鼠體質(zhì)量。眼眶取血后，取肝臟組織，置生理鹽水中去除血塊及結(jié)締組織等，用吸水紙吸干表面的水分，稱定肝臟質(zhì)量。計算肝臟系數(shù)（肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值）。

肝臟組織病理檢查：取小鼠肝臟組織，剪取一部分固定于4%多聚甲醛溶液中，3 d 后進(jìn)行石蠟包埋、切片及HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

生化指標(biāo)：眼眶取血，4 ℃下4 000 r/min離心10 min，取上清液。采用試劑盒說明書方法分別測定肝功能指標(biāo)AST，ALT，ALP，TBiL 水平及抗氧化指標(biāo)SOD，CAT，GSH，MDA水平。

Nrf2蛋白調(diào)控的下游藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA水平：取小鼠肝臟組織，加入TRIpure 裂解液，充分混勻，室溫靜置5 min，加入氯仿，混勻，室溫靜置3 min，取水相，加入等量異丙醇，-20 ℃下過夜，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇，4 080 r/min 離心3 min，棄上清，加入RNase-free 雙蒸水，室溫放置2 min，充分混勻，待沉淀完全溶解，得樣本總RNA，采用紫外-可見分光光度法測定RNA 濃度。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)將樣本總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入Nrf2蛋白調(diào)控的下游藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）、P-糖蛋白（P-gp）、膽酸鹽外排泵（BSEP）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UGT1A1）基因引物，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）法檢測上述基因的mRNA水平。

蛋白表達(dá)水平：采用Western blot法。取小鼠肝臟組織，液氮研磨，加入蛋白裂解液，研成勻漿，冰上靜置5 min，4 ℃、12 000 r / min 離心10 min，分離蛋白質(zhì)抽提物。采用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，經(jīng)SDS - PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，用5%脫脂奶粉稀釋p - NF - κB p65，NF-κB p65，TNF-α，IL-6，Nrf2，HO-1等一抗，稀釋比例為1∶500，4 ℃下孵育過夜，浸入TBST 緩沖液中，用5%脫脂奶粉稀釋二抗，稀釋比例為1∶5 000，37 ℃下孵育45 min，采用電化學(xué)發(fā)光法在暗室中顯影，掃描膠片，分析目標(biāo)條帶的光密度值；同時提取細(xì)胞核Nrf2（Nuc-Nrf2）蛋白，同時測定光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；繪制柱狀圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝臟系數(shù)

與A 組比較，B 組小鼠體質(zhì)量顯著降低，肝臟質(zhì)量與肝臟系數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。與B 組比較，C 組、D1組小鼠肝臟質(zhì)量均顯著降低，C 組、D1組、D2組、D3組小鼠的肝臟系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖1。

a.體質(zhì)量 b.肝臟質(zhì)量 c.肝臟系數(shù)注：與A組比較，#P ＜0.05；與B組比較，*P ＜0.05。圖3至圖6同。圖1 小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)（±s，n=10）a.Body mass b.Liver mass c.Liver coefficientNote：Compared with those in the group A，#P ＜0.05.Compared with those in the group B，*P ＜0.05（for Fig.1 and Fig.3 - 6）.Fig.1 Body mass，liver mass and liver coefficient of mice（±s，n=10）

2.2 肝臟組織病理形態(tài)

A 組小鼠的肝細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)正常；B組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，邊緣模糊，界限不清，出現(xiàn)水腫及炎性因子浸潤，部分肝細(xì)胞核出現(xiàn)溶解；C 組小鼠肝細(xì)胞損傷得到好轉(zhuǎn)；D1組、D2組、D3組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)有好轉(zhuǎn)，且隨著劑量的增加，改善作用明顯增強(qiáng)。詳見圖2。

圖2 小鼠肝臟組織病理形態(tài)（HE，×400）Fig.2 Pathological morphology of liver tissue of mice（HE，× 400）

2.3 肝功能指標(biāo)

與A 組比較，B 組小鼠的AST，ALT，TBiL 水平均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組小鼠的AST，ALT，TBiL 水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3。

a.AST b.ALT c.TBiL d.ALP圖3 小鼠肝功能指標(biāo)（±s，n=10）a.AST b.ALT c.TBiL d.ALPFig.3 Liver function indexes of mice（±s，n=10）

2.4 抗氧化指標(biāo)

與A組比較，B組小鼠的MDA水平顯著升高，SOD，CAT，GSH 水平均顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D1組小鼠的MDA 水平顯著降低，C 組、D1組、D2組小鼠的SOD，CAT 水平均顯著升高，D3組小鼠的SOD 水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖4。

a.SOD b.CAT c.GSH d.MDA圖4 小鼠抗氧化指標(biāo)（±s，n=10）a.SOD b.CAT c.GSH d.MDAFig.4 Antioxidant indexes of mice（±s，n=10）

2.5 Nrf2 下游藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA 水平

與A 組 比較，B 組 小鼠 的MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 水平均顯著降低（P＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組 小 鼠 的MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA均顯著升高（P＜0.05）。詳見圖5。

a.MRP2 b.P-gp c.BSEP d.UGT1A1圖5 小鼠Nrf2下游藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA水平（±s，n=10）a.MRP2 b.P-gp c.BSEP d.UGT1A1Fig.5 mRNA levels of Nrf2 downstream drug transporters of mice（±s，n=10）

2.6 蛋白質(zhì)表達(dá)水平

與A組比較，B組小鼠的細(xì)胞核Nrf2，HO-1蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，p-NF-κB p65，TNF-α，IL-6蛋白的相對表達(dá)水平均顯著升高；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組小鼠前2種蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，后3種蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖6。

3 討論

黃芩素是黃芩發(fā)揮保肝作用的有效成分，屬黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化和抗炎作用，對四氯化碳、半乳糖胺、對乙酰氨基酚及卡介苗加脂多糖所致肝損傷具有顯著的防護(hù)作用。本研究中，黃芩素干預(yù)后，細(xì)胞核Nrf2表達(dá)上調(diào)，NF-κB p65磷酸化過程被抑制，提示黃芩素可激活Nrf2/NF - κB 通路，啟動其下游的相關(guān)抗氧化蛋白的表達(dá)，抑制相關(guān)炎性因子的表達(dá)。Nrf2/ NF - κB 信號通路是肝損傷防護(hù)的有效途徑［8-10］。本研究中，B 組小鼠的細(xì)胞核Nrf2 蛋白表達(dá)水平，SOD，CAT，GSH 水平均顯著低于A 組，MDA 水平，p - NF - κB p65，TNF - α，IL - 6 蛋白表達(dá)水平均顯著高于A組，提示黃藥子誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠發(fā)生了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)。B 組小鼠肝細(xì)胞中，Nrf2 蛋白調(diào)控的下游藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 表達(dá)水平均顯著低于A 組，提示肝損傷模型小鼠轉(zhuǎn)運(yùn)黃藥子提取物及其代謝物的量相對減少，易產(chǎn)生藥物蓄積損傷肝臟。

本研究中，與B 組比較，D1組、D2組、D3組小鼠的SOD，CAT，GSH 水平均顯著升高，MDA 水平顯著降低，TNF- α 和IL- 6 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示黃芩素對黃藥子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)具有改善作用。本研究中，黃芩素干預(yù)后，D1組、D2組、D3組小鼠的細(xì)胞核Nrf2 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，肝細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2，P-gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 水平均顯著升高；且Nrf2 蛋白激活后誘導(dǎo)下游的轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)錄，對于減輕藥物性肝損傷具有重要作用［11-16］，提示黃芩素對黃藥子誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有防護(hù)作用可能與激活Nrf2/ NF - κB 信號通路及其下游的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)。AST，ALT，ALP，TBiL 是臨床診斷肝功能損傷的常用指標(biāo)［17］。B 組小鼠的AST，ALT，TBiL 指標(biāo)較A 組顯著均升高，提示B 組小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)了損傷壞死；D1組、D2組、D3組小鼠的上述指標(biāo)水平均顯著低于B 組，提示黃芩素能改善小鼠肝損傷。該檢測結(jié)果與肝臟組織病理形態(tài)觀察結(jié)果相符。

綜上所述，黃芩素對黃藥子誘導(dǎo)的肝損傷有一定防護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與通過Nrf2/NF - κB 信號通路，激活其下游的轉(zhuǎn)運(yùn)體及提高抗氧化、抗炎水平有關(guān)。