內(nèi)吞適配蛋白Epsin3在乳腺癌中的表達(dá)及預(yù)后分析

趙小芳 凌存保 顏聲祥 張虎

基金項(xiàng)目：鹽城市科技局項(xiàng)目（YK2018066）

作者簡(jiǎn)介：趙小芳，女，碩士研究生，講師。

【摘要】 目的 基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，分析內(nèi)吞適配蛋白Epsin3（EPN3）在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)門(mén)戶網(wǎng)站UALCAN、cBioPortal、Oncomine等分析EPN3在乳腺癌中的表達(dá)變化及預(yù)后關(guān)系；應(yīng)用癌癥多組學(xué)分析數(shù)據(jù)平臺(tái)LinkedOmics分析在乳腺癌中EPN3的表達(dá)變化與臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果 乳腺導(dǎo)管癌中EPN3基因表達(dá)較正常乳腺組織顯著上調(diào)（P＜0.01）且EPN3高表達(dá)不利于患者預(yù)后；乳腺癌中EPN3的表達(dá)受組織學(xué)類型、病理階段、病理T階段、病理N階段、原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體、雌激素受體、孕激素受體、PM50類型、患者種族、腫瘤純度、年齡和淋巴結(jié)數(shù)量的影響（P＜0.05）。結(jié)論 EPN3高表達(dá)不利于乳腺癌預(yù)后，可作為篩選和治療乳腺癌的相關(guān)靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌；內(nèi)吞適配蛋白Epsin3；預(yù)后

Expression and prognosis of endocytic adaptor protein Epsin3 in breast cancer

Zhao Xiaofang，Lin Cunbao，Yan Shengxiang，Zhang Hu. Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng， Jiangsu? 224005

【Abstract】 Objective To investigate the expression，prognostic significance and functional mechanism of Epsin3 （EPN3） based on TCGA analysis. Methods The expression and prognostic significance of EPN3 in breast cancer was analyzed by TCGA portal UALCAN.Analysis of the changes of EPN3 in breast cancer and its relationship with clinical prognosis through LinkedOmics. Results EPN3 is highly expressed in breast cancer （P＜0.01） and is not conducive to prognosis .The expression of EPN3 in breast cancer is affected by histological type，pathological stage，pathological T stage， pathological N stage， proto-oncogene human epidermal growth factor receptor， estrogen receptor， progesterone receptor， PM50 type， patient ethnicity， tumor purity ，age and the number of lymph nodes（P＜0.05）. Conclusion EPN3 is highly expressed in breast cancer and is not conducive to prognosis. EPN3 can be used as a target for screening and treatment of breast cancer.

【Key words】Breast cancer；Epsin3；Prognostic

中圖分類號(hào)：R581.9? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1672-1721（2023）31-0010-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.31.004

乳腺癌（breast cancer，BC）是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）

2020年發(fā)布的全球最新惡性腫瘤負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，是全球第一大惡性腫瘤[1]。隨著醫(yī)療科技水平的提高，乳腺癌治療預(yù)后效果良好，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致乳腺癌病人死亡的主要因素。我國(guó)乳腺癌發(fā)病率高達(dá)25.89/10萬(wàn)，占所有女性惡性腫瘤發(fā)病率的 16.83%[2]。我國(guó)乳腺癌患病人數(shù)占總?cè)藬?shù)的比例不斷增加，且患病年齡呈下降趨勢(shì)，對(duì)女性的健康、生活造成嚴(yán)重威脅，給醫(yī)療保健和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。尋找和研究新的乳腺癌發(fā)生和預(yù)后相關(guān)靶分子對(duì)乳腺癌患者具有重要意義。

內(nèi)吞適配蛋白Epsin3（EPN3）是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞適應(yīng)蛋白家族Epsin的成員之一[3]。Epsin是一種保守的內(nèi)吞性網(wǎng)格蛋白適配器，其網(wǎng)格蛋白膜動(dòng)力學(xué)中的重要功能尚不明確[4]。據(jù)報(bào)道，Epsin在皮膚癌、肺癌、前列腺癌幾種惡性腫瘤中被上調(diào)，且通過(guò)抑制內(nèi)吞網(wǎng)格蛋白包被小窩的肌動(dòng)蛋白依賴性，抑制細(xì)胞內(nèi)吞作用[5]。重要的是Epsin的缺失或下調(diào)可減少腫瘤的發(fā)生，從而證明Epsin具有致癌作用[6]。已有研究表明，Epsin家族促進(jìn)纖維肉瘤遷移和侵襲[7]，且其與Notch信號(hào)通路的激活有關(guān)[8]。

EPN3是一種蛋白質(zhì)編碼基因，又稱EPS-15相互作用蛋白3，它主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞外與細(xì)胞核內(nèi)。有文獻(xiàn)報(bào)道，EPN3可作為一種細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)的針對(duì)損傷上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物[9]，且EPN3基因的異位表達(dá)可影響足葉乙甙誘導(dǎo)的衰老表型[10]。其相關(guān)途徑與PAK和上皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的內(nèi)吞有關(guān)。但是，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，EPN3的具體作用機(jī)制尚不清楚。通過(guò)研究乳腺癌中靶分子EPN3的作用，補(bǔ)充乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為乳腺癌在患者預(yù)后時(shí)提供候選標(biāo)志物和對(duì)于提高患者生存率至關(guān)重要。

1? ?材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 數(shù)據(jù)通過(guò)腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）門(mén)戶網(wǎng)站UALCAN、cBioPortal，癌癥芯片數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine獲得，深入分析TCGA基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，可查詢腫瘤和正常組織中基因的差異表達(dá)。通過(guò)癌癥多組學(xué)分析數(shù)據(jù)平臺(tái)LinkedOmics可分析基因表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。

1.2 分析方法 打開(kāi)cBioPortal網(wǎng)站首頁(yè)，選擇“breast invasive carcinoma （TCGA Provisional）”數(shù)據(jù)集，病例組選擇“tumor samples with mRNA data （RNA Seq V2）（1100）”，分別分析EPN3基因的突變、拷貝數(shù)畸變、mRNA水平變化以及EPN3表達(dá)上調(diào)與患者預(yù)后的關(guān)系。進(jìn)入 UALCAN網(wǎng)站首頁(yè)，選擇“breast invasive carcinoma” 數(shù)據(jù)庫(kù)類型，輸入基因名稱“EPN3”，分析在乳腺癌中EPN3基因表達(dá)變化及它與預(yù)后生存率的關(guān)系。進(jìn)入LinkedOmics網(wǎng)站首頁(yè)，癌癥類型選擇“TCGA_BRCA”，繼而選擇“HiSeq RNA”檢索數(shù)據(jù)集，輸入 基因“EPN3”，選擇“Clinical”數(shù)據(jù)集，統(tǒng)計(jì)方法選擇“non-parametrict test”，下載P＜0.05的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中EPN3基因的表達(dá) cBioPortal篩選出EPN3基因在乳腺癌患者中呈高表達(dá)且不利于預(yù)后?；赥CGA多組學(xué)高通量數(shù)據(jù)篩選，研究發(fā)現(xiàn)乳腺導(dǎo)管癌EPN3基因的表達(dá)較正常乳腺組織明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖1D）。其中，15%的乳腺癌患者中 EPN3（EXP≥2）基因呈高表達(dá)（圖1B），且EPN3高表達(dá)不利于患者預(yù)后（P＜0.01）（圖1C）；而16%的乳腺癌患者發(fā)生EPN3基因改變，包括基因突變（錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔儯⒖截悢?shù)變化和 mRNA 的變化（圖1A）。

2.2 乳腺癌中EPN3表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)

性 通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)乳腺癌中EPN3的表達(dá)受到組織學(xué)類型、病理階段、病理T階段、病理N階段、患者種族、腫瘤純度、年齡和淋巴結(jié)數(shù)量的影響（P＜0.05）（圖2A、B、C、D、I、J、K、L）；原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性患者中EPN3的表達(dá)顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2E）；孕激素受體陽(yáng)性患者中EPN3的表達(dá)顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2F）；雌激素受體陽(yáng)性患者中EPN3的表達(dá)顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2G）；不同PAM50亞型乳腺癌中EPN3的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2H）。

2.3 基因拷貝數(shù)畸變和甲基化水平對(duì)EPN3表達(dá)的影響 Linkedomics篩選TCGA多組學(xué)高通量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，EPN3的表達(dá)與其基因拷貝數(shù)增加呈顯著正相關(guān)，而與其DNA甲基化水平呈顯著負(fù)相關(guān)（圖3）。

3 討論

Epsins作為內(nèi)吞輔助蛋白或替代受體（用于EGFR和VEGFR2等蛋白受體），在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和網(wǎng)格蛋白非依賴性的貨物內(nèi)化中起著關(guān)鍵的生理作用，作為內(nèi)吞作用的補(bǔ)充，Epsins還具有信號(hào)功能并參與多種細(xì)胞活動(dòng)[11]。Epsins可參與包括細(xì)胞增殖、黏附、凋亡以及血管形成等，不僅在正常的組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。研究表明，Epsins與多種腫瘤的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]。已有不少研究表明，Epsin蛋白家族可作為致癌調(diào)節(jié)因子參與惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程[5]。Epsins家族成員EPN1、EPN2 在前列腺癌、肺癌及人類皮膚癌中的表達(dá)上調(diào)[6-7，12]，并發(fā)現(xiàn)在胃癌、結(jié)腸癌及基底細(xì)胞癌中EPN3的表達(dá)升高[13]。

另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EPN與P53存在相關(guān)性，Epsins可負(fù)向調(diào)節(jié)IFN-α-p53途徑下游的乙型肝炎病毒RNA的表達(dá)[14]，并且有促進(jìn)細(xì)胞衰老的作用。然而另有研究指出，細(xì)胞的內(nèi)吞作用負(fù)向調(diào)控衰老是在細(xì)胞正常的生長(zhǎng)狀態(tài)下進(jìn)行的[15]，但Epsins介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用可促進(jìn)細(xì)胞自噬，有助于誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[16-17]。有研究表明，EPN3通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子Slug、Twist和ZEB1而不是Snail 1或ZEB2來(lái)增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，從而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT[18]。

綜合以上研究，提示EPN3可能在細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移的過(guò)程中起著非常重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)EPN3在乳腺癌中呈高表達(dá)，其原因可能在于EPN3的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)指出，EPN3可通過(guò)調(diào)節(jié)ER陽(yáng)性乳腺癌中的NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞中，乳腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因素增加與Notch 信號(hào)通路的激活呈正相關(guān)，而EPN3可能參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞Notch 1 信號(hào)的激活[18-19] ，從而激活相關(guān)信號(hào)通路。這與EPN3的高表達(dá)不利于患者預(yù)后結(jié)果相一致。

通過(guò)LinkedOmics數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌在不同的病理階段或不同的組織學(xué)類型中，EPN3的表達(dá)變化也不同。這提示EPN3可能在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的不同階段起作用。在乳腺癌患者中，原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性患者中EPN3的表達(dá)顯著高于陰性患者，雌激素受體陽(yáng)性患者中EPN3的表達(dá)顯著高于陰性患者，這與Hellwig在非小細(xì)胞肺癌和雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌中，EPN3的高表達(dá)與晚期轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的研究結(jié)果一致[6]。而不同種族和年齡的乳腺癌患者中EPN3的表達(dá)也具有差異，表明EPN3的表達(dá)可能具有地域和時(shí)間的特異性。乳腺癌在不同種族、不同年齡及不同病理表現(xiàn)中EPN3表達(dá)變化不同，提示乳腺癌發(fā)生和發(fā)展具有個(gè)體差異，即腫瘤的異質(zhì)性。

為了揭示靶分子EPN3表達(dá)增加的上游調(diào)節(jié)機(jī)制，研究分別進(jìn)行了基因拷貝數(shù)畸變CNA、DNA甲基化的分析和驗(yàn)證工作。結(jié)果顯示，基因拷貝數(shù)畸變CNA、DNA甲基化在腫瘤發(fā)展中起重要作用。腫瘤相關(guān)基因的拷貝數(shù)畸變可以激活癌基因促進(jìn)或抑制抑癌基因的表達(dá)。基因的拷貝數(shù)畸變可使基因劑量發(fā)生改變或者調(diào)節(jié)基因的表達(dá)活性，從而促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起作用[20]。研究表明，在表觀遺傳學(xué)中DNA的甲基化有重要作用，特別是基因啟動(dòng)子區(qū)，其甲基化可影響基因的表達(dá)。DNA的低甲基化可以促進(jìn)癌基因的表達(dá)，而DNA的高甲基化可以沉默腫瘤抑制基因。在臨床上，通過(guò)檢測(cè)特定癌基因的拷貝數(shù)畸變可以指導(dǎo)疾病的治療和預(yù)后，而藥物干預(yù)基因的甲基化也是惡性腫瘤治療中的重要研究方向。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，EPN3的基因拷貝數(shù)畸變與DNA甲基化具有相關(guān)性。

迄今為止，EPN3在癌癥的病理發(fā)展或?qū)M織和細(xì)胞特異性的具體作用仍未知。此次項(xiàng)目研究了EPN3在乳腺癌組織中的表達(dá)及EPN3在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用。研究結(jié)果顯示，EPN3作為致癌基因編碼的蛋白質(zhì)可能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。抑制EPN3可能會(huì)激活或抑制某種機(jī)制，以抑制乳腺癌的發(fā)病及進(jìn)展。盡管此次研究結(jié)果只是基于高通量數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，但也為乳腺癌的治療及其預(yù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)提供了相關(guān)思路，后續(xù)將繼續(xù)研究臨床乳腺癌患者EPN3高表達(dá)的具體機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] SUNG H，F(xiàn)ERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics 2020：globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J

Clin，2021，71（3）：209-249.

[2] CAI T，QIAN J，YUAN C，et al.Dyadic coping in couples with breast cancer in China[J].Cancer Nurs，2021，44（6）：E458-E466.

[3] DONG Y，LEE Y，CUI K，et al.Epsin-mediated degradation of ip3r1 fuels atherosclerosis[J].Nat Commun，2020，11（1）：3984.

[4] HELLWIG B，MADJAR K，EDLUND K，et al.Epsin family member 3 and ribosome-related genes are associated with late metastasis in estrogen receptor-positive breast cancer and long-term survival in non-small cell lung cancer using a genome-wide identification and validation strategy[J].PLoS One，2016，11（12）：e0167585.

[5] JOSEPH J G，CARLOS O，YEE V，et al.Complimentary action of structured and unstructured domains of epsin supports clathrin-mediated endocytosis at high tension[J].Commun Biol，2020，（1）3：743.

[6] TESSNEER K L，PASULA S，CAI X，et al.Endocytic adaptor protein epsin is elevated in prostate cancer and required for cancer progression[J].ISRN Oncol，2013（4）：420597.

[7] WANG Y，SONG W，KAN P，et al.Overexpression of epsin3 enhances migration and invasion of glioma cells by inducing epithelial-mesenchymal transition[J].Oncol Rep，2018，40（5）：3049-3059.

[8] COON B G，DIRENZO D M，KONIECZNY S F，et al.Epsins' novel role in cancer cell invasion[J].Commun Integr Biol，2011，

4（1）：95-97.

[9]? ? ?OVERSTREET E，F(xiàn)ITCH E，F(xiàn)ISCHER J A.Fat facets and liquid facets promote delta endocytosis and delta signaling in the signaling cells[J].Development，2004，131（21）：5355-5366.

[10] ? NAGANO? T，NAKANO? M，NAKASHIMA A，et al. Identification of cellular senescence-specific genes by comparative transcriptomics[J].Sci Rep，2016，1（6）：31758.

[11] ? WANG Y，PEDIGO C E，INOUE K，et al.Murine epsins play an integral role in podocyte function[J].J Am Soc Nephrol，2020，31

（12）：2870-2886.

[12] KO G，PARADISE S，CHEN H，et al.Selective high-level expression of epsin 3 in gastric parietal cells，where it is localized at endocytic sites of apical canaliculi[J].Proc Natl Acad Sci of? USA，2010，107（50）：21511-21516.

[13] ? ?SPRADLING K D，MCDANIEL A E，LOHI J，et al.Epsin 3 is a novel extracellular matrix-induced transcript specific to wounded epithelia[J].J CHEM-NY，2001，276（31）：29257-

29267.

[14] ? ?LI X，WANG Z，ZHOU W，et al. Interferon-alpha responsible EPN3 regulates hepatitis B virus replication[J].Front Med

（Lausanne），2022（9）：944489.

[15] ? ?MORI J，TANIKAWA C，OHNISHI N，et al.EPSIN 3，a novel p53 target，regulates the apoptotic pathway and gastric carcinogenesis[J].Neoplasia，2017，19（3）：185-195.

[16] ? ?GARCIA-ALAI M M，HEIDEMANN J，SKRUZNY M，et al.Epsin and Sla2 form assemblies through phospholipid interfaces[J].Nat Commun，2018，9（1）：328.

[17] ? ?RAVIKUMAR B，MOREAU K，RUBINSZTEIN D C.Plasma membrane helps autophagosomes grow[J].Autophagy，2010，6（8）：1184-1186.

[18] ? ? 王亞茹.Epsin3通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲[D].天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2018.

[19] ? ? ABRAVANEL D L，BELKA G K，PAN T C，et al.notch promotes recurrence of dormant tumor cells following her2/neu-targeted therapy[J].J Clin Invest，2015，125（6）：2484-2496.

[20] ? ? 張虎，杜欣娜，莊瑩，等.乳腺癌中跨膜蛋白81基因高表達(dá)不利于患者預(yù)后[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2018，36（5）：

586-589.（收稿日期：2023-08-21）