超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血清美羅培南濃度的研究

朱丹萍 羅敬銘 蔡鑫君

美羅培南是一種抗菌譜較廣的碳青霉烯類(lèi)抗生素，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌等病原體具有很強(qiáng)的抗菌活性，臨床上主要用于多重耐藥菌感染的治療[1-2]。靜脈給予美羅培南后，其在體內(nèi)分布廣，大部分藥物以原型經(jīng)腎臟排出，半衰期約為1 h[3]。美羅培南屬于時(shí)間依賴(lài)性抗生素，具有相對(duì)較長(zhǎng)的抗生素后效應(yīng)，且血漿中的抗生素濃度超過(guò)致病菌的最低抑制濃度才能達(dá)到足夠的殺菌效果；同時(shí)合并多種疾病的危重癥患者的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)會(huì)發(fā)生變化[4]。有部分證據(jù)證實(shí)，根據(jù)血藥濃度采取積極的措施調(diào)整美羅培南用量有利于患者預(yù)后[5]。因此，在使用美羅培南的過(guò)程中引入治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM），可以為用藥劑量的調(diào)整提供重要的參考依據(jù)，以達(dá)到提高療效、減少毒副作用的目的[6]。

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）是一種具有高度敏感性和選擇性的檢測(cè)方法，被用于多種抗生素類(lèi)藥物的血藥濃度監(jiān)測(cè)。與高效液相色譜法相比較，UPLC-MS/MS 具有檢測(cè)速度快，靈敏度更高，不要求被分析物峰完全分離，樣本需求量更少等優(yōu)勢(shì)[7]。本研究旨在開(kāi)發(fā)一種高效、快速、準(zhǔn)確的UPLC-MS/MS，用于測(cè)定人血清中的美羅培南濃度。

1 材料與方法

1.1 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品 甲醇和乙腈為質(zhì)譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Supelco 公司，HPLC 級(jí)乙腈購(gòu)自美國(guó)的Honeywell 公司，質(zhì)譜級(jí)甲酸購(gòu)自上海Macklin 公司。使用的色譜柱ZORBAX PRHD SB-Aq（3×50 mm，1.8 μm）購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)美羅培南購(gòu)自中檢所，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)美羅培南-D6 購(gòu)自Bepure 公司。

1.2 儀 器 UPLC-MS/MS 系統(tǒng)由Xevo TQ-S IVD三重四極桿質(zhì)譜儀和ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters Corporation，MLF，USA）組成。其他儀器還有：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5425R，德國(guó)）、超純水儀（Heal Force SMART-N，香港）、渦旋混合器（Vortex-Genie2，美國(guó)）和移液器（Eppendorf，德國(guó)）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液、內(nèi)標(biāo)工作液和質(zhì)控樣品的制備精密稱(chēng)取一定量的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品，溶于超純水中，配制成濃度為1 mg/mL 的儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)取一定量的美羅培南-D6 內(nèi)標(biāo)，溶于甲醇中，配制成1 mg/mL濃度的儲(chǔ)備液。以超純水為稀釋劑，配制美羅培南含量分別為1000、400、200、100、40、20、10、5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液10 μL 加入到9.99 mL的甲醇溶液中，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

按照上述方法，制備4 個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，分別為定量下限（5 μg/mL）、低濃度質(zhì)控樣品（10 μg/mL）、中等濃度質(zhì)控樣品（200 μg/mL）、高濃度質(zhì)控樣品（800 μg/mL）。

1.4 樣品的制備 取血清45 μL 于1.5 mL 離心管中，加入5 μL 的標(biāo)曲或質(zhì)控溶液混勻，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL 沉淀。渦旋混勻后在4 ℃，12000 r/min 條件下離心5 min。然后將100 μL 的上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加入400 μL 的超純水稀釋?zhuān)瑴u旋混勻后，取100 μL 樣品進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析。

1.5 UPLC-MS/MS 條件 流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B 為甲醇。流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)時(shí)間為4.5 min。色譜柱為ZORBAX PRHD SBAq（3×50 mm，1.8 μm）。進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

時(shí)間（min）0 0.5 2 3.5 4.5 A（%）95 95 B（%）55 55 95 95 95 5

質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源，質(zhì)譜掃描模式為正離子模式（ESI，MS+）。電壓設(shè)定為3.00 kV。解吸氣體溫度和流速為500 ℃，900 L/Hr。錐形氣體流速為150 L/Hr，噴霧氣體壓力設(shè)定為7.00 Bar。此外，碰撞氣體的流速為0.16 mL/min。具體參數(shù)見(jiàn)表2。

化合物美羅培南美羅培南-D6母離子（m/z）384.40 390.28子離子（m/z）254.30 346.30錐孔電壓（V）20 2碰撞電壓（V）20 8

1.6 方法驗(yàn)證

1.6.1 選擇性 按照“1.4”的方法采用6 個(gè)不同來(lái)源的血清分別制備空白基質(zhì)樣品，按照“1.4”的方法處理美羅培南定量下限樣品。將空白基質(zhì)樣品的響應(yīng)值和定量下限樣品的響應(yīng)值進(jìn)行比較?？瞻谆|(zhì)樣品中美羅培南的響應(yīng)值不能超過(guò)定量下限樣品中響應(yīng)值的20%，內(nèi)標(biāo)則不能超過(guò)5%。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 根據(jù)美羅培南的有效治療范圍確定美羅培南的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍，采用同位素內(nèi)標(biāo)定量法，利用MassLynx 軟件以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X 軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為Y 軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.6.3 準(zhǔn)確度和精密度 在四個(gè)濃度水平（定量下限、低質(zhì)控濃度、中等質(zhì)控濃度和高質(zhì)控濃度）建立了QC 樣品，每個(gè)QC 樣品有6 個(gè)重復(fù)。在3 d 內(nèi)進(jìn)行了至少3 批次的分析，獲得的數(shù)據(jù)用來(lái)驗(yàn)證批次內(nèi)和批次間的準(zhǔn)確度和精密度。

準(zhǔn)確度是指測(cè)量濃度與標(biāo)稱(chēng)濃度之間的百分比差異。準(zhǔn)確度的接受標(biāo)準(zhǔn)是在除定量下限以外的質(zhì)控濃度水平上，測(cè)量濃度和標(biāo)稱(chēng)濃度之間的差異小于15%（在定量下限水平上小于20%）。精密度是指重復(fù)樣品的測(cè)量值的變異系數(shù)。精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)是在定量下限以外的質(zhì)量控制濃度水平上，變異系數(shù)小于15%（在定量下限水平上小于20%）。

1.6.4 基質(zhì)效應(yīng)和殘留效應(yīng) 本方法在兩個(gè)濃度水平（低質(zhì)控濃度和高質(zhì)控濃度）驗(yàn)證了基質(zhì)效應(yīng)。采用不同來(lái)源的血清制備了多個(gè)空白基質(zhì)樣本（n=6），將它們與不含基質(zhì)的樣品（n=3）做對(duì)比。由此計(jì)算出內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。

為了驗(yàn)證殘留效應(yīng)，在連續(xù)進(jìn)樣三次高質(zhì)控濃度樣品后，立即進(jìn)樣一次空白基質(zhì)樣品，重復(fù)多次。空白基質(zhì)樣品中的美羅培南信號(hào)應(yīng)當(dāng)小于定量下限水平的20%，內(nèi)標(biāo)信號(hào)應(yīng)當(dāng)小于5%。

1.6.5 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 為驗(yàn)證美羅培南在-20 ℃儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性，配制了定量下限和定量上限溶液，存放在-20 ℃冰箱14 d、28 d，采用超純水將新鮮配制的定量下限、定量上限溶液一起稀釋至定量下限濃度，平行配制各6 份，以存放在-20 ℃冰箱14 d、30 d 溶液與新鮮配制溶液的峰面積比值來(lái)評(píng)價(jià)藥物的穩(wěn)定性，峰面積變化在±15%以?xún)?nèi)證明其穩(wěn)定。

2 結(jié) 果

2.1 選擇性 美羅培南和美羅培南-D6 的出峰時(shí)間都為2 min（見(jiàn)圖1A～D），但是UPLC-MS/MS 法按照分子量作為區(qū)分不同化合物的依據(jù)，因此相同的出峰時(shí)間也可以準(zhǔn)確定量美羅培南和內(nèi)標(biāo)。選擇性結(jié)果顯示空白基質(zhì)樣品中美羅培南色譜峰響應(yīng)極低，不存在造成干擾的內(nèi)源性物質(zhì)（見(jiàn)圖1E）。

圖1 美羅培南內(nèi)標(biāo)（A），標(biāo)準(zhǔn)品的低、中、高質(zhì)控樣本（B～D）和空白基質(zhì)樣本（E）的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，美羅培南的回歸方程為y=0.1370*x-0.0042（R2=0.997），在0.5～100 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，定量下限為0.5 μg/mL。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 在3 d 內(nèi)進(jìn)行了3 個(gè)批次（n=6）質(zhì)控樣品的檢測(cè)，美羅培南的批內(nèi)，批間準(zhǔn)確度、精密度見(jiàn)表3。其中定量下限的批內(nèi)精密度不超過(guò)1.61%；批間準(zhǔn)確度在100.40%～107.10%之間，批間精密度不超過(guò)2.23%。低質(zhì)控濃度的批內(nèi)精密度不超過(guò)1.57%；批間準(zhǔn)確度在88.90%～95.90%之間，批間精密度不超過(guò)2.26%。中質(zhì)控濃度的批內(nèi)精密度不超過(guò)1.41%；批間準(zhǔn)確度在94.50%～99.60%之間，批間精密度不超過(guò)1.31%。高質(zhì)控濃度的批內(nèi)精密度不超過(guò)1.29%；批間準(zhǔn)確度在97.90%～114.00%之間，批間精密度不超過(guò)6.27%。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)和殘留效應(yīng) 在低質(zhì)控濃度和高質(zhì)控濃度上，使用6 個(gè)不同來(lái)源的基質(zhì)制備的樣品來(lái)評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表4。低質(zhì)控濃度下，美羅培南的基質(zhì)效應(yīng)因子在1.026～1.056 之間，而高質(zhì)控濃度下，則在1.090～1.104 之間。

在最高濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)樣后，空白基質(zhì)樣品中的美羅培南的信號(hào)在0.86%～5.51%之間，而內(nèi)標(biāo)的信號(hào)幾乎沒(méi)有（0%～0.04%）。因此，可以認(rèn)為該分析方法沒(méi)有殘留效應(yīng)。

化合物美羅培南質(zhì)控濃度定量下限低質(zhì)控濃度中質(zhì)控濃度高質(zhì)控濃度標(biāo)稱(chēng)濃度（μg/mL）0.5 1 20 80批內(nèi)批間準(zhǔn)確度（RE，%）3.10/7.10-11.10/-8.90-3.60/-0.40 12.00/14.00精密度（CV，%）1.61 1.57 1.41 1.29準(zhǔn)確度（RE，%）0.40/7.10-11.10/-4.10-5.50/-0.40-2.10/14.00精密度（CV，%）2.23 2.26 1.31 6.27

2.5 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 美羅培南的14 d 穩(wěn)定性和28 d穩(wěn)定性的結(jié)果（以回收率表示）見(jiàn)表4。儲(chǔ)存14 d 和28 d 的定量上限和定量下限溶液峰面積變化在±15%以?xún)?nèi)，說(shuō)明在-20 ℃的儲(chǔ)存條件下，美羅培南在28 d 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3 討 論

本研究建立了UPLC-MS/MS 法測(cè)定人血清中美羅培南的濃度，該方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，樣品分析時(shí)間為4.5 min，縮短了樣品檢測(cè)時(shí)間，能夠滿(mǎn)足臨床監(jiān)測(cè)的需求。

美羅培南具有時(shí)間依賴(lài)性，游離抗生素濃度超過(guò)最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的時(shí)間百分比是其療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)，美羅培南的血藥濃度保持在MIC 以上的時(shí)間越長(zhǎng)，其臨床治療的成功率就越高，濃度不足可能會(huì)導(dǎo)致患者治療失敗并增加細(xì)菌耐藥的可能性[8]。另一方面，腎功能下降也可能導(dǎo)致血藥濃度增加，從而導(dǎo)致血藥濃度增加、產(chǎn)生潛在毒性[9]。因此，開(kāi)展美羅培南的TDM，一方面可以解決藥物劑量不足的問(wèn)題，避免耐藥情況的發(fā)生，另外一方面還可以?xún)?yōu)化腎功能不全患者的給藥方案。在達(dá)到治療目標(biāo)的前提下，給予患者更精準(zhǔn)的藥物劑量，不但可以改善臨床療效，避免毒副作用，同時(shí)還可以節(jié)省大量的醫(yī)療費(fèi)用。

本研究建立的檢測(cè)方法的線(xiàn)性范圍廣，在0.5 ～100 μg/mL 之間，涵蓋了美羅培南的臨床治療血藥濃度范圍。同時(shí)該方法選擇性良好，準(zhǔn)確度和精密度符合要求，無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)和殘留效應(yīng)，儲(chǔ)備液在-20 ℃的穩(wěn)定性良好。但美羅培南在室溫下易降解、穩(wěn)定性差，應(yīng)在樣本采集后盡快完成樣本處理、檢測(cè)，如不能在第一時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)將美羅培南血液樣本離心后，置于-80 ℃保存[10]。綜上所述，本研究建立了準(zhǔn)確、可靠、簡(jiǎn)單、快速的美羅培南檢測(cè)分析方法，以期為美羅培南藥物的臨床監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。