脫水劑中添加伊紅在腎活檢病理組織標(biāo)本預(yù)染色中的應(yīng)用

成俊，葉瓊瑤，呂漪妮

浙江省臺(tái)州醫(yī)院 （浙江臺(tái)州 317000）

腎活檢病理是診斷腎臟疾病的常用手段，通過(guò)判斷腎活檢組織學(xué)改變對(duì)疾病類型命名，如膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化等，均通過(guò)病理組織診斷，所以腎活檢病理組織標(biāo)本的制作質(zhì)量與疾病診斷的準(zhǔn)確性緊密相關(guān)。染色不清晰、切片不夠薄等都會(huì)導(dǎo)致診斷錯(cuò)誤，對(duì)患者身心造成嚴(yán)重?fù)p害[1-2]，所以應(yīng)重視腎活檢病理組織標(biāo)本的處理環(huán)節(jié)。隨著現(xiàn)代病理技術(shù)的不斷發(fā)展，脫水—透明—浸蠟等前期病理組織標(biāo)本處理均已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。另外，腎活檢病理組織標(biāo)本為包埋工作中常見(jiàn)的一種標(biāo)本，包埋石蠟顏色相近的大標(biāo)本和小標(biāo)本，極易混淆技術(shù)員的判斷，一旦遺漏將造成嚴(yán)重醫(yī)療事故。因此，如何高質(zhì)量、高效率地切片成為病理技術(shù)與病理診斷的關(guān)鍵[3]。本研究基于Leica ASP300 S 脫水機(jī)的使用方法，對(duì)脫水機(jī)脫水劑中添加醇溶性伊紅試劑在腎活檢病理組織標(biāo)本中的預(yù)染色情況進(jìn)行分析，探討其可行性與臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取2023 年1—3 月我院病理科腎活檢病理組織標(biāo)本44 例為研究對(duì)象。病理組織取材過(guò)程由專業(yè)技術(shù)員到場(chǎng)，處理穿刺獲取的組織時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，不得出現(xiàn)外力牽拉、用力擠壓等情況。在蠟板上進(jìn)行組織分取，并用刀片快速切割。用含固定液和0.9%氯化鈉注射液的鑷子將病理組織塊轉(zhuǎn)移到固定瓶中。

1.2 試劑與儀器

本研究使用的試劑與儀器見(jiàn)表1。

1.3 脫水機(jī)的使用方法

Leica ASP300 S 脫水機(jī)主要由顯示器、脫水缸、液位傳感器、石蠟缸、試劑櫥、活性炭濾網(wǎng)、收集盤、石蠟和試劑外接排液口、脫水籃構(gòu)成[4-5]。開(kāi)機(jī)后需在管理員模式下進(jìn)行儀器設(shè)置，包括語(yǔ)言、時(shí)間、溫度、運(yùn)行順序、試劑位置等方面。儀器設(shè)置后需進(jìn)行試劑與石蠟填充，填充結(jié)束后更改試劑狀態(tài)，將所有填充的試劑與石蠟均設(shè)置為滿。每日運(yùn)行程序前，對(duì)脫水缸的清潔度、試劑與石蠟的充足情況進(jìn)行檢查。包埋結(jié)束后清洗脫水缸，每周檢查冷凝瓶和滴液盤，每3 個(gè)月更換1 次活性炭濾網(wǎng)[6]。使用過(guò)程中需注意，不可用附帶塑料刮鏟以外的材料清潔脫水缸、石蠟缸、密封圈；每次包埋后脫水籃和包埋盒須進(jìn)行1 次標(biāo)準(zhǔn)清洗；使用金屬包埋盒須使金屬面保持朝向一致，放入脫水缸后，金屬蓋面須背離液位傳感器；脫水后須檢查整個(gè)運(yùn)行流程是否報(bào)錯(cuò)；試劑運(yùn)行過(guò)程中出現(xiàn)報(bào)警狀況須及時(shí)聯(lián)系工作人員或查閱說(shuō)明書[7]。

1.4 腎活檢病理組織標(biāo)本預(yù)染色步驟

本研究中的固定、脫水、透明、浸透等一系列步驟均在Leica ASP300 S 脫水機(jī)中實(shí)施。（1）固定。固定光鏡標(biāo)本，需使用固定液，常用10%的中性緩沖福爾馬林固定液。配方為100 ml 的40%甲醛、900 ml 蒸餾水、4 g 磷酸二氫鈉、6.5 g 磷酸氫二鈉，固定5 h 即可[8]。（2）前期處理。第一步為脫水，目的是去除病理組織上固定的和水洗過(guò)程中組織所含的水分，方便后續(xù)透明與浸蠟流程操作。病理科常用的脫水劑為丙酮和乙醇，丙酮脫水能力更強(qiáng)，但易使組織收縮變脆，常用于快速脫水，所以本研究采用乙醇進(jìn)行脫水處理。為徹底脫水，一般采用不同濃度梯度的乙醇溶液。Leica ASP300 S脫水機(jī)可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)脫水，減少客觀失誤，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程。第二步為透明，目的是方便病理組織石蠟包埋，因?yàn)榻M織脫水后使用的脫水劑無(wú)法與石蠟混合，所以需通過(guò)透明劑進(jìn)行浸蠟。透明劑不但能與脫水劑進(jìn)行混合，還能與石蠟混合，去除脫水劑后，可取代脫水劑進(jìn)行浸蠟。當(dāng)組織被透明劑全部占有時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)。透明劑一般不溶于水，常見(jiàn)的有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、丁香油等。本研究使用二甲苯作為透明劑，不但價(jià)格低廉，而且透明力強(qiáng)，缺點(diǎn)是易使組織收縮變硬，所以透明時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)[9]，需在顯示器模塊設(shè)置相應(yīng)時(shí)間。第三步為浸蠟，組織病理標(biāo)本經(jīng)脫水、透明后，要使石蠟支持劑進(jìn)入組織內(nèi)部，使組織變硬，并使石蠟取代組織中的透明劑，變?yōu)橛杏捕鹊南瀴K，方便技術(shù)員實(shí)施切片處理。根據(jù)室溫選擇石蠟，室溫高時(shí)選擇熔點(diǎn)較高的石蠟，室溫低時(shí)選擇熔點(diǎn)較低的石蠟。第四步為切片，對(duì)蠟塊進(jìn)行連續(xù)切割，常規(guī)腎活檢病理切片厚度為4～5 μm，特殊染色切片厚度則需保持6 μm 左右[10]（人工處理）。（3）染色。伊紅試劑預(yù)染色原理：采用伊紅試劑對(duì)腎活檢病理組織標(biāo)本進(jìn)行預(yù)染色是常用的組織學(xué)染色方法，通過(guò)對(duì)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核著色，進(jìn)而觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。伊紅試劑作為酸性染料，對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)具有親和力，通過(guò)與細(xì)胞組織中的嗜伊紅顆粒結(jié)合，形成鹽類或絡(luò)合物，從而使細(xì)胞組織呈現(xiàn)紅色[11]。預(yù)染色的步驟如下：選取常規(guī)前期處理的腎活檢病理組織標(biāo)本，用水洗去固定液；用95%的乙醇進(jìn)行脫水，再用苯酚或苯酚-甲醛混合液清除脫水劑，使組織細(xì)胞保持透明；用伊紅試劑對(duì)細(xì)胞組織進(jìn)行染色，用乙醇或乙醇-苯酚混合液洗去多余的伊紅試劑，再用苯酚或苯酚-甲醛混合液清除洗滌劑，使組織細(xì)胞保持透明；覆蓋標(biāo)本，進(jìn)行鏡檢[12]。

腎活檢病理既要觀察組織標(biāo)本細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也要觀察基底膜病變，所以常用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法[13]，本研究只研究伊紅試劑的染色情況。脫水機(jī)試劑缸見(jiàn)圖1。

圖1 脫水機(jī)試劑缸

1.5 方法

腎活檢病理組織標(biāo)本固定5 h 后，將44 例標(biāo)本隨機(jī)分為4 組，每個(gè)缸位各放置4 例病理標(biāo)本，對(duì)照組浸蠟切片后進(jìn)行鏡檢。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組染色后進(jìn)行鏡檢。實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組處理方式見(jiàn)表2。

表2 兩種染色處理方式

2 結(jié)果

腎活檢病理組織標(biāo)本的處理和制作對(duì)腎臟疾病的診斷與治療發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高[14]。Leica ASP300 S 脫水機(jī)整個(gè)固定、脫水、透明、浸透過(guò)程在密閉環(huán)境中進(jìn)行，可批量處理300 個(gè)病理組織標(biāo)本。

本研究通過(guò)了解Leica ASP300 S 脫水機(jī)的工作方式，對(duì)腎活檢病理組織標(biāo)本進(jìn)行采集、固定、脫水、染色等一系列操作，發(fā)現(xiàn)脫水后腎活檢標(biāo)本細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)不同程度的顏色，其中4%或6%濃度的伊紅試劑加入無(wú)水乙醇中染色1 h 后情況最佳。無(wú)論是大標(biāo)本，還是小標(biāo)本，顏色均比早期石蠟標(biāo)本（空白對(duì)照組）更易識(shí)別。實(shí)驗(yàn)組處理的腎活檢病理組織切片染色清晰、結(jié)構(gòu)分明，均無(wú)脫水不徹底或組織發(fā)白等情況。而經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟和乙醇水化等處理后，組織上的著色易被清洗，對(duì)后續(xù)HE 染色、免疫組化、特殊染色均無(wú)影響，染色情況見(jiàn)表3。

表3 各組預(yù)染色情況比較

3 討論

提高腎活檢病理組織標(biāo)本的染色質(zhì)量和穩(wěn)定性，是確保病理診斷結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵，腎活檢病理組織顏色與蠟塊顏色相似，在處理大、小標(biāo)本時(shí)，不利于病理觀察，所以必須對(duì)病理組織標(biāo)本進(jìn)行染色[15]。常規(guī)染色方法有多種，本研究在了解Leica ASP300 S 脫水機(jī)運(yùn)作方法的基礎(chǔ)上，對(duì)伊紅試劑在腎活檢病理組織標(biāo)本預(yù)染色中的應(yīng)用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。伊紅試劑是一種常用的染色劑，可用于顯示細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)。伊紅試劑的濃度可對(duì)染色效果產(chǎn)生重要影響，濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致染色不均勻或不清晰。本研究結(jié)果顯示，4%或6%的醇溶性伊紅試劑和無(wú)水乙醇的腎活檢病理組織標(biāo)本預(yù)染色1 h 后效果最好，顏色呈鮮紅色和艷紅色，與包埋用的白色石蠟形成鮮明對(duì)比，更有利于后續(xù)包埋與切片觀察，且伊紅試劑相對(duì)廉價(jià)、易得。汪潔等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，伊紅試劑可使組織標(biāo)本呈艷紅色，與包埋用的白色石蠟形成鮮明對(duì)比，可行性高。許波[17]發(fā)現(xiàn)，采用改良的HE 染色法可提升宮頸組織石蠟切片染色的一致性，從而提升病理組織切片的質(zhì)量和診斷精準(zhǔn)度。胥玲芬[18]驗(yàn)證了不同酸度的伊紅試劑對(duì)病理組織標(biāo)本預(yù)染色的效果，冰醋酸酸化伊紅試劑的病理組織標(biāo)本預(yù)染色制作效率相對(duì)更高，推廣性更強(qiáng)。以上研究結(jié)果與本研究相似，均表明伊紅試劑有利于后續(xù)包埋和切片觀察。

伊紅試劑的染色機(jī)制是通過(guò)與組織中的蛋白質(zhì)和多糖形成氫鍵和范德華力而結(jié)合。伊紅試劑的濃度會(huì)影響染色效果，因?yàn)椴煌瑵舛鹊囊良t分子在組織中的分布和結(jié)合程度也不同[19]。一般來(lái)說(shuō)，濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響染色效果。濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致伊紅分子堆積在組織表面，而濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致伊紅分子無(wú)法充分與組織滲透和結(jié)合。因此，要實(shí)現(xiàn)最佳染色效果，需選擇適當(dāng)?shù)囊良t濃度。劉微[20]分別使用30%、20%和5%的伊紅試劑對(duì)脂肪組織、子宮內(nèi)膜制片等進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)5%濃度時(shí)的染色可提高病理診斷符合性，與本研究結(jié)果相似。染色時(shí)間是另一個(gè)影響染色效果的重要因素，因?yàn)槿旧珪r(shí)間決定了伊紅分子在組織中的停留時(shí)間和結(jié)合程度。如果染色時(shí)間過(guò)短，伊紅分子無(wú)法與組織充分滲透和結(jié)合，導(dǎo)致染色不均勻或不明顯。如果染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，伊紅分子可能與組織過(guò)度滲透和結(jié)合，導(dǎo)致染色過(guò)深或模糊。李金龍等[21]的研究結(jié)果表明，用0.8%伊紅試劑對(duì)腎組織染色1 min，結(jié)果染色評(píng)分為7～9 分，與本研究結(jié)果存在偏差。其原因可能為，其染色試劑中除伊紅試劑外，還有蘇木精試劑，縮短了染色時(shí)間。王劍等[22]在Leica PELORIS Ⅱ全自動(dòng)組織脫水機(jī)中添加了0.2～0.4 g/L的伊紅試劑，脫水1 h 后發(fā)現(xiàn)得到的組織標(biāo)本顏色艷紅，便于后續(xù)包埋切片實(shí)驗(yàn)，與本研究結(jié)果相似。以上研究結(jié)果進(jìn)一步佐證了伊紅試劑在病理組織標(biāo)本預(yù)染色中的可行性和臨床價(jià)值。

綜上所述，本研究使用Leica ASP300 S 脫水機(jī)的自動(dòng)化固定、脫水、透明、浸透流程，進(jìn)一步提高了病理科工作效率。但本研究也存在一定不足，如病理組織標(biāo)本單一、操作流程過(guò)于簡(jiǎn)單、染色技術(shù)受限等，在后續(xù)研究中，可適當(dāng)增加病理組織標(biāo)本量，驗(yàn)證伊紅試劑預(yù)染色效果的通用性，同時(shí)適當(dāng)增加染色操作的多樣性，發(fā)現(xiàn)更多優(yōu)化流程方法。