山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝優(yōu)化

杜義龍，高靜云，劉文通，李艷榮，高 晗，沈 瑩，潘海峰*

（1.河北省承德醫(yī)學(xué)院/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000； 2.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430； 3.承德御室金丹藥業(yè)有限公司，河北 承德 068150）

山楂葉是薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥葉，味酸，性平，歸肝經(jīng)，主治氣滯血瘀、高脂血癥、胸痹心痛、心悸健忘等［1］，主要化學(xué)成分為黃酮類、三萜類等［2］?，F(xiàn)代研究表明，山楂葉對保護(hù)心血管系統(tǒng)，增加冠脈血流量、降血糖以及抗氧化、抗炎等均有一定作用［3-8］。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)代提取方法并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑［9］?！吨兴幣浞筋w粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》 規(guī)定，由于中藥飲片藥性、功效、質(zhì)地、吸水性有較大差異，在制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑時(shí)應(yīng)對浸泡時(shí)間、加水量、煎煮時(shí)間等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化［10］。目前，有關(guān)山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝的研究較少，故本實(shí)驗(yàn)采用層次分析法結(jié)合響應(yīng)面法對其進(jìn)行優(yōu)化，以期為該制劑功能成分研究提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）； UV-2600 PROBE 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）； KQ-700 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）； AG-245 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）； JA5003 型上皿天平（千分之一，天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蘆丁（批號181227）、牡荊素葡萄糖苷（批號20042350）、牡荊素鼠李糖苷（批號18060103）、金絲桃苷（批號19103001）、異槲皮素（批號18062702） 對照品均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司（純度＞98%）。山楂葉（產(chǎn)地河北省承德市隆化縣） 購于市場，經(jīng)全國老中醫(yī)藥專家（傳統(tǒng)鑒定） 學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承人孫寶惠主任藥師鑒定薔薇科山楂屬植物山楂CrataeguspinnatifidaBunge 的葉。乙腈、甲酸、甲醇為色譜純，購于美國Thermo Fisher Scientific 公司； 其他試劑均為分析純； 水為純凈水，購于天津娃哈哈飲料有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 出膏率測定 將山楂葉水煎液減壓濃縮至250 mL，精密量取10 mL 至恒重升溫干燥皿中，70 ℃水浴蒸干（約3 h），置于60 ℃烘箱中干燥5 h，稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率［11］，公式為出膏率＝ ［25× （m2-m1） /M］ ×100%，其中m1為蒸發(fā)前升溫干燥皿質(zhì)量，m2為烘干至恒重后升溫干燥皿質(zhì)量，M為山楂葉質(zhì)量。

2.2 總黃酮提取率測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取120 ℃下干燥至恒重的蘆丁對照品15.58 mg，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加60%甲醇超聲處理至完全溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 將山楂葉水煎液減壓濃縮至250 mL，精密量取5 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加60%甲醇混勻并定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，精密量取續(xù)濾液10 mL，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，60%甲醇定容至刻度，即得。

尸解的結(jié)果讓所有人驚呆了：那把刀無比精確地洞穿了他的心臟，他卻多活了三天，而且可以做到不被任何人察覺。唯一可能的解釋是因?yàn)閯?chuàng)口太小，使得被切斷的心肌依原樣貼在一起，維持了三天的供血。這是醫(yī)學(xué)史上罕見的奇跡。醫(yī)學(xué)會(huì)議上，有人說要稱為大西洋的奇跡，有人建議以死者的名字命名，還有人說要叫大神跡……“夠了。”那是一位坐在首席的老醫(yī)生，須發(fā)俱白，皺紋里滿是人生的智慧，此刻一聲大喝，然后一字一頓地說：“這個(gè)奇跡的名字，叫父愛?！?/p>

2.2.3 線性關(guān)系考察 按照文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道，以總黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.012 6X-0.021 4 （r＝0.999 2），在12.464～74.784 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 測定方法 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取1 mL 至25 mL 量瓶中，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算提取率，公式為提取率＝ （C×15.625/M） ×100%，其中C為總黃酮質(zhì)量濃度，M為山楂葉質(zhì)量。

2.3 各成分總提取率測定 采用HPLC 法。

2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相（乙腈-四氫呋喃，12 ∶1）（A） -0.3%甲酸（B），梯度洗脫（0～15 min，8% ～12%A；15～25 min，12% ～16% A； 25 ～37.5 min，16% ～15% A；37.5～45 min，15% ～20% A； 45 ～50 min，20% ～34% A；50～55 min，34% ～100%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長350 nm； 進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素對照品適量，60% 甲醇制成質(zhì)量濃度分別為204.0、300.0、131.82、61.98 μg/mL的貯備液，精密吸取適量，60%甲醇依次稀釋至2、4、8、16、32、64 倍，即得。

2.3.3 供試品溶液制備及測定方法 將山楂葉水煎液減壓濃縮至250 mL，精密量取5 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加60%甲醇混勻并定容至刻度，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算提取率，公式為提取率＝ ［C1×A2/ （4×A1×M）］ ×100%，其中C1為對照品質(zhì)量濃度，A1為對照品峰面積，A2為供試品峰面積，M為山楂葉質(zhì)量。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2” 項(xiàng)下對照品溶液10 μL，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素含量分別為0.50%、0.47%、1.45%、0.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素峰面積RSD 分別為0.91%、0.70%、2.28%、2.00%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取各成分含量已知的標(biāo)準(zhǔn)湯劑濃縮液2.5 mL，共6 份，按100% 水平精密加入對照品溶液，按 “2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素平均加樣回收率分別為 102.72%、95.70%、98.61%、97.19%，RSD 分別為0.51%、0.10%、0.64%、0.47%。

2.4 層次分析法

2.4.1 判斷矩陣構(gòu)建 總黃酮是山楂葉主要活性成分，2020 年版《中國藥典》 也將該成分含量作為山楂葉及其提取物的主要質(zhì)量控制指標(biāo)［1，12］，故本實(shí)驗(yàn)將其提取率作為第一重要測定指標(biāo)； 牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷在山楂葉中的含量較高，2020 年版《中國藥典》 也將兩者分別作為山楂葉提取物、藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)［1，12］，故本實(shí)驗(yàn)將其提取率作為第二重要測定指標(biāo)； 牡荊素葡萄糖苷、異槲皮素在山楂葉中的含量也較高，藥理活性明確，在相關(guān)質(zhì)量控制研究中常作為定性定量指標(biāo)［13-17］，但尚未被2020 年版《中國藥典》 收錄，故本實(shí)驗(yàn)將兩者提取率作為第三重要測定指標(biāo)； 出膏率是用于判斷制備工藝穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，但不能反映有效成分質(zhì)量信息，故本實(shí)驗(yàn)將其作為第四重要測定指標(biāo)。按總黃酮提取率＞牡荊素鼠李糖苷提取率＝金絲桃苷提取率＞牡荊素葡萄糖苷提取率＝異槲皮素提取率＞出膏率的順序，根據(jù)層次分析法理論判斷矩陣1 ～9 標(biāo)度法［18］，對同一層次內(nèi)其相對重要程度進(jìn)行打分，其中總黃酮作為山楂葉主要活性成分，其提取率相對于出膏率強(qiáng)烈重要，故標(biāo)為7； 牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷提取率相對于出膏率明顯重要，故標(biāo)為5； 牡荊素葡萄糖苷、異槲皮素提取率相對于出膏率稍重要，故標(biāo)為3，以此類推，構(gòu)建判斷矩陣，見表2。

表2 指標(biāo)成對比較的優(yōu)先判斷矩陣

2.4.2 權(quán)重計(jì)算 先構(gòu)建幾何平均判斷矩陣M，依據(jù)公式（1） 計(jì)算初始權(quán)重系數(shù)Wj＇，其中ajn表示表示第j（j＝1，2，…，n） 個(gè)指標(biāo)因素對第n（n＝1，2，…，j） 個(gè)指標(biāo)因素的比較結(jié)果，再依據(jù)公式 （2） 計(jì)算歸一化權(quán)重系數(shù)WjS，得到6 個(gè)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.041 67、0.291 67、0.208 33、0.208 33、0.125、0.125。

2.4.3 一致性檢驗(yàn) 對矩陣進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，計(jì)算一致性指標(biāo)（CI）、一致性比例（CR）。根據(jù)公式（3） ～ （5） 測得CI＝0，CR＝0，均小于0.1，表明該矩陣一致性良好。

2.4.4 綜合評分 通過層次分析法對標(biāo)準(zhǔn)湯劑各指標(biāo)權(quán)重進(jìn)行量化，計(jì)算綜合評分Y，公式為Y＝總黃酮提取率×0.291 67+鼠李糖苷提取率×0.208 33+金絲桃苷提取率×0.208 33+葡萄糖苷提取率×0.125+異槲皮素提取率×0.125+出膏率×0.041 67。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 浸泡時(shí)間 前期報(bào)道，充分浸泡可使中藥飲片表面濕潤變軟，即植物細(xì)胞吸水膨脹，吸水率越高，膨脹越充分，植物細(xì)胞內(nèi)活性成分在煎煮過程中更易溶出［19］，公式為吸水率＝ （V藥材吸水量/V加水總量） ×100%。取山楂葉100 g，加14 倍量水，分別考察浸泡時(shí)間10、20、30、40、50 min對吸水率的影響，發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)吸水率分別為0.161%、0.196%、0.200%、0.204%、0.204%，即隨著浸泡時(shí)間延長吸水率升高，而浸泡40 min 后無變化，故確定浸泡時(shí)間為40 min。

2.5.2 加水量 取山楂葉100 g，浸泡40 min，根據(jù)2021年發(fā)布的 《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［10］（標(biāo)準(zhǔn)湯劑每劑藥一般煎煮2 次，加水量一般以浸過藥面2～5 cm 為宜），藥材煎煮2 次，一煎30 min，二煎20 min，趁熱過濾，合并2 次濾液，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別考察加水量（10+8）、（12+10）、（14+12）、（16+14）、（18+16） 倍對綜合評分的影響，發(fā)現(xiàn)不同加水量下綜合評分分別為3.140、3.532、3.817、3.820、3.789 分，即在一煎加14 倍量水、二煎加12 倍量水時(shí)綜合評分趨于平緩，可能已接近最大溶解量，故確定加水量為一煎14 倍，二煎12 倍。

2.5.3 煎煮時(shí)間 取山楂葉100 g，浸泡40 min，加水量為一煎14 倍，二煎12 倍，趁熱過濾，合并2 次煎煮液，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)2021 年發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［10］（煎煮時(shí)間為20～60 min，并且第二煎時(shí)間可適當(dāng)縮短），考察煎煮時(shí)間（20+20）、（30+20）、（40+30）、（50+40）、（60+50）min 對綜合評分的影響，發(fā)現(xiàn)不同煎煮時(shí)間下綜合評分分別為3.526、3.670、3.854、3.917、3.954 分，即煎煮（50+40） min 后趨于平緩，故確定煎煮時(shí)間為一煎50 min，二煎40 min。

2.6 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸泡時(shí)間（A）、加水量（B）、煎煮時(shí)間（C） 作為影響因素，總黃酮、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、異槲皮素提取率及出膏率的綜合評分（Y） 作為評價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert 12.0 軟件優(yōu)化制備工藝，因素水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 因素水平

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用上述軟件對表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得方程為Y＝3.82+0.001 3A+0.293 8B-0.047 5C-0.025AB+0.022 5AC+0.142 5BC+0.016A2-0.139B2-0.081 5C2，方差分析見表5。由此可知，模型F＝33.34，P＜0.000 1，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)F＝2.90，P＝0.165 2＞0.05，表明結(jié)果受未知因素的干擾較小，殘差由隨機(jī)誤差引起； 決定系數(shù)R2＝0.977 2，校正決定系數(shù)，變異系數(shù)CV為1.48%，表明模型置信度較高，可用于預(yù)測分析； 因素B、C、BC、B2、C2有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）； 各因素影響程度依次為B＞C＞A。

表5 方差分析

響應(yīng)面分析見圖2 ～4。最終確定，最優(yōu)工藝為浸泡時(shí)間30 min，一煎加16 倍量水煎煮54.44 min，二煎加14 倍量水煎煮44.44 min，綜合評分為4.029 分，根據(jù)實(shí)際操作的可行性，將其修正為浸泡時(shí)間30 min，一煎加16 倍量水煎煮55 min，二煎加14 倍量水煎煮45 min。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測得綜合評分分別為4.07、4.09、4.05 分，平均4.07 分，RSD 為0.49%，與預(yù)測值4.029 分接近（相對偏差為1.01%），表明該工藝穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠。

圖2 浸泡時(shí)間、加水量對綜合評分的影響

圖3 浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間對綜合評分的影響

圖4 加水量、煎煮時(shí)間對綜合評分的影響

3 討論與結(jié)論

響應(yīng)面法結(jié)果顯示，浸泡時(shí)間30、40、50 min 對山楂葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝無明顯影響，結(jié)合單因素試驗(yàn)推測，可能是由于浸泡30 min 時(shí)藥材吸水率為0.196%，已接近最大值0.204%，即植物細(xì)胞已達(dá)到充分溶脹，故從降低制備成本、節(jié)約時(shí)間、提高效率的角度出發(fā)，確定最優(yōu)浸泡時(shí)間為30 min。

2020 年版《中國藥典》 項(xiàng)下山楂葉成分檢測指標(biāo)僅有總黃酮、金絲桃苷含量，但中藥為多組分的復(fù)雜體系，僅測定這2 種成分含量難以全面評價(jià)該部位及其相關(guān)制劑質(zhì)量。山楂葉主要有效成分為黃酮，包括牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、異槲皮素等，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、降血糖等作用［20-23］，本實(shí)驗(yàn)采用層次分析法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化其標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝，對比《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［10］規(guī)定，可使結(jié)果更科學(xué)化，并驗(yàn)證了該工藝的合理性。