女貞子提取工藝優(yōu)化研究

羅 進(jìn)，羅艷萍，羅汝鋒，羅錦杰

（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528200）

女貞子（Ligustri lucidiFructus） 為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidumAit）的干燥成熟果實(shí)，味甘、苦，性涼，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，女貞子的主要成分有三萜類、醚萜類、黃酮類、苯乙醇苷類化合物、多糖等[2-3]。女貞子已列入國家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布的可用于保健食品的中藥名單，可作為保健食品原料。

目前，關(guān)于女貞子的提取工藝研究大多關(guān)注于齊墩果酸[4]、熊果酸[5]，特女貞甘等[6-7]，以及多酚類化合物的提取得率，對提取出膏率關(guān)注較少。而出膏率是植物提取物生產(chǎn)中的重要指標(biāo)之一，與產(chǎn)品的質(zhì)量和成本關(guān)系密切[8-9]。以水為溶劑，探討不同提取條件對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對提取工藝進(jìn)行綜合評價(jià)，以獲得出膏率和特女貞苷提取率均較優(yōu)的女貞子水提工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

女貞子，射陽萬順食品有限公司提供；甲醇，默克股份兩合公司提供；特女貞苷，中國食品藥品鑒定研究院提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity型液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；ME204E型電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海） 有限公司產(chǎn)品；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 料液比對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

取女貞子5份，按照料液比1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12加入純化水，混合均勻，于100℃條件下加熱回流提取2次，每次提取1.5 h。提取完畢后合并提取液，過350目篩網(wǎng)分別測定女貞子出膏率和特女貞苷提取率。

1.3.2 提取時(shí)間對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

取女貞子5份，按照料液比1∶8加入純化水，混合均勻，于100℃條件下加熱回流提取2次，提取時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h。提取完畢后合并提取液，過350目篩網(wǎng)分別測定女貞子出膏率和特女貞苷提取率。

1.3.3 提取次數(shù)對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

取女貞子4份，按照料液比1∶8加入純化水，混合均勻，于100℃條件下加熱回流提取，分別提取1，2，3，4次，每次提取1.5 h。提取完畢后合并提取液，過350目篩網(wǎng)分別測定女貞子出膏率和特女貞苷提取率。

1.3.4 提取溫度對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

取女貞子5份，按照料液比1∶8加入純化水，混合均勻，提取溫度分別為60，70，80，90，100℃提取，提取2次，每次提取1.5 h。提取完畢后合并提取液，過350目篩網(wǎng)分別測定女貞子出膏率和特女貞苷提取率。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝

選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、提取溫度（D） 等4個(gè)因素作為考查因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化水提取工藝，以正交表L9（34）設(shè)計(jì)試驗(yàn)，提取液過350目篩網(wǎng)，并分別測定女貞子出膏率和特女貞苷提取率。最終結(jié)果計(jì)算綜合評分（特女貞苷轉(zhuǎn)移率、干膏得率各占50%）。

因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.6 女貞子出膏率測定

精密吸取女貞子提取液20.0 mL至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，稱質(zhì)量W，照干燥失重法（中國藥典2015年版四部 通則0831） 105℃干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算出膏率，公式如下：

式中：W——20 mL濃縮液中干浸膏質(zhì)量，mg；

1.3.7 特女貞苷轉(zhuǎn)移率測定

（1） 高效液相色譜條件。選用Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent ZORBAX XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇∶水（V∶V） =40∶60，流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長224 nm，進(jìn)樣量10 μL[10]。

（2）對照品溶液的制備。取特女貞苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL/mL的特女貞苷對照品貯備液溶液。精密量取對照品貯備液于0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，分別制得0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mg/mL的特女貞苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3.7（1） 中色譜條件測定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），特女貞苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=13 683X-33.005，R2=0.999 8。說明特女貞苷在質(zhì)量濃度為0.04～0.20 mg/mL時(shí)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

（3） 供試品溶液的制備。取適量女貞子提取液，用甲醇稀釋10倍，過0.45 μm濾膜，按1.3.7（1）中色譜條件測定，即得。

綜合評分=出膏率得分×50%+特女貞苷提取率得分×50%.

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan's均數(shù)差異顯著性分析（p＜0.05），判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 女貞子提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

料液比對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著料液比的增加，女貞子的出膏率和特女貞苷提取率均顯著增加（p＜0.05），當(dāng)料液比達(dá)到1∶8后，女貞子的出膏率和特女貞苷提取率不再隨著料液比的增加而顯著增加（p＞0.05）。其原因可能是在物料用量一定的前提下，溶劑用量越大，物料與溶劑接觸面濃度差越大[11]，女貞子的可溶性成分越易溶出；但當(dāng)料液比達(dá)到1∶8后，女貞子可溶性成分基本溶出，故其出膏率和特女貞苷提取率不再隨著料液比的增加而顯著增加。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比1∶6～1∶10進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 提取時(shí)間對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

提取時(shí)間對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響見圖2。

由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間小于1.5 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，女貞子的出膏率和特女貞苷提取率迅速升高，當(dāng)提取時(shí)間大于1.5 h時(shí)，女貞子的出膏率和特女貞苷提取率提高緩慢。說明在該料液比條件下，提取1.5 h后，女貞子中的可溶性成分已趨于飽和。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間1～2 h進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 提取次數(shù)對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

提取次數(shù)對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)提取次數(shù)小于3次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，女貞子的出膏率和特女貞苷提取率均顯著增加（p＜0.05），但其增長速率隨著提取次數(shù)的增加逐漸降低。在實(shí)際生產(chǎn)中，提取次數(shù)的增加會(huì)提高生產(chǎn)成本，提取次數(shù)多為2次。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取次數(shù)1～3次進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 提取溫度對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響

提取溫度對女貞子出膏率和特女貞苷提取率的影響見圖4。

由圖4可知，女貞子的出膏率隨著提取溫度的升高顯著升高（p＜0.05），當(dāng)提取溫度為100℃時(shí)（回流提?。┏龈嗦蔬_(dá)到最高，為32.51%；當(dāng)提取溫度低于90℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，女貞子的特女貞苷提取率迅速升高，并于90℃時(shí)達(dá)到最高，隨著溫度的繼續(xù)升高，女貞子的特女貞苷提取率顯著降低（p＜0.05）?？赡苁且?yàn)樘崛囟绕蜁r(shí)，特女貞苷轉(zhuǎn)移率較低，而溫度過高特女貞苷受熱分解有關(guān)[12]。選取提取溫度80～100℃進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 女貞子提取正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

由表2可知，提取次數(shù)和料液比對女貞子的出膏率和特女貞苷提取率影響較大。各因素對女貞子提取綜合評分的影響大小依次為提取次數(shù)＞料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。根據(jù)各因素的K值大小可知，女貞子在提取工藝為提取次數(shù)3次，料液比為1∶10，提取溫度90℃，提取時(shí)間2 h時(shí)綜合評分最高。由于提取次數(shù)3次與2次綜合評分K值相差不大，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際與成本，選擇提取次數(shù)2次；由于提取時(shí)間對女貞子提取工藝的綜合評分無顯著影響，考慮到生產(chǎn)成本和生產(chǎn)效率，選擇提取時(shí)間1 h。確定女貞子最優(yōu)提取為料液比1∶10，每次提取1 h，加水提取2次，提取溫度為90℃。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)

取女貞子飲片按正交試驗(yàn)篩選的工藝條件進(jìn)行3次確認(rèn)試驗(yàn)，即料液比1∶10，每次提取1 h，加水提取2次，提取溫度90℃。在該提取條件下女貞子出膏率為33.84%±0.71%，特女貞苷提取率為1.67%±0.06%。在該提取條件下，具有提取率較高、生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，對女貞子提取物的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

探討了料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度等工藝因素對女貞子出膏率和特女貞苷提取率影響的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了女貞子的提取工藝條件。當(dāng)女貞子的提取條件為料液比1∶10，每次提取1 h，加水提取2次，提取溫度90℃時(shí)，女貞子的出膏率可達(dá)33.84%±0.71%，特女貞苷提取率可達(dá)為1.67%±0.06%。在該提取條件下，具有提取率較高、生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，對女貞子提取物的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。