8個(gè)新收集大白菜雜交種DNA指紋構(gòu)建及其與已有種質(zhì)的親緣關(guān)系分析

劉栓桃，王立華，張志剛，王榮花，王樹彬，李巧云，趙智中

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所／國家蔬菜改良中心山東分中心／山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站（山東），山東 濟(jì)南 250100）

大白菜（Brassica rapassp.pekinensis）是山東省的優(yōu)勢蔬菜，為常異交作物，雜種優(yōu)勢非常明顯，因此雜交種在生產(chǎn)實(shí)踐中的普及率較高。由于消費(fèi)需求不斷變化且呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)，近年來衍生出很多新的大白菜品種，如快菜，苗期生長迅速、無毛、葉肉厚，蓮座期葉片直立性好，食用器官就是蓮座期的葉片；紹菜，日本進(jìn)口品種，中棵直筒型；娃娃菜，葉球體積小食用器官為蓮座葉、合抱類型，適宜運(yùn)輸；黃心秋白菜，近年來新出現(xiàn)的類型，且心葉顏色越黃越受歡迎。

對(duì)于新涌現(xiàn)的品種類型，有必要了解其與已有品種或種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系，這對(duì)掌握其親本類型、培育自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種有非常大的幫助。前人對(duì)大白菜遺傳多樣性、種質(zhì)資源親緣關(guān)系等方面的研究已經(jīng)有很多報(bào)道，如RAPD［1，2］、AFLP［2，3］、SSR［4－7］和SRAP［8］等標(biāo)記類型均被用于鑒定大白菜種質(zhì)的親緣關(guān)系。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，很多物種的參考基因組序列已經(jīng)公布，大白菜參考基因組序列也已經(jīng)釋放［9］，以全基因組重測序技術(shù)為基礎(chǔ)的新型分子標(biāo)記如 InDels標(biāo)記、SNP 標(biāo)記得到普遍應(yīng)用［10，11］。尤其是InDels標(biāo)記，它在基因組中一般呈共顯性分布，且其在基因組中的位置清楚、變異穩(wěn)定，這是RAPD、AFLP、SSR等標(biāo)記不能比擬的［5］。

本課題組已經(jīng)開發(fā)了適宜大白菜種質(zhì)資源和雜交種指紋構(gòu)建的核心引物［12，13］，前期已經(jīng)對(duì)105份大白菜育種材料和72個(gè)雜交種進(jìn)行了DNA指紋分析，本研究將在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建8個(gè)新收集大白菜品種的DNA指紋，進(jìn)一步充實(shí)大白菜雜交種DNA指紋數(shù)據(jù)庫，同時(shí)分析這些雜交種與已有育種材料和雜交種之間的親緣關(guān)系，為加快新種質(zhì)利用和創(chuàng)制大白菜新種質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為市售8個(gè)大白菜新品種（見表1）。分別是娃娃菜新品種耐寒金皇后、玲瓏黃012，抗根腫病合抱類新品種CR新美，合抱類型黃心秋白菜新品種12CC4912、金德麗和梅賽德斯，紹菜新品種墨玉青，直筒類新品種御菜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 每個(gè)品種隨機(jī)選取20粒種子，參考劉栓桃等［14］的方法準(zhǔn)備幼苗，即種子用蒸餾水清洗后置于墊有發(fā)芽紙的發(fā)芽盒內(nèi)，于8 000 lx的光照培養(yǎng)箱內(nèi)16 h光照／8 h黑暗、28℃恒溫處理72 h。然后每個(gè)品種選取10棵子葉展開的幼苗，混勻后液氮研磨，取50 mg粉末加入200μL TPS提取液于65℃恒溫箱保溫30～60 min，隨后冷卻至室溫，12 000 r／min離心10 min；將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇使DNA沉淀，12 000 r／min離心10 min，棄上清。DNA沉淀用75%酒精清洗后于室溫干燥10 min，用200μL 10 mmol／L的Tris－HCl（pH 8.0）溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA指紋構(gòu)建 所用20對(duì)核心引物以及PCR 反應(yīng)體系均參考本課題組前期的研究［13］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，數(shù)碼相機(jī)拍照。DNA指紋構(gòu)建參考劉栓桃等［13］的方法，將引物按照染色體編號(hào)和物理位置由小到大排列，如果某樣本擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的、相對(duì)遷移率較大的條帶則賦值0，如果擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的、相對(duì)遷移率較小的條帶則賦值1，如果同時(shí)擴(kuò)增出兩條帶則賦值H。

1.2.3 與已有育種材料和大白菜品種的親緣關(guān)系分析 以核心引物的擴(kuò)增結(jié)果為依據(jù)，從前期研究中篩選105份大白菜育種材料和72個(gè)大白菜雜交種的DNA指紋賦值結(jié)果，這些材料的編號(hào)、名稱詳見有關(guān)文獻(xiàn)［12，13］。參照劉栓桃等［14］的方法將DNA指紋轉(zhuǎn)換為核酸堿基，即賦值1轉(zhuǎn)換為AA，賦值0轉(zhuǎn)換為GG，賦值H轉(zhuǎn)換為AG，將生成的核酸序列文件用MEGA 7.0軟件［15］以最大似然法構(gòu)建親緣關(guān)系樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜新品種DNA指紋構(gòu)建

圖1是核心引物IDA01054以及IDA02042的擴(kuò)增結(jié)果及賦值示例。依據(jù)圖示的賦值標(biāo)準(zhǔn)將20對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果賦值，所得8個(gè)品種的DNA指紋如表1所示。經(jīng)過比對(duì)，8個(gè)新品種之間沒有重復(fù)指紋。

表1 8個(gè)新品種的DNA指紋

2.2 新收集品種與已有大白菜品種及育種材料的親緣關(guān)系分析

新收集的8個(gè)品種與已有品種及育種材料［12，13］的親緣關(guān)系如圖2所示。可以發(fā)現(xiàn)，耐寒金皇后（NF－1）、梅賽德斯（NF－6）與2019年收集的玲瓏黃515（WS14）、寒鮮（WS16）以及長勝（WS19）三個(gè)耐抽薹大白菜親緣關(guān)系比較近，與本課題組創(chuàng)制的合抱類春白菜育種材料06－247（R001）、2016－185－3（R100）以及引自韓國的春材料2017－YM59（R085）也有比較近的親緣關(guān)系。玲瓏黃012（NF－2）與2019年收集的一個(gè)中棵娃娃菜（WS12）、抗根腫病娃娃菜CR－黃心（WS20）、CR－金麗（WS05）、CR－民喜（WS06）、CR－天盛（WS10）都比較接近，與從韓國引進(jìn)的春白菜材料2016－XC25（R089）有較近的親緣關(guān)系。CR新美（NF－3）和直筒類新品種御菜（NF－8）與我國育成的直筒類品種天香80青麻葉（WS27）、北京新三號(hào)（F1－13）、中白62號(hào)（F1－36）、天白75（F1－31）有較近的親緣關(guān)系，但與本課題組已經(jīng)鑒定的105份育種材料都沒有比較直接的親緣關(guān)系。新收集的合抱類秋白菜12CC4912（NF－4）和金德麗（NF－5）兩個(gè)比較相似，與我們創(chuàng)制的疊抱類秋材料2016－133－3（R092）和2011－ZC39（R103）有一定的親緣關(guān)系。墨玉青（NF－7）與之前收集的品種親緣關(guān)系不大，與我們創(chuàng)制的合抱類秋材料2017－YM12（R082）有一定的親緣關(guān)系?？傮w上，新收集的8個(gè)品種、2019年收集的32個(gè)新品種與課題組創(chuàng)制的合抱類材料親緣關(guān)系更近，與疊抱類材料親緣更遠(yuǎn)。

圖2 新收集品種與已有品種和種質(zhì)之間的親緣關(guān)系聚類結(jié)果

3 討論與結(jié)論

大白菜新品種采用登記制，新品種登記之前必須進(jìn)行特異性、一致性和穩(wěn)定性測試（即DUS測試），而DUS測試基本以田間種植和調(diào)查為主，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部委托有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行［16］。一個(gè)新品種在進(jìn)行DUS測試時(shí)，會(huì)要求新品種提供者同時(shí)提供一個(gè)與該新品種相近的對(duì)照品種，測試機(jī)構(gòu)按照DUS測試指南的要求，在1～2個(gè)生育期內(nèi)對(duì)新品種及其對(duì)照品種進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的調(diào)查記錄，出具測試報(bào)告。由于新品種育成單位對(duì)自己選育的新品種以及市場已經(jīng)銷售的品種有比較多的了解，因而在選擇對(duì)照品種時(shí)很可能會(huì)有意識(shí)地避免選擇各方面性狀與自己品種接近的已有品種，而更傾向于選擇一個(gè)與自己品種各方面性狀差異比較大的作為對(duì)照，這樣比較容易得到一個(gè)符合規(guī)定的DUS測試結(jié)果，使新品種能盡快進(jìn)行相關(guān)登記而推向市場，從而使新品種選育單位實(shí)現(xiàn)利益最大化。更有甚者，可能將相同的品種進(jìn)行不同的命名，同時(shí)委托不同的DUS測試機(jī)構(gòu)進(jìn)行測試，最終以同種異名進(jìn)行品種登記而銷售，迷惑市場和種植者。解決上述問題的唯一辦法就是應(yīng)收盡收地收集所有已經(jīng)在中國市場登記和銷售的大白菜新品種并構(gòu)建其DNA指紋數(shù)據(jù)庫。對(duì)于一個(gè)新選育的品種，進(jìn)行DUS測試的同時(shí)構(gòu)建其DNA指紋，并與數(shù)據(jù)庫中已有的指紋進(jìn)行比對(duì)，將DUS測試結(jié)果與DNA指紋比對(duì)結(jié)果相結(jié)合，真正讓有創(chuàng)新的品種進(jìn)入登記環(huán)節(jié)并推向市場。

本課題組前期構(gòu)建了72個(gè)大白菜雜交種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫［13］，這為開展新育成大白菜雜交種的DNA指紋比對(duì)工作奠定了基礎(chǔ)。本研究對(duì)新收集的8個(gè)大白菜雜交種與已有品種DNA指紋進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了與已有品種近似的品種，但沒有發(fā)現(xiàn)完全相同的品種，表明新收集的這8個(gè)新品種有一定的利用價(jià)值。尤其值得注意的是，本研究利用DNA指紋比對(duì)技術(shù)將新品種與本課題組已經(jīng)創(chuàng)制的育種材料進(jìn)行比對(duì)，明確了新品種與已有育種材料之間的親緣關(guān)系，今后再進(jìn)一步結(jié)合田間鑒定結(jié)果，可以將新收集品種的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移至親緣關(guān)系更近的育種材料中，這對(duì)指導(dǎo)新種質(zhì)創(chuàng)制有一定的借鑒意義。

本課題組創(chuàng)制的材料中疊抱類秋材料比較豐富，合抱類春、秋材料相對(duì)比較少。合抱類品種由于長途運(yùn)輸方便，比較受市場的歡迎，因此近年來我們側(cè)重于收集合抱類新品種，以創(chuàng)制合抱類育種材料。從本研究鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2019年收集的WS01～WS32以及本研究收集的8個(gè)新品種，均與合抱類型材料的親緣關(guān)系較近，而與本課題組已有的疊抱類型材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這對(duì)今后選育合抱類白菜新品種有重要的利用價(jià)值。

總之，本研究構(gòu)建了新收集的8個(gè)大白菜新品種的DNA指紋，充實(shí)了大白菜雜交種DNA指紋數(shù)據(jù)庫，同時(shí)分析了這8個(gè)新品種與已有品種以及本課題組已有育種材料之間的親緣關(guān)系，為充分利用這些新品種的優(yōu)良性狀改造已有育種材料、避免系譜關(guān)系混雜提供了分子證據(jù)。