柞蠶雄蛾濃縮液改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝

朱琳，郭光，范作卿，王娜，施新琴，吳建軍

（1.山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺(tái) 264002；2.寧陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 寧陽(yáng) 271400）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精外的其他因素導(dǎo)致的肝臟彌漫性脂肪浸潤(rùn)。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高及人們生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率逐漸增高，引起社會(huì)廣泛關(guān)注。已有諸多研究表明，脂肪性肝炎可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化并可能最終形成肝衰竭，同時(shí)NAFLD還會(huì)促進(jìn)胰島素抵抗、糖尿病、病毒性肝炎、代謝性綜合征和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生與發(fā)展［1］。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多認(rèn)同NAFLD的發(fā)病機(jī)理為“二次打擊”理論。其中，“首次打擊”為高脂飲食影響脂質(zhì)代謝，游離脂肪酸（FFA）不斷增多，導(dǎo)致肝臟線粒體氧化超載，同時(shí)高胰島素又使得糖酵解增加促進(jìn)脂肪酸的合成，最終導(dǎo)致甘油三酯（TG）在肝臟中堆積，引起呈良性的肝內(nèi)脂肪堆積（單純性脂肪肝）?！暗诙未驌簟敝饕窃诖嘶A(chǔ)上發(fā)生的氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子的異常。丙二醛（MDA）、4－羥基壬酸等脂質(zhì)過(guò)氧化物增多，結(jié)果促進(jìn)肝細(xì)胞酶的活性并抑制線粒體的功能；庫(kù)普弗（Kupffer）細(xì)胞激活，細(xì)胞因子比如TNF－α、IL－6等的參與，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞激活、增殖，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟炎癥，炎癥持續(xù)存在并造成肝細(xì)胞壞死形成進(jìn)展性肝纖維化，并最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌［2］。其他如激素、環(huán)境、遺傳、免疫反應(yīng)、持續(xù)輕微的內(nèi)毒素血癥、缺氧和肝微循環(huán)障礙等也參與了此病的形成，說(shuō)明其有多環(huán)節(jié)、多因素的發(fā)病特點(diǎn)。

柞蠶蛾（Antheraea pernyiGuerrin-Meneville）屬于節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱鱗翅目天蠶蛾科柞蠶屬，是一種在我國(guó)具有悠久養(yǎng)殖歷史的藥食兩用經(jīng)濟(jì)昆蟲，屬完全變態(tài)昆蟲。柞蠶雄蛾歷史上曾作為貢品，有“神蟲國(guó)寶”之美譽(yù)，其功效在《本草綱目》早有記載：“雄原蠶蛾益精氣，強(qiáng)陰道，交接不倦，亦壯陽(yáng)事，止泄精、尿血、暖水臟，治暴風(fēng)、金瘡、凍瘡、湯火瘡，滅瘢痕”［3］。柞蠶雄蛾?duì)I養(yǎng)物質(zhì)豐富，干物質(zhì)中含粗蛋白40.49%且氨基酸種類齊全、比例適當(dāng)，高于世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（WHO／FAO）推薦的蛋白質(zhì)氨基酸記分模式；脂肪酸含量中不飽和脂肪酸占78.6%，必需脂肪酸占43.0%，超過(guò)了《食物成分表》中任何一種動(dòng)物的脂肪酸含量；還含有豐富的礦物質(zhì)、微量元素、維生素和激素等其他活性物質(zhì)［4］。我國(guó)柞蠶資源豐富，近年來(lái)對(duì)柞蠶雄蛾的綜合加工利用已引起人們的高度重視，現(xiàn)已開發(fā)出一些食品、保健品和醫(yī)藥品，取得較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。為了確保柞蠶雄蛾的食用及藥用安全性，有研究以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，檢測(cè)柞蠶雄蛾粉的急性毒性和致突變性，結(jié)果表明其對(duì)昆明小鼠無(wú)急性毒性、無(wú)致突變性和無(wú)致畸性［5］。柞蠶雄蛾濃縮液是本研究團(tuán)隊(duì)選用初羽化、未交尾的柞蠶雄蛾為原料，經(jīng)乙醇浸泡后低溫減壓抽提得到的具有生物活性的保健產(chǎn)品［6］，對(duì)其部分營(yíng)養(yǎng)成分及食品衛(wèi)生指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明：18種游離氨基酸總量為11.34 g／L，其中人體必需氨基酸含量達(dá)3.29 g／L，占總量的29%；脂肪含量為0.09%；維生素A、E、B1、B2及8種礦質(zhì)元素含量也很豐富［7］；通過(guò)紫外分光光度法初步確定其中含有一些激素類成分如睪丸酮和蛻皮激素［8，9］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)柞蠶雄蛾產(chǎn)品的功能成分、功效及其作用機(jī)理的研究甚少，并且大部分研究還停留在表面。柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)NAFLD的作用研究也尚未見報(bào)道。因此，本團(tuán)隊(duì)基于以前的研究基礎(chǔ)，通過(guò)小鼠試驗(yàn)，研究柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠NAFLD的防治作用，以期為柞蠶的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)，并為開發(fā)預(yù)防和治療NAFLD的產(chǎn)品做探索性研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

柞蠶雄蛾濃縮液，由山東省蠶業(yè)研究所2019年提取制備；雄性C57BL／6J小鼠，每只18～20 g，購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；辛伐他汀購(gòu)自Sigma公司；四氯化碳（CCl4）、無(wú)水乙醇、甲醛等試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。

H2200R冷凍離心機(jī)，購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HM325輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，購(gòu)自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；博視達(dá)拍照顯微鏡，購(gòu)自深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 先將小鼠隨機(jī)分為2組，其中空白對(duì)照組（A組）5只，飼喂正常飼料；造模組33只，飼喂高脂飼料并注射5% CCl4，劑量為0.01 mL／g，每周兩次。三周后，挑選3只模型組小鼠，取肝臟做組織切片，HE染色，根據(jù)肝臟病變情況判斷是否造模成功。

造模成功后，將造模組小鼠重新分配，隨機(jī)分為3組，每組10只，B組為模型組，C組為柞蠶雄蛾濃縮液處理組，D組為陽(yáng)性對(duì)照組。A、B兩組灌胃生理鹽水，C組灌胃0.8 g／mL柞蠶雄蛾濃縮液，D組灌胃2 mg／mL辛伐他汀溶液，灌胃劑量為0.01 mL／g，每日灌胃1次，連續(xù)30 d。每隔3天測(cè)量一次小鼠體重，繪制體重曲線。試驗(yàn)結(jié)束前小鼠禁食禁水8 h以上，之后摘眼球取血，然后斷頸處死，解剖取肝臟和脂肪組織并對(duì)其進(jìn)行稱重，計(jì)算器體比。器體比又稱臟器系數(shù)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與其體重之比。

1.2.2 血脂四項(xiàng)的測(cè)定 血漿靜置1 h后，4 000 r／min離心5 min，取血清，檢測(cè)血脂四項(xiàng)，即總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）和低密度脂蛋白（LDL－C）。

1.2.3 組織學(xué)分析 摘取肝臟和脂肪組織，以純凈水洗去血污，4%福爾馬林固定，HE（蘇木精－伊紅）染色，石蠟包埋切片，在顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察、拍照，分析肝臟炎癥及損傷情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)至少3個(gè)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)處理及方差分析均采用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)的影響

柞蠶雄蛾濃縮液處理組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的體重差異較小，變化趨勢(shì)基本一致，但均顯著低于模型組和空白對(duì)照組；模型組小鼠的體重在處理前9天內(nèi)低于空白對(duì)照組，但9天后明顯高于空白對(duì)照組（圖1）。

圖1 小鼠體重變化曲線

2.2 柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)小鼠肝臟及脂肪組織增長(zhǎng)的影響

由圖2可見，柞蠶雄蛾濃縮液處理組的肝臟質(zhì)量／體重值為0.032，低于其它處理組，但處理間差異不顯著；濃縮液處理組的脂肪質(zhì)量／體重值為0.014，略高于空白對(duì)照組，但低于陽(yáng)性對(duì)照組和模型組，且與模型組（0.027）差異極顯著（P＜0.01）。

圖2 小鼠肝臟（a）和脂肪（b）器體比

2.3 柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)小鼠血清中血脂四項(xiàng)的影響

由圖3可見，柞蠶雄蛾濃縮液處理組的TC水平最低，顯著低于模型組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），與空白對(duì)照組差異不顯著。柞蠶雄蛾濃縮液處理組的TG水平低于模型組和陽(yáng)性對(duì)照組，但差異不顯著；三者TG水平均顯著高于空白對(duì)照組。在HDL－C水平上，柞蠶雄蛾濃溶液處理組最低，其次為陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、空白對(duì)照組，但四組處理間差異不顯著。柞蠶雄蛾濃溶液處理組的LDL－C水平最低，與空白對(duì)照組差異不顯著，但顯著低于模型組和陽(yáng)性對(duì)照組。

圖3 小鼠血脂四項(xiàng)測(cè)定結(jié)果比較

2.4 柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)小鼠肝臟及脂肪組織的病理學(xué)影響

如圖4所示，空白對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)完整，無(wú)脂肪滴，無(wú)炎癥反應(yīng)；模型組小鼠肝臟細(xì)胞排列松散無(wú)序，部分細(xì)胞核破損，多處出現(xiàn)脂肪顆粒；柞蠶雄蛾濃縮液處理組細(xì)胞排列有序，形態(tài)完整，無(wú)脂肪滴，無(wú)炎癥反應(yīng)；陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞排列有序，形態(tài)完整，無(wú)脂肪滴，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。

圖4 肝臟HE染色（400×）

如圖5所示，模型組脂肪細(xì)胞明顯大于其它三組；柞蠶雄蛾濃縮液處理組和陽(yáng)性對(duì)照組的脂肪細(xì)胞直徑相差不多，但比空白對(duì)照組稍大。

圖5 脂肪HE染色（400×）

3 討論與結(jié)論

本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)柞蠶雄蛾濃縮液的保健功能做了初步研究，表明其可明顯降低四氯化碳中毒小鼠的肝細(xì)胞變性、壞死程度和范圍，對(duì)受損肝組織具有明顯保護(hù)作用，對(duì)于高脂血癥有良好的治療效果［10］；Li等［11］研究證明柞蠶雄蛾濃縮液的有效成分對(duì)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫均具有明顯增強(qiáng)作用，對(duì)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)功能也有一定增高趨勢(shì)，并且還具有一定的抗腫瘤作用［12］。此外，柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)酒精性脂肪肝也被證明有一定的預(yù)防作用，能抵抗因飲用酒精而導(dǎo)致的肝細(xì)胞線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝脂肪變性有一定保護(hù)作用［13］；賈青等進(jìn)一步探明柞蠶雄蛾濃縮液能夠降低小鼠早期酒精性肝病Kupffer細(xì)胞Toll樣受體4及肝組織中TNF－α的表達(dá)［14］。另外，柞蠶雄蛾濃縮液對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化也具有顯著的預(yù)防作用，其機(jī)制可能與調(diào)控TGFβ1／Smad2／3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、下調(diào)TIMP及抑制CTGF的活化與增殖有關(guān)［15］。

本研究結(jié)果表明，其能夠降低高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠體重、肝臟質(zhì)量／體重和脂肪質(zhì)量／體重的值，說(shuō)明其能夠減少小鼠體內(nèi)的脂肪堆積。HE染色結(jié)果表明，其能夠明顯減少肝臟炎癥反應(yīng)和脂肪化及改善脂肪在體內(nèi)的堆積。本研究結(jié)果可為利用柞蠶開發(fā)預(yù)防和治療NAFLD的產(chǎn)品提供參考。