清營(yíng)口服液抑制H1N1豬流感病毒復(fù)制作用的研究

解云輝，林樹(shù)乾，黃中利，殷斌，楊世發(fā)，祝鈺瑋，閆振貴，吳家強(qiáng)，劉月月

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽綠色保健品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250023；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100）

豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）屬正粘病毒科甲型流感病毒屬，是一種具有廣泛感染范圍的分節(jié)段的、單股負(fù)鏈的RNA病毒［1］，主要感染哺乳類(lèi)動(dòng)物和禽類(lèi)［2］。甲型流感病毒根據(jù)其表面抗原血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同，目前分為17個(gè)亞型（H1～H17）和10個(gè)亞型（N1～N10），流感病毒可根據(jù)HA和NA多樣的排列組合，形成多種不同的亞型［3，4］。SIV含有8個(gè)基因組片段，當(dāng)同類(lèi)型的兩種或兩種以上不同的病毒感染同一個(gè)宿主細(xì)胞時(shí)，這些病毒的所有基因片段都可以在病毒增殖傳播中交換、重組，從而產(chǎn)生新的基因重組病毒［5］。在流感病毒感染細(xì)胞后，病毒的RNA進(jìn)入細(xì)胞核中，并在此進(jìn)行復(fù)制，從而產(chǎn)生新的子代病毒，并轉(zhuǎn)運(yùn)出核［6］。甲型流感病毒的NP蛋白是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，因此可以通過(guò)檢測(cè)NP蛋白的核定位從而對(duì)甲型流感病毒感染細(xì)胞的程度進(jìn)行初步判斷。目前用于治療流感病毒感染的藥物主要包括M2離子通道阻滯劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑［7］，然而由于氨基酸的突變，耐藥性越來(lái)越強(qiáng)［8］。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗流感藥物。中藥有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)［9］，不僅能夠抑制病毒，還有提高機(jī)體免疫功能的保健功效。H1N1 SIV在流感病毒流行中扮演重要角色，因其不僅能夠感染豬，還能夠感染其他哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)，甚至是人類(lèi)［10，11］，從而導(dǎo)致流感大流行和季節(jié)性流行。因此本研究旨在開(kāi)發(fā)一種新的抗SIV藥物，為在臨床上降低SIV的感染率、發(fā)病率提供基礎(chǔ)。

清營(yíng)口服液由古方清營(yíng)湯改造而成，以前廣泛用于治療太陰溫病、手厥陰暑溫、暑癇、陽(yáng)明溫病等［12］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證明了清營(yíng)湯在疾病治療中的作用，如清營(yíng)湯合生脈散加減可用于治療膿毒癥［13］；清營(yíng)湯治療別嘌醇過(guò)敏致急性腎損傷［14］；清營(yíng)湯加減對(duì)糖尿病腎病熱毒血瘀型在臨床上也起到了積極效果［15］。在獸醫(yī)臨床方面，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)清營(yíng)口服液對(duì)Wistar大鼠和雞感染大腸桿菌有良好的預(yù)防和治療效果，適合治療由大腸桿菌引起的家禽熱證［16］。由于清營(yíng)口服液主治熱入營(yíng)分證，豬流感能夠引起豬的熱證，因此，本試驗(yàn)針對(duì)體內(nèi)和體外試驗(yàn)對(duì)清營(yíng)口服液抑制甲型H1N1亞型豬流感病毒的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥物 清營(yíng)口服液組方（500 g）：水牛角69 g、金銀花69 g、麥冬51 g、生地黃69 g、連翹52 g、玄參69 g、黃連35 g、竹葉34 g、丹參52 g，將原材料加10倍量水浸泡30 min，煎煮2 h，過(guò)濾；第二次加5倍量水，煎煮0.5 h，過(guò)濾。合并兩次濾液，濃縮至500 mL，4℃保存，備用。上述原材料采購(gòu)自濟(jì)南市建聯(lián)中藥有限公司；連花清瘟顆粒由北京以嶺藥業(yè)有限公司提供；利巴韋林對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞（9～11日齡）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所昊泰動(dòng)物繁育中心提供，C57BL／6小鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅試驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.1.3 細(xì)胞與毒株 MDCK細(xì)胞（犬腎細(xì)胞）由山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與；H1N1病毒株分離自發(fā)病豬（山東省泰安市某養(yǎng)殖場(chǎng)）的肺臟組織。

1.1.4 主要試劑 Anti-H1N1甲型流感virus Nucleocapsid蛋白抗體購(gòu)自Abcam公司；Evo MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ、SYBR GreenPro TaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒購(gòu)自Accurate Biology公司；Foetal Bovine Serum購(gòu)自Biological Industries公司；Star Marker D2000購(gòu)自GenStar公司；Phosphate Buffered Saline、DMEM／HIGH GLUCOSE購(gòu)自HyClone公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Servicebio公司；DAPI溶液購(gòu)自Solarbio公司；rTaq酶、RNAiso Plus購(gòu)自TaKaRa公司；Cell Counting Kit－8購(gòu)自北仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒分離鑒定及純化 取發(fā)病豬的肺臟組織，使用Trizol法提取病毒RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，按照TakararTaq說(shuō)明書(shū)PCR擴(kuò)增病毒后進(jìn)行核酸電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增程序：95℃5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共36個(gè)循環(huán)；72℃5 min。引物序列如表1所示。

表1 試驗(yàn)所用引物

取肺臟組織研磨至勻漿狀，使用0.22μm濾器過(guò)濾，接種到SPF雞胚中，96 h后收取雞胚尿囊液為第一代病毒液并連續(xù)傳代5代。

1.2.2 體內(nèi)抗病毒試驗(yàn) （1）中藥制劑反復(fù)給藥急性毒性試驗(yàn)：取24只雄性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，稱(chēng)重后隨機(jī)分為4組，每組6只，分為空白對(duì)照組，清營(yíng)口服液高、中、低（1.50、0.75、0.38 g／kg）劑量組。小鼠每天固定時(shí)間灌胃，0.02 mL／g連續(xù)灌胃7 d，對(duì)照組灌胃等體積PBS，每天觀察臨床表現(xiàn)，每?jī)商旆Q(chēng)重一次，共觀察14 d，計(jì)算體重比。體重比＝當(dāng)天的體重／初始體重。試驗(yàn)結(jié)束前12～16 h禁食不禁水，采血做血常規(guī)和生化檢測(cè)。

（2）流感病毒半數(shù)感染量（ID50）測(cè)定：將H1N1 SIV在SPF雞胚內(nèi)增毒，收集雞胚尿囊液后依次稀釋10倍為10－1、10－2、10－3、10－4濃度的病毒液。取25只雄性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，稱(chēng)重后隨機(jī)分為5組，每組5只，分別為空白對(duì)照組和病毒對(duì)照組（10－1～10－4）。病毒對(duì)照組小鼠經(jīng)乙醚麻醉后，滴鼻感染不同濃度的病毒液50μL，空白對(duì)照組小鼠滴鼻50μL PBS，每天觀察臨床反應(yīng)，記錄死亡時(shí)間，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)（24 h內(nèi)死亡的不計(jì)入死亡數(shù)）、體重下降小鼠數(shù)、精神不佳小鼠數(shù)，觀察14 d，利用Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量。

（3）小鼠感染模型建立及給藥：將42只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，稱(chēng)重后隨機(jī)分為6組，每組7只，分為空白對(duì)照組，病毒對(duì)照組，清營(yíng)口服液38、75、150 mg／kg劑量組，連花清瘟（藥物對(duì)照）組。乙醚麻醉后用PBS滴鼻作為空白對(duì)照組，其余各組100ID50滴鼻50μL／只，病毒感染4 h后開(kāi)始灌胃藥物，連續(xù)灌胃5 d，空白對(duì)照組和病毒對(duì)照組給予與中藥等體積的生理鹽水。每?jī)商鞙y(cè)量一次小鼠體重，計(jì)算體重比。

（4）肺指數(shù)測(cè)定：連續(xù)灌胃5 d后，將小鼠用脊椎脫臼法處死，稱(chēng)取體重后剖開(kāi)胸腔取出肺組織稱(chēng)重。肺指數(shù)＝肺重／體重。

（5）肺組織切片觀察：取各組小鼠相同部位的肺組織，4%多聚甲醛進(jìn)行固定后，送至武漢塞維爾生物科技有限公司切片制作，蘇木精－伊紅染色法染色（HE染色），于顯微鏡下觀察肺臟的病變情況并拍照。

（6）肺組織病毒載量測(cè)定：每組取3只小鼠相同部位、相同大小的肺組織，放入1.5 mL離心管，加入1 mL RNAiso Plus，研磨成肺組織勻漿，提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。按照SYBR GreenPro TaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體系配制，熒光定量PCR程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，72℃10 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃10 s，65℃60 s，97℃1 s。使用2－ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)水平的倍比變化，所有PCR反應(yīng)均重復(fù)3次。

1.2.3 體外抗病毒試驗(yàn) （1）病毒毒力檢測(cè)：將MDCK細(xì)胞鋪于96孔板中培養(yǎng)至單層，棄去孔中液體，用PBS清洗細(xì)胞2次。用病毒生長(zhǎng)液將病毒按10倍倍比稀釋為不同濃度，加入96孔板，每孔100μL，每個(gè)濃度8復(fù)孔；設(shè)空白對(duì)照組（正常細(xì)胞），加入病毒生長(zhǎng)液，每孔100μL。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附2 h后棄去病毒液，加入病毒生長(zhǎng)液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，直到細(xì)胞不再出現(xiàn)新的病變。顯微鏡觀察并記錄每個(gè)稀釋倍比下出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)，記錄細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的組織細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）。

（2）供試品細(xì)胞毒性檢測(cè)：將MDCK細(xì)胞鋪于96孔板中培養(yǎng)至單層，棄去孔中液體，將對(duì)半稀釋后不同濃度的清營(yíng)口服液、利巴韋林分別加入96孔板，對(duì)照組細(xì)胞不加藥品，培養(yǎng)72 h后棄去含藥培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加入10μL的CCK－8溶液，混勻。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度（A）值，檢測(cè)波長(zhǎng)為470 nm，根據(jù)測(cè)得的A值，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）＝試驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值×100。

（3）清營(yíng)口服液對(duì)H1N1 SIV的抑制作用：將MDCK細(xì)胞鋪于24孔板中培養(yǎng)至單層，棄去24孔板中液體，用PBS清洗細(xì)胞2次。加入100TCID50病毒液與不同濃度清營(yíng)口服液的混合物，作用48 h后提取RNA。

為探究清營(yíng)口服液在不同階段的作用效果，設(shè)置三種模式：吸附前期、吸附期和吸附后期（圖1），同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。

圖1 藥物作用模式圖

吸附前期：將清營(yíng)口服液不同濃度稀釋液分別加入細(xì)胞中，37℃孵育2 h后換液成100TCID50病毒液，作用2 h后棄去24孔板中液體，加入400 μL維持液（含2% FBS的DMEM），48 h后提取RNA。

吸附期：向細(xì)胞中加入100TCID50病毒液，37℃感染2 h后換液成清營(yíng)口服液不同濃度稀釋液，48 h后提取RNA。

吸附后期：將100TCID50病毒液分別與清營(yíng)口服液不同濃度稀釋液混合，將混合物放于37℃作用1 h后分別加入24孔板中，作用4 h后棄去24孔板中的液體，加入400μL維持液，48 h后提取RNA。

（4）細(xì)胞病毒載量測(cè)定：將上一步提取的RNA用試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。

（5）免疫熒光試驗(yàn)：將MDCK細(xì)胞鋪于24孔板至細(xì)胞長(zhǎng)至單層，吸出培養(yǎng)基，加入病毒與不同濃度藥物的混合物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、利巴韋林對(duì)照組，作用48 h后進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。

吸出孔中液體，每孔加入400μL用PBS配置的4%甲醛室溫固定20 min；棄掉孔中液體，每孔加入400μL PBS洗滌3次，每次3 min；每孔加入400μL用PBS配置的0.1% Triton X－100，室溫通透15 min；每孔加入400μL PBS洗滌5次，每次3 min；每孔加入400μL用PBS配置的5%BSA，室溫封閉30 min；每孔加入400μL PBS洗滌3次，每次3 min；用PBS按照一抗說(shuō)明書(shū)濃度配置好一抗稀釋液，每孔加入200μL，將12孔板置于濕盒中，4℃過(guò)夜；吸出一抗，每孔加入400 μL PBS洗滌5次，每次3 min；用PBS按照二抗說(shuō)明書(shū)配置好二抗稀釋液，每孔加入200μL，置于37℃溫箱避光孵育1 h；每孔加入400μL PBS洗滌3次，每次3 min；每孔加入400μL DAPI，室溫避光染色10 min；使用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬流感病毒的分離與鑒定

發(fā)病豬在1月齡左右（圖2A），表現(xiàn)高熱發(fā)抖，皮膚發(fā)紅，食欲減退，活動(dòng)減少，并伴有噴嚏、鼻炎、咳嗽等癥狀。隨著病程發(fā)展，發(fā)病豬出現(xiàn)呼吸困難、臥地不起，最終死亡。對(duì)豬場(chǎng)其余豬進(jìn)行抗流感藥物治療后，癥狀有所緩解。剖檢后發(fā)現(xiàn)氣管粘膜充血，喉頭有輕微出血，肺臟有充血、實(shí)變等癥狀（圖2B）。對(duì)死亡豬的病料進(jìn)行RNA提取，RT－PCR檢測(cè)，確診為H1N1流感病毒，同時(shí)對(duì)引起豬高熱的其他常見(jiàn)疾病，包括豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)、豬偽狂犬進(jìn)行病原檢測(cè)，結(jié)果均為陰性（圖2C）。將該病毒樣研磨稀釋100倍后接種至SPF雞胚，于96 h后收集尿囊液，連續(xù)傳代5代后，測(cè)得血凝效價(jià)為25，收集尿囊液凍于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖2 發(fā)病豬（A）、臨床剖檢病變（B）和PCR鑒定結(jié)果（C）

2.2 體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 清營(yíng)口服液對(duì)小鼠的毒性作用 本試驗(yàn)在開(kāi)始給藥后的第0、2、4、6、8、10、12、14 d對(duì)小鼠進(jìn)行體重測(cè)量，結(jié)果顯示，0.38、0.75、1.50 g／kg劑量組和空白對(duì)照組的小鼠體重均為上升趨勢(shì)（圖3），PBS對(duì)照組最大增幅為原體重的5.77%，0.38 g／kg清營(yíng)口服液組最大增幅為原體重的5.95%，0.75 g／kg清營(yíng)口服液組最大增幅為原體重的7.24%，1.50 g／kg清營(yíng)口服液組最大增幅為原體重的6.49%，表明3種劑量清營(yíng)口服液均未對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。

圖3 不同劑量清營(yíng)口服液對(duì)小鼠體重比的影響

血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果（表2）和生化檢測(cè)結(jié)果（表3）均顯示，各給藥組與空白組均無(wú)明顯差異，表明清營(yíng)口服液按最大劑量給藥對(duì)小鼠無(wú)毒性。

表2 小鼠血常規(guī)測(cè)定

表3 小鼠生化指標(biāo)測(cè)定

2.2.2 半數(shù)感染量（ID50） 利用Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量（ID50）為10－4.48。

2.2.3 小鼠感染給藥后體重比 由圖4可知，0～2 d所有小鼠體重均上漲，空白對(duì)照組體重增長(zhǎng)率為11.0%，病毒對(duì)照組為10.6%，給藥組平均為14.0%；第2～4 d空白對(duì)照組體重增長(zhǎng)率為11.5%，病毒對(duì)照組為9.7%，給藥組平均為11.9%；第4～6 d所有小鼠體重較前兩天均下降，空白對(duì)照組體重增長(zhǎng)率為10.8%，病毒對(duì)照組為5.1%，給藥組平均為5.7%。綜上，從清營(yíng)口服液對(duì)感染H1N1 SIV后小鼠體重的影響來(lái)看，藥物全程均有抗病毒效果，在0～2 d藥效最明顯。

圖4 感染給藥模型小鼠體重比

2.2.4 小鼠感染給藥后肺指數(shù) 對(duì)小鼠剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠肺臟呈淡紅色，無(wú)病變；病毒對(duì)照組小鼠肺臟出現(xiàn)明顯水腫，呈暗紅色，表面有出血點(diǎn)；各藥物治療組小鼠肺呈淡紅色，偶見(jiàn)出血點(diǎn)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果（圖5）顯示，病毒對(duì)照組與空白對(duì)照組肺指數(shù)有顯著差異；各藥物治療組與空白對(duì)照組差異不顯著，表明清營(yíng)口服液對(duì)小鼠體內(nèi)H1N1流感病毒有良好的治療效果。

圖5 感染給藥后小鼠肺指數(shù)

2.2.5 各組病毒載量的變化 肺組織病毒載量檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，給藥組與病毒對(duì)照組小鼠肺組織病毒載量差異達(dá)極顯著水平，說(shuō)明清營(yíng)口服液對(duì)小鼠體內(nèi)H1N1 SIV有抑制作用，平均抑制率達(dá)99.41%。

圖6 感染給藥后小鼠肺組織病毒載量

2.2.6 小鼠肺組織病理檢查 染色結(jié)果（圖7）顯示，空白對(duì)照組肺泡壁較薄，無(wú)充血、出血現(xiàn)象，肺巨噬細(xì)胞較少；病毒對(duì)照組肺泡壁增厚，毛細(xì)血管充血，肺巨噬細(xì)胞增多；150 mg／kg清營(yíng)口服液給藥后與連花清瘟給藥后肺巨噬細(xì)胞少量增多，無(wú)充血、出血現(xiàn)象，肺泡壁無(wú)明顯變化；75 mg／kg清營(yíng)口服液給藥后肺泡壁輕微增厚，有輕微的出血現(xiàn)象，肺巨噬細(xì)胞增多；38 mg／kg清營(yíng)口服液給藥后肺泡壁嚴(yán)重增厚，充血現(xiàn)象明顯，肺巨噬細(xì)胞增多。因此，150 mg／kg清營(yíng)口服液對(duì)小鼠體內(nèi)H1N1 SIV的治療效果最好，75 mg／kg和38 mg／kg清營(yíng)口服液效果一般。

圖7 感染給藥后小鼠肺組織病理切片結(jié)果

2.3 體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 H1N1 SIV對(duì)MDCK細(xì)胞的TCID50測(cè)定流感病毒感染MDCK細(xì)胞后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞變圓、空泡，細(xì)胞之間出現(xiàn)星狀聚集成團(tuán)、脫落、核固縮等現(xiàn)象；正常對(duì)照組的細(xì)胞狀態(tài)良好，排列緊密。利用Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量（TCID50），每100μL為10－3.66。

2.3.2 細(xì)胞給藥最大安全濃度測(cè)定 檢測(cè)供試藥物的細(xì)胞毒性是評(píng)價(jià)抗病毒藥效的前提，在本試驗(yàn)中，細(xì)胞存活率≥85%被認(rèn)為藥物對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷。由圖8可知，當(dāng)清營(yíng)口服液濃度為100 mg／mL和50 mg／mL時(shí)，細(xì)胞存活率小于85%，濃度≤25 mg／mL時(shí)，細(xì)胞存活率大于90%。使用同樣方法測(cè)得對(duì)照藥物利巴韋林的最大安全濃度為1.25 mg／mL。后續(xù)試驗(yàn)均以清營(yíng)口服液和利巴韋林的最大安全濃度進(jìn)行。

圖8 清營(yíng)口服液細(xì)胞毒性檢測(cè)

2.3.3 藥物對(duì)H1N1 SIV的抑制作用 病毒載量檢測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，在藥物的安全范圍內(nèi)，隨藥物濃度增加，對(duì)H1N1 SIV的抑制效果增強(qiáng)，并且呈一定的量效關(guān)系。清營(yíng)口服液和利巴韋林均可顯著抑制流感病毒的增殖，其中25 mg／mL清營(yíng)口服液對(duì)H1N1 SIV的抑制作用最明顯。

圖9 不同藥物及濃度下H1N1 SIV載量

為確定清營(yíng)口服液在病毒生命周期中發(fā)揮作用的階段，分別將不同濃度的藥物作用于病毒吸附前期、吸附期和吸附后期并進(jìn)行藥效分析。結(jié)果（圖10）表明，3種作用模式下，清營(yíng)口服液均對(duì)H1N1 SIV表現(xiàn)出極顯著（P＜0.01）抑制效果，其中吸附后期的抑制效果最佳，25 mg／mL清營(yíng)口服液在吸附后期對(duì)H1N1 SIV 的抑制率達(dá)96.8%，而吸附前期和吸附期的抑制率分別為95.6%和73.3%。以上結(jié)果表明，清營(yíng)口服液具有抗H1N1 SIV活性，在感染的吸附后期效果最好。

圖10 清營(yíng)口服液不同作用時(shí)期H1N1 SIV載量

2.3.4 藥物對(duì)H1N1豬流感病毒核蛋白的抑制作用 NP蛋白在流感病毒復(fù)制過(guò)程中起重要作用，通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H1N1 SIV感染MDCK細(xì)胞48 h后，病毒對(duì)照組NP蛋白彌散在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中（圖11B），經(jīng)過(guò)藥物處理后，6.25 mg／mL清營(yíng)口服液處理過(guò)的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都存在綠色熒光（圖11D），但12.5 mg／mL和25 mg／mL藥物組只見(jiàn)細(xì)胞核中有明顯綠色熒光，未見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中有熒光存在（圖11E、F），利巴韋林對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)見(jiàn)明顯熒光，細(xì)胞質(zhì)中無(wú)熒光（圖11C）。表明清營(yíng)口服液能夠有效抑制H1N1 SIV的NP蛋白核輸出。

圖11 免疫熒光檢測(cè)清營(yíng)口服液對(duì)H1N1 SIV的NP蛋白核輸出的影響

3 討論與結(jié)論

流感病毒可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生急性呼吸道癥狀，對(duì)人類(lèi)公共衛(wèi)生與健康造成極大威脅，豬有流感病毒“混合器”之稱(chēng)，與流感病毒的流行和爆發(fā)有著密不可分的聯(lián)系。2009年爆發(fā)的豬源H1N1流感導(dǎo)致人體嚴(yán)重的流感樣癥狀并引發(fā)了多種并發(fā)癥，在人際間具有很高的傳播性［17］。H1N1豬流感在我國(guó)豬群中一直存在并保持較高的流行率，2011年我國(guó)出現(xiàn)了人感染類(lèi)禽H1N1亞型SIV事件［18］；有研究人員監(jiān)測(cè)到一株重組流感病毒G4EAH1N1，自2016年已成為國(guó)內(nèi)豬流感病毒的主體［17］，并具備在人群中流行的潛力。本課題組對(duì)山東省豬流感病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)2020年的發(fā)病率和致死率均較往年有所升高，暗示該亞型病毒毒性可能逐漸增強(qiáng)。可見(jiàn)對(duì)該病毒進(jìn)行防控具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

中藥是我國(guó)的瑰寶，在治療疾病中發(fā)揮了重要角色，銀屑病和阿爾茨海默癥就被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)中藥來(lái)治療［19，20］，尤其在2020年抗擊新型冠狀病毒肺炎的關(guān)鍵時(shí)刻，中草藥的合理使用也在臨床一線發(fā)揮出了重要優(yōu)勢(shì)［21］。清營(yíng)口服液是本課題組研制的三類(lèi)新獸藥，由古方清營(yíng)湯改造。清營(yíng)湯目前對(duì)膿毒血癥、糖尿病腎病熱毒血瘀型發(fā)揮了良好的治療效果，但對(duì)H1N1 SIV的抑制效果有待研究，故本課題使用改良方清營(yíng)口服液針對(duì)體內(nèi)和體外兩方面進(jìn)行了抗豬流感病毒效果的研究。

本課題組在山東省泰安市某養(yǎng)豬場(chǎng)病死豬的病料中鑒定出一株H1N1亞型豬流感病毒，通過(guò)對(duì)該株病毒的純化，測(cè)得其血凝效價(jià)為25，在MDCK細(xì)胞上測(cè)得TCID50，每100μL為10－3.66。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，清營(yíng)口服液對(duì)小鼠無(wú)毒性，且對(duì)小鼠感染H1N1 SIV有明顯的抑制效果。為進(jìn)一步檢測(cè)清營(yíng)口服液抗流感病毒的作用，在細(xì)胞水平上對(duì)清營(yíng)口服液抗豬流感病毒的藥效進(jìn)行了探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清營(yíng)口服液對(duì)病毒的抑制效果顯著，且在吸附后期對(duì)H1N1 SIV的抑制效果最好，說(shuō)明藥物可以在細(xì)胞水平上起到良好的抗H1N1 SIV效果。利用免疫熒光試驗(yàn)檢驗(yàn)清營(yíng)口服液對(duì)NP蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)25 mg／mL和12.5 mg／mL濃度的藥物能夠有效抑制NP蛋白的核輸出，抑制病毒復(fù)制。綜上所述，清營(yíng)口服液在體內(nèi)外對(duì)H1N1 SIV的復(fù)制均有明顯的抑制作用。