火針對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬相關(guān)蛋白LC3及血清炎癥因子的影響

高仰來 馮鵬 李曉霞

【摘 要】目的：觀察火針對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）及血清炎癥因子的影響。方法：將36只健康SD大鼠隨機分為空白對照組（8只）和造模組（28只），采用改良Hulth法制備膝骨關(guān)節(jié)炎模型，6周后隨機選取造模組4只大鼠處死，行關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)檢查判定模型制備是否成功，隨后將剩余24只大鼠隨機分為模型對照組、西藥組、火針組，每組8只。火針組給予火針治療干預(yù)，每周2次；西藥組給予鹽酸氨基葡萄糖片溶液1.6 mL（0.384 mg）灌胃，每日1次；空白對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次。各組均以4周為1個療程。1個療程結(jié)束后，采集各組大鼠血清、關(guān)節(jié)軟骨，采用ELISA法、PCR法對血清標(biāo)本的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3、MMP-13、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、LC3水平進行檢測；HE染色法觀察關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與空白對照組比較，模型對照組、西藥組、火針組MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表達升高（P < 0.05），LC3表達降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，火針組MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表達降低（P < 0.05），LC3表達升高（P < 0.05）；與西藥組比較，火針組MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表達降低（P < 0.05），LC3表達升高（P < 0.05）。關(guān)節(jié)軟骨病理切片顯示，火針組關(guān)節(jié)腔隙明顯，軟骨表面毛糙，滑膜組織有少量破損，炎性細胞浸潤但少于模型對照組，部分潮線破壞，軟骨細胞排列尚均勻。結(jié)論：火針可降低血清炎性因子含量，上調(diào)自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達，抑制膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，緩解炎性浸潤，減輕軟骨細胞的破壞，改善其病理狀態(tài)。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎；火針；自噬；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；炎癥因子；大鼠

The Effect of Fire Acupuncture on Autophagy Related Protein LC3 and Serum Inflammatory Factors in Joint Chondrocytes of Rats with Knee Osteoarthritis

GAO Yang-lai，F(xiàn)ENG Peng，LI Xiao-xia

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of fire acupuncture on autophagy related protein LC3 and serum inflammatory factors in knee joint chondrocytes of rats with knee osteoarthritis.Methods：Thirty-six healthy

SD rats were randomly divided into a blank control group（8 rats）and a modeling group（28 rats）.Knee osteoarthritis models were prepared using the improved Hulth method.After 6 weeks，4 rats in the modeling group were randomly selected and killed.Joint cartilage pathology examination was performed to determine whether the model was successful.Subsequently，the remaining 24 rats were randomly divided into a model control group，a Western medicine group，and a fire acupuncture group，with eight rats in each group.The fire acupuncture group received fire acupuncture treatment intervention，twice a week;the western medicine group was given 1.6mL（0.384 mg）of glucosamine hydrochloride tablet solution by gavage，once a day;the blank control group and the model control group were given an equal amount of physiological saline by gavage，once a day.

A treatment course of four weeks was for each group.After one course of treatment，collect serum and articular cartilage from rats in each group，and use ELISA and PCR methods to detect the levels of MMP-1，MMP-3，MMP-13，TNF-α，

IL-1β and LC3;HE staining method was used to observe the morphology and structure of articular cartilage tissue.Results：Compared with the blank control group，the expressions of MMP-1，MMP-3，MMP-13，TNF-α and IL-1β in the model control group，the western medicine group and the fire acupuncture group increased（P < 0.05），while the expression of LC3 decreased（P < 0.05）;compared with the model control group，the expressions of MMP-1，

MMP-3，MMP-13，TNF-α and IL-1β in the fire acupuncture group decreased（P < 0.05），while the expression of LC3 increased（P < 0.05）;compared with the western medicine group，the expressions of MMP-1，MMP-3，

MMP-13，TNF-α and IL-1β in the fire acupuncture group decreased（P < 0.05），while the expression of LC3 increased

（P < 0.05）.Pathological sections of articular cartilage showed that in the fire acupuncture group，the joint cavity was obvious，the surface of the cartilage was rough，there was a small amount of damage to synovial tissue，inflammatory cell infiltration was less than that in the model control group，some tidal lines were damaged，and the arrangement of chondrocytes was still uniform.Conclusion：Fire acupuncture can reduce the content of serum inflammatory factors，upregulate the expression of autophagy marker protein LC3，inhibit the inflammatory response of knee osteoarthritis，alleviate inflammatory infiltration and chondrocyte damage，and improve the pathological state.

【Keywords】 knee osteoarthritis;fire acupuncture;autophagy;LC3;inflammatory factors;rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨退變和慢性炎癥為主要特點的骨關(guān)節(jié)病，臨床上以膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫大伴膝關(guān)節(jié)功能障礙為主要癥狀。KOA的形成機制復(fù)雜，目前國際上普遍認為KOA的主要病理改變是細胞外基質(zhì)過度降解，引起軟骨成分進行性丟失，造成軟骨結(jié)構(gòu)破壞，最終引起膝關(guān)節(jié)功能障礙。這一病理改變的關(guān)鍵因素是炎性因子與軟骨細胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合，激活了自噬、炎癥等信號通路，致使細胞的降解大于合成，加速了關(guān)節(jié)軟骨的退變。課題組應(yīng)用火針治療KOA 10余年，取得了較好的臨床療

效［1-2］。為進一步探討火針治療KOA的機理，課題組依據(jù)多年臨床經(jīng)驗及有關(guān)針刺治療KOA選穴文獻［3-4］，選取經(jīng)脈以足陽明胃經(jīng)、足太陰脾經(jīng)為主，穴位以血海、梁丘、足三里、陰陵泉為主，采用火針干預(yù)KOA大鼠模型進行實驗研究，觀察火針對KOA大鼠血清白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、

MMP-3、MMP-13、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）表達水平以及關(guān)節(jié)軟骨損傷

情況。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 4周齡雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量（200±20）g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2015-0001。動物實驗方案通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2020-312）。實驗動物單只分籠飼養(yǎng)，動物房溫度設(shè)定為（23±3）℃，保持相對濕度（60±5）%。

1.2 火針及實驗藥品 火針采用華佗牌一次性無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格

0.35 mm×25 mm）。硫酸氨基葡萄糖片（新興同仁藥業(yè)有限公司，批號190901，規(guī)格0.314 g）。

1.3 實驗試劑 ELISA試劑盒（江蘇麥莎實業(yè)有限公司，批號Jul2021）；SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（Accurate Biotechnology，批號A3A1983）；RNAex Pro RNA提取試劑（Accurate Biotechnology，批號A3A2161）；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒（Accurate Biotechnology，批號A3A1403）；HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20191104）。

1.4 實驗儀器 酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司，

型號iMark）；高速低溫臺式離心機（德國Eppendorf，型號TGL-16）；NanoDrop核酸濃度測量儀（美國Thermo公司，型號ND-ONE-W）；實時定量PCR儀（美國Thermo公司，型號StepOne Plus）；切片機（德國徠卡公司，型號RM2016）；顯微鏡（德國徠卡公司，型號DM2500）。

2 方 法

2.1 分組及模型制備 將36只健康SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組8只和造模組28只。采用改良Hulth法［5］制備KOA模型，為防止手術(shù)切口感染，造模組大鼠術(shù)后3 d內(nèi)皮下注射青霉素20萬單位。傷口愈合后每日驅(qū)趕大鼠活動半小時，共計驅(qū)趕6周。6周后隨機選取造模組4只大鼠處死，行關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示典型軟骨退變時判定模型制作成功，隨后將造模組剩余24只大鼠隨機分為模型對照組、西藥組、火針組，每組8只。

2.2 干預(yù)方法 火針組取血海、梁丘、足三里、陰陵泉四穴，大鼠穴位參考文獻［6］，給予火針治療干預(yù)，每周2次；西藥組給予0.24 mg·mL-1鹽酸氨基葡萄糖片溶液1.6 mL（0.384 mg）灌胃，每日1次；空白對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，每日１次。各組均以4周為1個療程。

2.3 標(biāo)本采集 干預(yù)4周結(jié)束后，對所有實驗大鼠進行心臟采血，室溫下離心機以3000 r·min-1離心15 min，離心半徑7.5 cm，取血清，待測。用咬骨鉗剪斷大鼠右側(cè)下肢股骨中上1/3部，分離出下肢，剔除膝關(guān)節(jié)周圍肌肉組織，分離出脛股平臺后暴露出關(guān)節(jié)面，關(guān)節(jié)面上下各1.5 cm截骨，獲取膝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱保存待測。每組大鼠統(tǒng)一隨機選取4只右側(cè)膝關(guān)節(jié)用于形態(tài)學(xué)觀察，將切取股骨下1/3部放入含10%中性甲醛的固定液中固定48 h。隨后采用10%EDTA脫鈣劑充分脫鈣，待組織完全脫鈣并沖洗干凈后，切出股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨并修切為約2 mm×3 mm×4 mm大小，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，

待檢。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清

MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3含量 采用ELISA法測定，嚴格按照試劑說明書步驟，檢測各組大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3的含量。

2.5 逆轉(zhuǎn)錄熒光實時定量（PCR）法檢測血清MMP-1、MMP-3、MMP-13 、TNF-α、IL-1β、LC3 mRNA水平 取大鼠離心血清提取RNA，測定其純度和濃度（紫外分光光度計），用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。所有PCR均做3個復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果以2-△△CT表示。PCR引物序列見表1。

2.6 膝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本病理學(xué)檢測 采用HE染色觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變，采用Mankin's評分方法定量分析軟骨損傷情況。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3水平比較 與空白對照組比較，模型對照組、西藥組、火針組MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表達升高（P < 0.05），LC3表達降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，西藥組、火針組MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表達降低（P < 0.05），LC3表達升高（P < 0.05）；與西藥組比較，火針組MMP-13表達降低（P < 0.05），TNF-α、LC3表達升高（P < 0.05）。見表2。

3.2 各組大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3 mRNA水平比較 與空白對照組比較，模型對照組、西藥組、火針組大鼠血清中MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達量升高（P < 0.05），LC3 mRNA相對表達量降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，西藥組、火針組MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達量降低（P < 0.05），LC3表達升高（P < 0.05）；與西藥組比較，火針組MMP-13 mRNA相對表達量降低（P < 0.05）。見表3。

3.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測 HE染色結(jié)果顯示，空白對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)為粉紅色，細胞核為深藍色，軟骨細胞排列均勻，潮線結(jié)構(gòu)完整，關(guān)節(jié)腔隙清晰可見，關(guān)節(jié)腔兩面滑膜軟骨結(jié)構(gòu)光滑、層次分明，關(guān)節(jié)腔無炎性細胞浸潤，關(guān)節(jié)兩端骨組織致密；模型對照組關(guān)節(jié)腔隙明顯變窄，軟骨面有大面積缺損，滑膜組織及軟骨組織增生嚴重，軟骨細胞排列紊亂，并有軟骨和骨組織破損，潮線大量破壞，軟骨和滑膜組織內(nèi)有炎性細胞分布；火針組關(guān)節(jié)腔隙明顯，軟骨細胞排列尚均勻，軟骨表面毛糙，有少量破損，炎性細胞浸潤但少于模型對照組，潮線結(jié)構(gòu)有部分破損。見圖2。Mankin's評分結(jié)果顯示，模型對照組與火針組評分高于空白對照組（P < 0.01），模型對照組評分高于火針組

（P < 0.01）。

4 討 論

KOA屬中醫(yī)學(xué)“膝痛”“骨痹”等范疇。其病因較為復(fù)雜，多因長期勞損或年老體衰，致肝腎不足、筋脈關(guān)節(jié)失養(yǎng)，感受風(fēng)寒濕熱等外邪，造成關(guān)節(jié)失利、筋絡(luò)痹阻、氣血瘀滯，引起膝關(guān)節(jié)腫脹疼痛，活動受限等一系列癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，多種炎性因子在KOA發(fā)病的多個環(huán)節(jié)中起關(guān)鍵作用，其中IL-1β、IL-6、TNF-α是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨炎癥反應(yīng)的始動因素［7］，炎性因子與軟骨表面受體結(jié)合，從而激活軟骨細胞中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨釋放MMPs，破壞軟骨細胞外基質(zhì)的合成與空間正常結(jié)構(gòu)。自噬可以通過消除活動期炎癥細胞抑制炎癥反應(yīng)，阻斷自噬導(dǎo)致內(nèi)源性炎癥激活劑釋放而激活炎癥發(fā)生［8-9］，由此可見，自噬對炎癥有一定的抑制作用，是維持和平衡軟骨細胞內(nèi)環(huán)境的保護機制，在改善KOA的病理過程中發(fā)揮著重要作用［10-11］。

火針古代稱為燔針、淬針、燒針等，將針、溫?zé)崆擅顓R于一體，具備針與灸雙重作用，具有溫通經(jīng)脈、祛寒除濕、通絡(luò)止痛的功效，臨床上對骨關(guān)節(jié)疾病有較好療效。但火針較普通毫針操作技術(shù)難度和風(fēng)險大，患者易產(chǎn)生恐懼感，應(yīng)用范圍沒有毫針廣泛。

本研究以局部選穴為原則，配伍膝關(guān)節(jié)局部穴位血海、梁丘、足三里、陰陵泉，使用火針對KOA大鼠進行干預(yù)。研究發(fā)現(xiàn)，火針干預(yù)KOA大鼠后，血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β的表達均低于模型對照組（P < 0.05），說明火針可降低血清炎性因子含量，抑制KOA炎癥反應(yīng)；血清LC3的表達高于模型對照組（P < 0.05），說明火針干預(yù)可以上調(diào)自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達，增加軟骨細胞自噬水平，減輕軟骨細胞破壞，減緩KOA的發(fā)生、發(fā)展；病理學(xué)結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)軟骨面破壞較輕、軟骨缺失程度較少，炎性細胞浸潤程度少，說明火針干預(yù)可以緩解炎性浸潤，減輕軟骨細胞的破壞。

本研究結(jié)果顯示，火針干預(yù)可降低KOA大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達，減少TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌，上調(diào)自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達，抑制KOA炎癥反應(yīng)，增加軟骨細胞自噬的水平，緩解炎性浸潤，減輕軟骨細胞的破壞，改善其病理狀態(tài)，減緩KOA的發(fā)展。

參考文獻

［1］ 高仰來，姚軍漢，郭軍雄.火針刺骨法配合拔罐推拿綜合治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察［J］.中國針灸，2013，33（8）：697-699.

［2］ 高仰來.火針刺骨法治療骨關(guān)節(jié)疾病臨床應(yīng)用體

會［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2017，51（3）：64-65.

［3］ 陳麗萍，保瓊楠，趙凌，等.基于健康受試者的膝關(guān)節(jié)相關(guān)腧穴痛閾量化的觀察研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2020，22（6）：2029-2034.

［4］ 王瑞涵，薛平聚，邢海嬌，等.針灸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎腧穴配伍規(guī)律的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析［J］.針刺研究，2022，47（1）：65-70，87.

［5］ 李書博，陳赫，孫云，等.膝骨關(guān)節(jié)炎實驗動物模型現(xiàn)狀研究進展［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2022，38（8）：936-940.

［6］ 中國針灸學(xué)會.實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分：大鼠［J］.針刺研究，2021，46（4）：351-352.

［7］ 桂苗，施珊妮，黃澤靈，等.陽虛寒凝型兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立初探［J］.福建中醫(yī)藥，2022，53（8）：32-34.

［8］ CASTROGIOVANNI P，RAVALLI S，MUSUMECI G.Apoptosis and autophagy in the pathogenesis of osteoarthritis［J］.J Invest Surg，2020，33（9）：874-875.

［9］ 王浩，陳群超，殷麗麗.自噬在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞退變中表達的研究［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2021，10（4）：1-4，31.

［10］ 修忠標(biāo)，劉洪，張良志，等.針刀干預(yù)對膝骨關(guān)節(jié)炎兔原代軟骨細胞活性、凋亡及自噬的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2022，19（18）：123-127.

［11］ 周建華，李溟，王莉莉.自噬參與調(diào)控骨改建的研究進展［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2021，23（10）：730-735.

收稿日期：2023-04-15；修回日期：2023-05-27