高尿酸血癥對小鼠生精功能和精子質(zhì)量的影響及其機制

江曉翠　田代志　趙敏　龔健　余何　姜興宇　蕭閔

摘要：目的 探討高尿酸血癥（HUA）通過氧化損傷誘導(dǎo)睪丸細胞凋亡、降低小鼠生精功能和精子質(zhì)量的機制。方法 36只雄性昆明小鼠隨機分6組：氧嗪酸鉀1 d、7 d、14 d組，對照1 d、7 d、14 d組。其中氧嗪酸鉀組腹腔注射氧嗪酸鉀懸液600 mg/（kg·d）。生化法檢測血清尿酸（UA）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、黃嘌呤氧化酶（XO）和睪丸組織超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）；HE染色法觀察肝、腎、睪丸組織病理學(xué)變化并對睪丸HE切片進行生精功能評分；全自動精子分析儀檢測精子密度和活動率；蛋白免疫印跡法檢測睪丸組織B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）的表達。結(jié)果 與各自對照組比較，氧嗪酸鉀1 d組UA升高，氧嗪酸鉀7 d組UA、BUN、AST、XO均升高，氧嗪酸鉀14 d組UA、BUN、AST均升高（均P＜0.01）。氧嗪酸鉀7 d、14 d組肝、腎組織形態(tài)均有病變，氧嗪酸鉀7 d組較14 d組輕微。與對照7 d組比較，氧嗪酸鉀7 d組睪丸組織有明顯病變，生精功能、精子密度和活動率降低（P＜0.05），MDA含量升高，SOD、CAT活性降低（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達量及Bax/Bcl-2比例上升（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達量下降（P＜0.05）。結(jié)論 HUA小鼠生精功能和精子質(zhì)量降低，其機制可能為睪丸氧化損傷誘導(dǎo)細胞凋亡。

關(guān)鍵詞：高尿酸血癥；睪丸；精液分析；精子發(fā)生；氧化性應(yīng)激；細胞凋亡

中圖分類號：R698.2文獻標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221083

Effects and mechanism of hyperuricemia on spermatogenesis and sperm quality in mice

JIANG Xiaocui， TIAN Daizhi， ZHAO Min， GONG Jian， YU He， JIANG Xingyu， XIAO Min

Experimental Center of Chinese Medicine， Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430065， China

Corresponding Author E-mail： 531637551@qq.com

Abstract： Objective To investigate the mechanism of hyperuricemia （HUA） inducing testicular cell apoptosis and reducing spermatogenesis and sperm quality in mice through oxidative damage. Methods Thirty-six Kunming male mice were divided into 6 groups by random number method： the potassium oxyazinate groups for 1 d， 7 d and 14 d， and the control groups for 1 d， 7 d and 14 d. The potassium oxyazinate group was intraperitoneally injected with potassium oxyazinate suspension 600 mg/（kg·d）. Serum levels of uric acid （UA）， creatinine （Cre）， urea nitrogen （BUN）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， xanthine oxidase （XO）， and superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， malondialdehyde （MDA） in testicular tissue were detected by biochemical method. Eosin-hematoxylin （HE） staining was used to observe histopathological changes of liver， kidney and testis， and the spermatogenic function of testicular HE sections was scored. Automatic sperm analyzer detected sperm density and motility rate. The expression levels of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2 associated X protein （Bax） and Caspase-3 protein in testicular tissue were detected by Western blotting. Results Compared with the control group， UA was significantly increased in the potassium oxazinate 1 d group （P＜0.01）. The levels of UA， BUN， AST and XO were significantly increased in the potassium oxazinate 7 d group （P＜0.01）. The levels of UA， BUN and AST were significantly increased in the potassium oxazinate 14 d group （P＜0.01）. The pathological changes in liver and kidney tissue were observed in the potassium oxazinate 7 d and 14 d groups， and the lesion was milder in the potassium oxazinate 7? d groug than that of the potassium oxazinate 14 d group. Compared with the control 7 d group， there were obvious pathological changes and significantly decreased spermatogenic function in the potassium oxazinate 7 d group （P＜0.01）. The content of MDA was significantly increased （P＜0.05）， while the activities of SOD and CAT were significantly decreased （P＜0.05）. The protein expression levels of Bax and Caspase-3 were significantly increased （P＜0.05）， the ratio of Bax to Bcl-2 was also increased （P＜0.05）， and the protein expression level of Bcl-2 was significantly decreased （P＜0.05）. Conclusion The spermatogenic function and sperm quality are decreased in HUA mice， which may be caused by testicular oxidative damage induced apoptosis.

Key words： hyperuricemia; testis; semen analysis; spermatogenesis; oxidative stress; apoptosis

高尿酸血癥（HUA）是一種由于嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄不足導(dǎo)致體內(nèi)尿酸高于正常值的常見代謝病［1］。隨著生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)改變以及遺傳和環(huán)境因素影響，HUA患病率逐年增高［2］。研究顯示，HUA患病率有明顯性別差異，男性高于女性，患病人群呈現(xiàn)出年輕化趨勢，在18～29歲男性中達到峰值［3-4］。在全球男性生殖功能下降的趨勢下，典型代謝病，如肥胖［5］、糖尿?。?］已被證實可降低精子質(zhì)量，誘發(fā)不育。HUA男性易發(fā)人群多處在育齡階段，因癥狀不明顯，對精子質(zhì)量的影響常被忽視。已有研究顯示，男性HUA患者精子質(zhì)量下降，但機制不明［7-8］，相關(guān)動物實驗研究少見。本研究采用氧嗪酸鉀誘導(dǎo)HUA小鼠模型，探討HUA對小鼠生精功能和精子質(zhì)量的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡無特定病原體（SPF）雄性昆明小鼠36只，體質(zhì)量18～22 g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2020-0018。小鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室，動物使用許可證號：SYXK（鄂）2017-0067。飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對濕度50%～70%，采用12 h/12 h晝夜間斷照明，動物自由進食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開展實驗。本研究經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：HUCMS202112002），并按實驗動物使用3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器 氧嗪酸鉀（YZLCP0016）購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；尿酸（UA）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、黃嘌呤氧化酶（XO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液、超敏增強型發(fā)光劑（ECL）顯影液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑、能與小鼠發(fā)生交叉反應(yīng)的兔源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗購自武漢塞維爾生物科技有限公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司；能與小鼠發(fā)生交叉反應(yīng)的兔源B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）多克隆抗體、兔源Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bax）單克隆抗體、兔源胱天蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。

KZ-III-F型高速低溫組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；CR21G型冷凍高速離心機（日本日立公司）；DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）；E100型顯微鏡、NikonDS-U3成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；WLJY-9000型彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（北京偉力科技公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組和造模 將氧嗪酸鉀溶于蒸餾水，置于液晶超聲波攪拌器充分?jǐn)嚢?，配? g/L氧嗪酸鉀懸液。36只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為6組，每組6只：氧嗪酸鉀1 d、7 d、14 d組依據(jù)文獻［9-10］，按照600 mg/（kg·d）腹腔注射氧嗪酸鉀懸液，對照1 d、7 d、14 d組腹腔注射等體積生理鹽水，每組注射天數(shù)依次為1 d、7 d、14 d。

1.3.2 血液及組織生化指標(biāo)檢測 采血前12 h禁食不禁水，末次腹腔注射氧嗪酸鉀1 h時，以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射，麻醉小鼠，腹主動脈采血1 mL。血樣在室溫下靜置1 h后，3 000 r/min，離心半徑13 cm，4 ℃，離心10 min，收集上清液，置于-20 ℃冰箱冷凍保存。按試劑盒操作說明測定小鼠血清UA、BUN、Cre水平，AST、ALT、XO活性。取100 mg睪丸組織，高速組織研磨儀勻漿后，10 000 r/min，離心半徑13 cm，離心10 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書，測定SOD、CAT活性及MDA含量。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 小鼠安樂死后，快速剝離肝、腎、睪丸，生理鹽水沖洗干凈，取部分肝、腎、睪丸室溫置于固定液中固定48 h，梯度乙醇脫水；二甲苯透明；浸蠟、包埋；切片、脫蠟，HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.3.4 生精功能評分 對1.3.2、1.3.3生化指標(biāo)及病理切片結(jié)果進行分析，篩選UA顯著升高且肝腎組織病變更輕微的組別，為本研究模擬臨床無明顯癥狀HUA的模型組，生理鹽水腹腔注射相同時間的小鼠為對照組。顯微鏡下對模型組及對照組睪丸HE染色切片進行評分。每個樣品選取10個曲細精管斷面，進行曲細精管內(nèi)徑（D）、管周膜厚度（M）、管壁生殖細胞層數(shù)（P）、生殖細胞成熟程度（S）評分。D＜25 μm、25 μm≤D＜50 μm、50 μm≤D＜75 μm、75 μm≤D＜100 μm、100 μm≤D＜130 μm、130 μm≤D＜160 μm分別計0～5分；M＞13 μm、10 μm≤M＜13 μm、7 μm≤M＜10 μm、5 μm≤M＜7 μm、3 μm≤M＜5 μm、M＜3 μm分別計0～5分；P為0層、1層、1～2層、2～3層、3～4層、大于4層分別計0～5分；S為僅有支持細胞、精原細胞、初級精母細胞、阻滯在次級精母細胞、阻滯在精子細胞階段、成熟精子分別計0～5分［11］。四項滿分合計20分，總分記為TMS，得分越高代表睪丸生精功能越好。

1.3.5 蛋白免疫印跡實驗 取模型組及對照組小鼠睪丸組織50 mg，加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑，高速組織研磨儀勻漿后置于冰上反應(yīng)30 min，10 000 r/min，離心半徑13 cm，離心15 min取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST洗膜3次。加入1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-2、Caspase-3一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，次日HRP標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，超敏ECL液顯影。采用Image J軟件分析出目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的灰度值，計算兩者比值，用于統(tǒng)計分析。

1.3.6 精子活力檢測 取模型組及對照組小鼠附睪尾，剪成小塊，置于37 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS）中，37 ℃孵育10 min，釋放精子，200目篩過濾，分離精子與組織殘片，按照全自動精子分析儀操作說明，進行精子密度和活動率分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧嗪酸鉀不同注射天數(shù)對小鼠血清生化指標(biāo)的影響 （1）腎功能。與各自對照組比較，氧嗪酸鉀1 d、7 d、14 d組血清UA均升高（P＜0.01），Cre差異無統(tǒng)計學(xué)意義；氧嗪酸鉀1 d組血清BUN差異無統(tǒng)計學(xué)意義，7 d、14 d組升高（P＜0.01），見表1。（2）肝功能。與各自對照組比較，氧嗪酸鉀1 d組血清AST含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，氧嗪酸鉀7 d、14 d組血清AST升高（P＜0.01）；氧嗪酸鉀1 d、7 d、14 d組血清ALT差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。（3）XO活性。與各自對照組比較，氧嗪酸鉀7 d組血清XO活性升高（P＜0.01），氧嗪酸鉀1 d、14 d組血清XO活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.2 氧嗪酸鉀不同注射天數(shù)對小鼠肝腎組織的影響 對照7 d、14 d組，肝細胞形態(tài)正常，排列規(guī)則，細胞核圓居中或有雙核，肝索清晰；氧嗪酸鉀7 d組，肝細胞疏松、輕微水腫，排列不規(guī)則，部分區(qū)域有淋巴細胞聚集；氧嗪酸鉀14 d組，肝細胞排列不規(guī)則，肝索模糊不清，多個區(qū)域有炎性細胞浸潤，見圖1。

對照7 d、14 d組，腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，腎小球大小均勻，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，邊界明顯，上皮細胞形態(tài)正常；氧嗪酸鉀7 d組，腎間質(zhì)有炎性細胞浸潤，腎小球未見明顯萎縮，腎小管結(jié)構(gòu)可見，上皮細胞輕微脫落；氧嗪酸鉀14 d組，腎間質(zhì)有明顯炎性細胞浸潤，腎小管結(jié)構(gòu)模糊，上皮細胞明顯脫落，見圖2。

2.3 篩選后模型組小鼠睪丸病理形態(tài)變化及生精功能評分 由2.1、2.2可見，氧嗪酸鉀1 d組尿酸一過性升高，氧嗪酸鉀14 d組肝、腎組織病變較重，易有尿酸性腎病等并發(fā)癥，因此篩選氧嗪酸鉀7 d組為模型組，相應(yīng)的對照7 d組為對照組。

對照組睪丸組織曲細精管分布密集、結(jié)構(gòu)清晰、呈規(guī)則橢圓形，生精上皮完整，各級生精細胞及精子排列有序，精原細胞規(guī)律地排列于基膜上，多數(shù)管腔內(nèi)有大量精子，支持細胞和間質(zhì)細胞均未見異常，未見多核巨細胞；模型組睪丸組織曲細精管分布密集度變低、管壁不光滑、皺縮變形，生精上皮變薄，生精細胞排列紊亂，管腔中精子數(shù)量明顯減少，見圖3。與對照組比較，模型組睪丸生精功能下降（P＜0.05），見表3。

2.4 2組小鼠精子密度和活動率變化 與對照組比較，模型組精子密度和活動率均下降（P＜0.01），見表4。

2.5 2組小鼠睪丸組織SOD、CAT活性及MDA含量變化 與對照組比較，模型組睪丸組織SOD和CAT活性均降低；MDA含量升高（P＜0.05），見圖4。

2.6 2組小鼠睪丸組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達量變化 與對照組比較，模型組睪丸組織Bax、Caspase-3表達量升高，Bcl-2表達量降低，Bax/Bcl-2比值上升（P＜0.05），見圖5。

3 討論

不孕不育家庭中男性因素占50％［12］。精子質(zhì)量是男性不育的主要原因，中國男性精子濃度總體呈下降趨勢，每年下降0.751 3×106/mL［13］?，F(xiàn)階段，機體代謝紊亂，如肥胖可通過影響性腺軸、陰囊溫度等降低男性精子質(zhì)量［14］。長期高血糖也會導(dǎo)致睪丸、附睪等生殖器官功能障礙［15］。HUA亦屬代謝紊亂范疇，且與肥胖等密切相關(guān)［16］，但HUA對男性生育能力的影響卻鮮見報道。因此，明確HUA與睪丸生精功能、精子質(zhì)量的關(guān)系及其相關(guān)機制具有重要意義。

HUA形成的關(guān)鍵因素之一是UA排泄失衡，氧嗪酸鉀化學(xué)結(jié)構(gòu)與UA的嘌呤環(huán)相似，與UA競爭結(jié)合尿酸酶，抑制尿酸酶活性［17］，減少尿酸排出，可誘導(dǎo)小鼠HUA。本實驗結(jié)果顯示，腹腔注射氧嗪酸鉀1 d后，血清UA顯著升高，連續(xù)注射7 d、14 d時血清UA、BUN、AST顯著升高；HE染色顯示連續(xù)注射7 d后肝、腎組織病變輕微，連續(xù)注射14 d后，肝、腎病理損傷明顯。臨床UA達到500 μmol/L時，便會對肝腎有影響，造成尿酸沉積，隨著UA水平增高和作用時間延長，細胞氧化應(yīng)激作用增強，當(dāng)尿酸積累到一定程度時，出現(xiàn)肝腎損傷［18-19］。腹腔注射氧嗪酸鉀1 d時，除UA含量升高，其他肝功能、腎功能指標(biāo)均正常，過量UA隨代謝排泄出體外，形成一過性升高，不符合臨床HUA患者尿酸持續(xù)超標(biāo)現(xiàn)狀。腹腔注射氧嗪酸鉀14 d時，肝、腎損傷嚴(yán)重，可導(dǎo)致其他嚴(yán)重并發(fā)癥，也不屬于臨床無明顯癥狀HUA范疇。因此，連續(xù)腹腔注射氧嗪酸鉀7 d是構(gòu)建符合本研究特征的穩(wěn)定HUA小鼠模型的方法。

有臨床報道顯示，當(dāng)空腹血清UA≥420 μmol/L時，男性精液量降低0.4 mL，精子總數(shù)減少6.67×107/L，血清UA水平與精液量、精子總數(shù)呈顯著負相關(guān)，隨著UA水平升高，精子質(zhì)量下降［7］；但缺乏動物實驗佐證且機制未明。本研究顯示，HUA模型小鼠睪丸生精功能、精子密度和活動率均顯著下降。從實驗角度證實，HUA降低睪丸生精功能及精子質(zhì)量，影響男性生殖。

血清UA過高可活化還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶依賴性途徑產(chǎn)生細胞內(nèi)氧化物，促進脂質(zhì)過氧化，激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，造成組織損傷［20］，初步推測HUA影響男性生殖的機制是UA沉積，增強氧化應(yīng)激反應(yīng)引起睪丸組織氧化損傷。細胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下會生成大量活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等，消耗SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化物質(zhì)的同時，產(chǎn)生有害的MDA及過量的H2O2，引發(fā)蛋白氧化、脂質(zhì)過氧化等損害細胞膜完整性的反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞凋亡［21］。同時，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，高水平ROS與精子數(shù)量、運動性、DNA完整性和受精率直接相關(guān)，抗氧化基因的遺傳差異也與氧化應(yīng)激，精子DNA損傷有關(guān)［22］。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠睪丸組織SOD和CAT活性均顯著降低，MDA含量則顯著升高，提示HUA小鼠睪丸組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；且睪丸組織Bax、Caspase-3表達量，Bax/Bcl-2比例均顯著升高，Bcl-2表達量顯著降低，標(biāo)志睪丸細胞凋亡增強。因此，HUA小鼠睪丸UA沉積會導(dǎo)致睪丸組織氧化損傷，誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，HUA小鼠睪丸生精功能、精子質(zhì)量下降，UA沉積導(dǎo)致睪丸氧化損傷，進而誘導(dǎo)細胞凋亡是其可能機制，本研究為深入探討HUA對男性生殖能力的影響奠定了實驗基礎(chǔ)。HUA對雄性小鼠生育力的影響及具體機制仍有待進一步研究。

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（2022-07-08收稿 2022-11-10修回）

（本文編輯 李國琪）