應(yīng)用宏基因組二代測(cè)序診斷的13例肺諾卡菌病患者的臨床特征分析

杜艷 馬愛平 王廣東 劉群 馬曉波 郭家希

諾卡菌病的發(fā)生并不常見,但在免疫功能健全和免疫抑制的患者中均可造成嚴(yán)重威脅生命的感染[1]。諾卡菌可引起局部到全身的播散感染,可累及肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng),皮膚和其他器官[2]。近些年來,諾卡菌感染的病例報(bào)道逐漸增加[3]。因肺諾卡菌病缺乏特異的臨床特征及快速準(zhǔn)確的診斷方法,常引起診治的延遲[4,5]。隨著檢驗(yàn)診斷技術(shù)的發(fā)展,宏基因組二代測(cè)序(metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS)作為常規(guī)臨床檢驗(yàn)外的補(bǔ)充應(yīng)用于感染性病原體的診斷,對(duì)于疑難復(fù)雜中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及免疫功能低下患者繼發(fā)感染具有重要的臨床價(jià)值[6,7]。現(xiàn)總結(jié)13例應(yīng)用mNGS診斷為肺諾卡菌病患者的臨床特征并探討mNGS在肺諾卡菌病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

收集2019年1月～2021年8月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院mNGS確診為肺諾卡菌病的13例患者的臨床資料。13例患者均具有肺諾卡菌病相關(guān)的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn),并且CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺肺活檢的組織或支氣管鏡下病變部位支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)、支氣管刷刷頭等標(biāo)本經(jīng)mNGS技術(shù)檢測(cè)證實(shí)為諾卡菌陽性患者。本次研究通過廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[(2022)科研倫審字(028)號(hào)]。

二、研究方法

1 臨床資料收集

收集13例患者的臨床資料,包括年齡、性別、吸煙史、基礎(chǔ)疾病史、臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥、胸部CT、治療及預(yù)后情況等。

2 病原學(xué)診斷方法

13例患者中11例行支氣管鏡檢查,其中10例進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,取支氣管肺泡灌洗液送檢;1例進(jìn)行支氣管刷刷檢,取支氣管刷刷頭送檢;另外2例行經(jīng)皮肺穿刺肺組織活檢,取肺組織送檢。所取標(biāo)本送至華大基因測(cè)序儀平臺(tái)(深圳華大基因股份有限公司)進(jìn)行檢測(cè),經(jīng) DNA 提取、文庫構(gòu)建和測(cè)序,測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量和長度小于 35 bp 的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過 BWA 軟件(http//bio-bwa.sourceforge.net/)比對(duì),將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對(duì)人參考基因組序列的數(shù)據(jù)與專用 4 個(gè)微生物大數(shù)據(jù)庫比對(duì),獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù),根據(jù)序列數(shù)的高低以及臨床其他檢測(cè)來判斷可能的病原體。13例患者送檢標(biāo)本均報(bào)告檢出諾卡菌。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,偏態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用中位數(shù)(數(shù)據(jù)范圍),計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)表示。

結(jié) 果

一、一般資料

本研究共13例肺諾卡菌病患者,男性5例(38.46%),女性8例(61.54%),男女比例為5 ∶8,年齡37～78歲,平均年齡(58±12)歲,體重指數(shù)(BMI)為(19.63±3.43)kg/m2,其中3例患者有長期吸煙史。13例患者中合并支氣管擴(kuò)張5例,陳舊性肺結(jié)核2例,肺癌1例,皮肌炎2例,多發(fā)性肌炎1例,ANCA相關(guān)性血管炎1例,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎1例,純紅細(xì)胞再生障礙性貧血1例,重癥肌無力、胸腺瘤1例,2型糖尿病1例,類固醇性糖尿病1例,高血壓1例。6例患者有激素或免疫抑制劑使用史。其中接受糖皮質(zhì)激素治療的有1例。該例患者為重癥肌無力、胸腺瘤患者,接受甲潑尼龍治療2年,入院時(shí)服用甲潑尼龍 12 mg qd。接受免疫抑制劑治療的有2例,1例為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者,1例為純紅細(xì)胞再生障礙性貧血患者,2位患者均不詳其具體用藥方案。同時(shí)接受激素和免疫抑制劑治療的有3例。1例皮肌炎患者接受甲潑尼龍、嗎替麥考酚酯、羥氯喹治療3月,入院時(shí)用藥:甲潑尼龍 32 mg qd、嗎替麥考酚酯 1g bid、羥氯喹 0.2g bid。1例多發(fā)性肌炎患者接受醋酸潑尼松、硫唑嘌呤治療1年,入院時(shí)用藥:醋酸潑尼松 25 mg qd、硫唑嘌呤 50 mg bid。1例ANCA相關(guān)性血管炎患者接受醋酸潑尼松片、托法替布、羥氯喹治療4年,入院時(shí)用藥:醋酸潑尼松 10 mg qd、托法替布 5 mg qd、羥氯喹 0.1 g tid。其中,無基礎(chǔ)疾病患者為1名中年女性,農(nóng)民,無吸煙及飲酒史,其BMI為26.01 kg/m2,為13例患者中BMI最大者(見表1)。

表1 患者的基本臨床資料

二、臨床癥狀和并發(fā)癥

13例患者中表現(xiàn)為發(fā)熱有7例,盜汗1例,咳嗽咳痰8例,干咳1例,咯血2例,胸悶3例,胸痛2例,呼吸困難7例, 頭痛頭暈1例,乏力2例。4例患者并發(fā)呼吸衰竭,5例并發(fā)肝功能異常,1例并發(fā)腎功能異常,8例并發(fā)電解質(zhì)紊亂,1例并發(fā)消化道出血(見表2)。

表2 患者的臨床表現(xiàn)和并發(fā)癥

三、病原學(xué)檢測(cè)

13例患者都進(jìn)行了mNGS檢測(cè)確診,送檢標(biāo)本主要為肺泡灌洗液,檢出的諾卡菌主要包括亞洲諾卡菌6例,蓋爾森基興諾卡菌3例,皮疽諾卡菌1例,萜烯諾卡菌1例,達(dá)松威爾擬諾卡菌1例,膿腫諾卡菌2例,南非諾卡菌1例,墨西哥諾卡菌1例(見表3)。

表3 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

四、影像學(xué)表現(xiàn)

13例患者行胸部CT檢查,9例表現(xiàn)為雙肺受累,4例患者單側(cè)肺葉受累,患者主要表現(xiàn)為斑片或結(jié)節(jié)狀高密度影,表現(xiàn)為斑片狀浸潤影3例,斑片狀合并結(jié)節(jié)影7例,單個(gè)結(jié)節(jié)腫塊影3例,空洞3例,實(shí)變、支氣管充氣征4例,支氣管擴(kuò)張5例,胸腔積液4例(大量胸腔積液2例,少量胸腔積液2例),胸膜增厚4例,縱隔淋巴結(jié)腫大5例,肺不張1例,間質(zhì)性改變3例(見表4,圖1)。

圖1 肺諾卡菌胸部CT常見影像 A:結(jié)節(jié)腫塊影;B:雙肺大片實(shí)變影,內(nèi)見支氣管充氣征;C:支氣管擴(kuò)張影;D:上肺空洞形成

表4 影像學(xué)表現(xiàn)

五、治療

13例患者均予以磺胺甲噁唑(SMZ)治療,3例患者單用SMZ治療,3例患者聯(lián)合亞胺培南,2例患者聯(lián)合哌拉西林鈉他唑巴坦鈉,1例患者聯(lián)合利奈唑胺,1例患者聯(lián)合頭孢噻肟鈉,1例患者聯(lián)合左氧氟沙星、利奈唑胺。2例患者發(fā)展為重癥肺炎。2例重癥肺炎患者均合并有皮肌炎及糖尿病。其中1例為初診快速進(jìn)展型皮肌炎,抗MDA5抗體陽性,入院時(shí)肺部CT示雙肺彌漫滲出性改變,考慮皮肌炎累及肺部導(dǎo)致間質(zhì)性肺疾病,行氣管插管及體外膜肺氧合,予以SMZ聯(lián)合亞胺培南、哌拉西林鈉他唑巴坦鈉、萬古霉素治療,該例患者病情進(jìn)展,家屬放棄治療,自動(dòng)出院后死亡。另1例診斷皮肌炎3月,接受甲潑尼龍、嗎替麥考酚酯及羥氯喹治療3月。3月前初診皮肌炎時(shí)完善肺部CT提示未合并間質(zhì)性肺疾病。行氣管插管,予以SMZ聯(lián)合莫西沙星、替加環(huán)素、利奈唑胺治療后好轉(zhuǎn)出院?；颊邚淖≡旱酵ㄟ^mNGS確診的中位時(shí)間為11天。13例患者中1例患者放棄治療后死亡,余12例患者病情好轉(zhuǎn)后出院。出院后隨訪1年,隨訪過程中3例患者失訪,3例患者肺部CT較前無明顯變化(均為支氣管擴(kuò)張患者),6例患者肺部CT提示病灶吸收,其中1例皮肌炎患者于隨訪過程中出現(xiàn)肺纖維化(見表5)。

討 論

諾卡菌屬于放線菌目,為革蘭陽性及弱抗酸染色陽性需氧菌。諾卡菌為機(jī)會(huì)性致病菌,主要通過呼吸道吸入或者破損皮膚接觸致病,常累及肺部、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚,易侵襲免疫缺陷患者,如淋巴瘤、惡性腫瘤、移植、長期接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療、艾滋病患者[2,8]。此外,糖尿病及酗酒也是感染諾卡菌的危險(xiǎn)因素[8]。免疫功能正常者也可感染諾卡菌。既往研究表明多達(dá)三分之一的諾卡菌患者免疫功能正常[9]。近年來發(fā)現(xiàn)慢性呼吸系統(tǒng)疾病如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、結(jié)構(gòu)性肺病等也是肺諾卡菌感染的危險(xiǎn)因素[10]。由于激素的使用,慢阻肺患者易感染肺諾卡菌[11]。然而本研究中13例肺諾卡菌病患者均未合并慢阻肺,而有5例患者合并支氣管擴(kuò)張,這與楊胡琴等人研究一致[12]。本研究有1例患者無基礎(chǔ)疾病。無基礎(chǔ)疾病患者為1名中年女性,農(nóng)民,無吸煙及飲酒史,其BMI為26.01 kg/m2,為13例患者中BMI最大者。諾卡菌為土壤腐生菌,該名無基礎(chǔ)疾病患者感染諾卡菌可能與其長期接觸土壤吸入諾卡菌相關(guān)。

肺諾卡菌病可急性、亞急性、慢性起病,以慢性多見。肺諾卡菌病臨床癥狀不典型,主要包括發(fā)熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀。肺部CT存在多種表現(xiàn),如斑片影、結(jié)節(jié)影、空洞、實(shí)變影、支氣管擴(kuò)張、胸腔積液等。本研究肺諾卡菌病臨床表現(xiàn)及肺部影像學(xué)表現(xiàn)與既往報(bào)道無明顯差異[13-15]。臨床上需鑒別肺諾卡菌病與其他病原菌導(dǎo)致的肺部感染、肺癌、肺結(jié)核、肺膿腫、肺真菌病等肺部疾病。本研究雖未發(fā)現(xiàn)肺外播散感染病例,但既往研究報(bào)道,在原發(fā)肺部諾卡菌感染發(fā)生播散時(shí),62% 播散到大腦,15% 播散到多個(gè)器官,12% 播散到鄰近淋巴結(jié)[16]。諾卡菌發(fā)病率雖低,但病死率較高,據(jù)報(bào)道肺部感染死亡率為41%,播散性感染死亡率為64%,顱內(nèi)感染死亡率高達(dá)60%～100%[17]。值得注意的是,本研究中2例肺諾卡菌病患者病情進(jìn)展為重癥肺炎。2例重癥肺炎患者均合并有皮肌炎及糖尿病。重癥諾卡菌肺炎可危及生命,早期可無明顯癥狀,但隨著病情進(jìn)展會(huì)出現(xiàn)呼吸衰竭、ARDS以及感染性休克,可伴不同程度的肝腎功能損害、血液系統(tǒng)異常以及多器官功能不全,需要進(jìn)行機(jī)械通氣、血液透析以及體外膜肺氧合等治療[18,19]。早期識(shí)別及有效治療有利于成功改善預(yù)后。

諾卡菌非人體定植菌。肺諾卡菌病的診斷主要依賴于標(biāo)本(包括痰涂片、BALF、肺組織活檢及膿液等)分離培養(yǎng)出諾卡菌[20]。目前檢測(cè)諾卡菌的方法有菌體形態(tài)觀察、常規(guī)培養(yǎng)菌落形態(tài)觀察、弱抗酸染色及改良的抗酸染色、可進(jìn)一步確認(rèn)的MALDI-TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜以及PCR檢測(cè)16S rRNA片段[21]。諾卡菌在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好,如血平板、沙堡弱平板,但諾卡菌菌落生長緩慢,常規(guī)培養(yǎng)可能會(huì)漏檢諾卡菌,因此單純依靠傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法,容易漏診、誤診以及延誤治療[22]。既往有研究報(bào)道肺諾卡菌病診斷的中位時(shí)間為25天[23]。mNGS通過提取臨床樣本庫中病原體和宿主的DNA和RNA數(shù)據(jù),直接與微生物數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比,以確定樣本中所含的病原微生物,對(duì)罕見致病菌診斷具有優(yōu)勢(shì)[24]。本研究使用mNGS的方法檢出諾卡菌,不僅縮短了診斷時(shí)間,也提高了非常規(guī)病原體的診斷率,使患者能夠得到及時(shí)的針對(duì)性治療,縮短患者住院時(shí)間。本研究患者從住院到通過mNGS確診的中位時(shí)間為11天,這與金文芳等人通過mNGS確診肺諾卡菌病的時(shí)間相近[15]。本研究僅2例患者通過傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法檢出諾卡菌,標(biāo)本分別為痰涂片及肺活檢組織涂片,可見傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法陽性率低。而13例患者均通過mNGS檢測(cè)出諾卡菌,其中亞洲諾卡菌檢出人數(shù)最多(46.16%)。本研究通過mNGS檢出病原體明確診斷后,經(jīng)過積極規(guī)范抗感染以及器官支持治療,大部分患者預(yù)后良好。除1例患者因放棄治療自動(dòng)出院后死亡,余12例患者病情好轉(zhuǎn)后出院,由此可進(jìn)一步推斷為肺諾卡菌病。不過,mNGS雖檢出率高,但由于取樣標(biāo)本不統(tǒng)一,背景菌復(fù)雜,得出的信息需要臨床醫(yī)生結(jié)合患者病情判斷是否為定植或致病菌。本研究為回顧性研究,13例患者標(biāo)本未能完全用常規(guī)培養(yǎng)法驗(yàn)證,在今后研究工作中將不斷完善。

確診肺諾卡菌病后首選用藥為磺胺類藥物。本研究中所有患者都接受了SMZ治療。然而有報(bào)道稱諾卡菌對(duì)磺胺類藥物逐漸耐藥。SMZ及甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(TMP-SMZ)耐藥率可分別達(dá)到61% 和42%[25]。然而一項(xiàng)針對(duì)諾卡菌磺胺類藥物耐藥性的研究表明在552株諾卡菌中,僅14株諾卡菌對(duì)磺胺類藥物耐藥,其中11株對(duì)SMZ耐藥,3株對(duì)TMP-SMZ耐藥[26]。各研究存在較大差異可能是由于不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)于藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果解讀的差異以及對(duì)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量把控的差異[27]。因此,臨床工作中仍不能忽視磺胺類藥物在治療肺諾卡菌病中的作用。此外,臨床上常推薦聯(lián)合用藥。常用聯(lián)合藥物為亞胺培南、利奈唑胺、阿米卡星、碳青霉烯類及頭孢菌素類。其中利奈唑胺對(duì)耐藥諾卡菌、諾卡菌播散感染、顱內(nèi)感染、重癥感染都有著較佳的療效,不過需警惕其骨髓抑制等副作用[12,27]。此外,抗諾卡菌藥物療程要足,尤其是免疫缺陷患者及合并顱內(nèi)感染患者。

總之,肺諾卡菌病由于發(fā)病率低,臨床表現(xiàn)缺乏特異性,影像學(xué)表現(xiàn)多種多樣,傳統(tǒng)病原學(xué)檢出率低,易漏診、誤診而延誤治療。在治療欠佳的社區(qū)獲得性肺炎患者以及重癥肺炎患者中,尤其是合并慢性呼吸系統(tǒng)疾病以及免疫功能缺陷時(shí),應(yīng)盡早地進(jìn)行mNGS檢測(cè),提高本病病原體的陽性診斷率,給予規(guī)范、足量、足療程的治療,降低本病的病死率。