電針對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF/Vav2/Rac1信號通路的影響

孫曉瑩，龍軼映，趙凌云，吳慶澤，瞿啟睿，祁 芳，劉 梨，艾 坤*，張 亮*

1 湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙410007；3 湖南中醫(yī)藥大學繼續(xù)教育學院，湖南 長沙410208

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，血管新生是滑膜組織病變的重要病理基礎(chǔ)，在RA 滑膜血管翳的形成與發(fā)展中有著關(guān)鍵作用。 最新研究表明，抑制血管新生可作為治療RA 的重要靶點[1]。 在血管新生過程中，內(nèi)皮細胞遷移是其重要環(huán)節(jié)，而偽足生成在細胞遷移中起關(guān)鍵作用[2-4]。 有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）可通過激活Ras 相關(guān)C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）誘導細胞前端片狀偽足形成來刺激內(nèi)皮細胞遷移[5]，這一激活過程與鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)密切相關(guān)。 與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate, GDP）結(jié)合的非活性狀態(tài)的Rac1-GDP 可被GEFs 激活轉(zhuǎn)換為與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate, GTP）結(jié)合的活性狀態(tài)的Rac1-GTP[6-7]。 鳥嘌呤核苷酸交換因子2（vav guanine nucleotide exchange factor 2, Vav2）是一種常見的GEFs，VEGF 可調(diào)控Vav2 促進Rac1-GDP轉(zhuǎn)化為Rac1-GTP，使Rac1 活化，促進偽足形成，從而刺激內(nèi)皮細胞遷移[8-10]。 因此，通過調(diào)控VEGF/Vav2/Rac1 信號通路，抑制滑膜內(nèi)皮細胞偽足生成，是抑制RA 血管新生的重要途徑之一。

本課題組前期研究表明，電針“關(guān)元”“足三里”“阿是穴”能明顯減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis, AA）模型大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹程度，降低相關(guān)細胞因子含量，從而減輕炎癥反應[11-12]。 另有研究證實，電針可以有效抑制滑膜內(nèi)血管生成，減輕RA滑膜炎癥，且與VEGF 相關(guān)[13-14]。 為了探索電針抑制RA 滑膜血管新生的內(nèi)在機制，本研究擬以AA 大鼠模型為觀察對象，采用電針干預，從調(diào)節(jié)VEGF/Vav2/Rac1 信號通路、抑制內(nèi)皮細胞偽足生成、抑制血管新生的角度，探討電針在RA 治療中對血管新生的作用機制，為電針治療RA 的臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

40 只SPF級SD 雄性大鼠均由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，體質(zhì)量（100±10） g，動物合格證號：430727211101621817，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0009。40 只大鼠以3 只一籠飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，飼養(yǎng)室溫度（23±3） ℃，相對濕度60%±10%。適應性飼養(yǎng)7 d后開始實驗，按隨機數(shù)字表法將其分成空白組、模型組、西藥組、電針組，每組10 只。 實驗全程遵從《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》（2006 年版）中動物倫理學有關(guān)條規(guī)，本實驗倫理編號：LLBH-202203140004。

1.2 主要試劑與儀器

滅活結(jié)核分枝桿菌（美國BD 公司，批號：231141）；礦物油（美國Sigma Aldrich 公司，批號：M8410）；甲氨蝶呤（美國AbMole Bioscience 公司，批號：M2228）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Scientific 公司，批號：QB214754）；VEGF 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號：65373）；Vav2 抗體、Rac1 抗體、β-actin 抗體、Rabbit 二抗（美國Proteintech Group 公司，批號：21924、24072、20536、SA00001-2）；顯影液（蘇州科達科技股份有限公司，批號：6610190）；ECL 發(fā)光液（美國Advansta 公司，批號：K-12045-D50）；4%多聚甲醛（廣州碩譜生物科技有限公司， 批號：BL539A）；DAB 顯色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：SW1020）。

電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司，型號：SDZ-II）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠，型號：SWCJ-1FD）；高速低溫離心機（美國SCILOGBX 公司，型號：D3024R）；電泳儀（美國BIO-RAD 公司，型號：041BR126545）；GloMax 酶標儀（美國Promega 公司，型號：GM3030）；磁力恒溫攪拌器（金壇市城西峰崢嶸實驗儀器廠，型號：HJ-4A）；足跖容積測量儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司，型號：YLS-7C）。

1.3 模型制備

本實驗采用完全弗氏佐劑注射尾根部皮下組織制作AA 大鼠模型[15-16]。 將定量的滅活結(jié)核分枝桿菌與礦物油在通風柜中混合研磨至溶液清透無雜質(zhì)，制成2.5 mg/mL 的完全弗氏佐劑；然后依次將模型組、西藥組、電針組大鼠用異氟烷呼吸麻醉，用0.1 mL的微量注射器于尾根部皮下緩慢注射佐劑（0.1 mL/只）。 觀察大鼠關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，進行模型評價，造模后第3 天出現(xiàn)尾根部紅腫，全身性關(guān)節(jié)繼發(fā)癥狀出現(xiàn)，造模后第9～12 天關(guān)節(jié)紅腫明顯加劇，其余關(guān)節(jié)也出現(xiàn)癥狀，大鼠食欲減退、體質(zhì)量減輕和皮溫變高，則判定為模型制備成功[15-17]。

1.4 干預方法

于造模第2 天開始干預，空白組、模型組大鼠以仰臥位固定于自制鼠板上20 min，不做其他處理。電針組大鼠仰臥位固定于鼠板上，75%乙醇消毒穴位局部皮膚，使用華佗牌針灸針（0.25 mm×25 mm）直刺“足三里”“關(guān)元”“阿是穴”，穴位參照“十三五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實驗針灸學》中的大鼠標準穴位圖譜進行定位[18]，針刺深度為3～4 mm，然后接電針（左側(cè)足三里與關(guān)元配穴，右側(cè)足三里與同側(cè)阿是穴配穴），選擇疏密波（20/50 Hz），電流強度通過觀察針柄處抖動情況來判讀，輕微抖動即可，留針20 min。均每天1 次，7 次為1 個療程，共干預3 個療程。西藥組使用陽性對照藥物甲氨蝶呤，按每只0.35 mg/kg灌胃給藥[19]，每周1 次，共干預3次。

1.5 取材

于干預后禁食24 h，隔天在無菌操作臺上用刀片撥開大鼠膝關(guān)節(jié)囊，取出清透淡黃色的滑膜組織，放入做好標記的凍存管中，分別于液氮中或裝有4%多聚甲醛的試劑管中保存。

1.6 指標檢測

1.6.1 一般情況觀察 于實驗過程中，觀察造模后第1、9、12、15、18、21 天大鼠的飲食、毛發(fā)、體質(zhì)量、關(guān)節(jié)腫脹等一般情況的變化。

1.6.2 足跖容積測量 測量前，用防水不掉色黑色記號筆在大鼠后足踝關(guān)節(jié)處標好測量標線，為減少人為誤差，每次測量標線以及測足腫均由專人完成，并且每次標線的位置不宜有較大偏差，應在第1 次測量時使用墨水針頭紋好一點作為標線固點。 將足腫測量儀放置水平固定的臺面上進行校零，量杯中裝適量蒸餾水，測量時測量者先將大鼠一側(cè)后足抻直，放進裝有適量蒸餾水的量杯中，直到后足的標線與量杯中的液面平行，重復3 次，再換下一側(cè)后足，記錄讀數(shù)，后取其平均值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。在造模后第1、9、12、15、18、21 天進行足跖容積的測量。

1.6.3 HE 染色 備取使用4%多聚甲醛固定好的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，標定組號，流水清洗2 h，然后取出滑膜組織進行脫水，于56 ℃的石蠟浸泡進行包埋，包埋成塊后，把石蠟置于切片機中，切分成5 μm 的石蠟片，石蠟片放入水浴鍋后展開貼在載玻片上，60 ℃烘箱烘干2 h。脫蠟后放入蘇木素溶液中染色5 min，接著使用蒸餾水沖洗，浸透于1%氨水中返藍，清水沖洗30～60 s 后，于顯微鏡下觀察細胞核的分色程度，之后置于1%伊紅中染色，蒸餾水沖洗后脫水，最后每個組織滴加一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片。每個片子分別拍100×視野。

1.6.4 免疫組織化學檢測 備取用4%多聚甲醛固定好的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，每組抽取5 只大鼠并標定組號，流水清洗2 h，然后取出滑膜組織，依次浸透于不同濃度的乙醇、二甲苯中進行脫水，然后于56 ℃的石蠟浸泡進行包埋，包埋成塊后，把石蠟置于切片機中，切分成5 μm 的石蠟片，石蠟片放入水浴鍋后展開貼在載玻片上，60 ℃烘箱烘干2 h。 脫蠟后放置高壓噴氣中抗原修復，噴水致冷后將石蠟片放入10%羊血清中，室溫封閉1 h，去除封閉液后，滴加抗體，37 ℃孵育1 h 后，PBS 清洗4 次，每次5 min。 接著加相對應的二抗孵育，孵育后PBS 搖洗5 min，10 次。 之后配備DAB顯色液，即配即用，顯微鏡觀察顯色，然后復染、脫水。每個切片上滴注些許中性樹膠后蓋上蓋玻片。 每個片子分別拍400×視野；采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測量平均光密度值，為便于計算，將空白組平均數(shù)賦值為1，進行數(shù)據(jù)歸一化處理，最終采用SPSS 26.0 分析結(jié)果。

1.6.5 Western blot 檢測 每組另5 只大鼠各取100 mg 膝關(guān)節(jié)滑膜組織樣本，隨后加定量混有蛋白酶、磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，攪勻混合溶液，使用勻漿機勻漿4 min，再將得到的樣品裂解30 min，裂解全程均在冰上操作，裂解完全后以4 ℃、半徑8 cm、12 000 r/min 離心20 min，利用BCA 蛋白質(zhì)定量法測定離心得到的上清液蛋白濃度，得到蛋白質(zhì)樣品液。取蛋白質(zhì)樣品液30 μg，加上一定蛋白上樣緩沖液，放入恒溫槽中沸水浴10 min，再以半徑8 cm、10 000 r/min 離心10 min；隨之計算蛋白分子量，選擇制備10%或12%的分離膠、濃縮膠，將之電泳，接著進行電轉(zhuǎn)， 將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 蛋白印跡膜；下一步進行封閉，將PVDF 膜全部浸泡于封閉液中，室溫25 ℃孵育1 h，然后搖洗3 次，每次10 min；而后分別加入一抗（VEGF 稀釋度1∶1 000；Vav2 稀釋度1∶500；Rac1 稀釋度1∶800），放入4 ℃冰箱過夜，隔天用PBST 洗膜，每次20 min，搖洗3 次后，使用移液槍吹打入相對應的二抗溶液（稀釋度1∶1 000），室溫25 ℃孵育1 h；再用PBST 搖洗3 次，每次10 min，滴加顯影液，反應2 min 后進行曝光顯影，得到條帶采用Image J 軟件行灰度分析，數(shù)據(jù)根據(jù)相對應的內(nèi)參對比，為便于計算與直觀，將空白組平均數(shù)賦值為1，進行數(shù)據(jù)歸一化處理，最終采用SPSS 26.0 分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8.0.2軟件制作圖表。 全部數(shù)據(jù)用“±s”表示，符合正態(tài)分布和方差齊性，使用單因素方差分析法，進一步兩兩比較用LSD 檢驗；方差不齊則采用Tamhane's T2 多重檢驗。 不滿足正態(tài)性則采用非參數(shù)檢驗。 均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

模型組大鼠活動及飲食減少，于造模后第3～5天尾根部出現(xiàn)脫皮、紅腫，甚至出現(xiàn)潰爛，第9～12天后足、關(guān)節(jié)、耳朵、眼角陸續(xù)出現(xiàn)肉眼可見的紅腫，第15～18 天癥狀達到高峰期。 各組大鼠第1 天體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。相較于空白組，模型組大鼠于造模后第9、12、15、18、21 天體質(zhì)量降低（P＜0.05，P＜0.01）；西藥組體質(zhì)量于造模后第9、12、15 天差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），于第18、21 天降低（P＜0.01）；電針組體質(zhì)量于造模后第9、15天差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），第12、18、21 天均降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，西藥組體質(zhì)量在造模后第9、21 天差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在第12、15、18 天均升高（P＜0.01）；電針組體質(zhì)量在造模后第1、9 天差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在第12、15、18、21 天均升高（P＜0.01，P＜0.05）。 與西藥組相比，電針組體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖1。

2.2 各組大鼠足跖容積比較

各組大鼠在造模后第1、9 天足跖容積比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。相較于空白組，模型組大鼠于造模后第12、15、18、21 天足跖容積增大（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)合一般情況，提示模型制備成功；西藥組足跖容積于造模后第12、15、18 天差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），于第21 天增大（P＜0.05）；電針組足跖容積于造模后第12、18 天差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），第15、21 天均增大（P＜0.05）。 與模型組相比，其余3 組足跖容積于造模后第12 天差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），西藥組足跖容積在造模后第15、18、21 天均減?。≒＜0.05，P＜0.01），電針組在第21 天明顯減?。≒＜0.01）。 與西藥組相比，電針組足跖容積差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠造模前后各時點足跖容積比較（±s，n=10）

2.3 各組大鼠組織形態(tài)學結(jié)果比較

空白組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)襯層細胞排列規(guī)則（圖3 箭頭①），未見炎細胞浸潤；與空白組相比，模型組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)異常，滑膜組織出現(xiàn)一定增生，可見大面積膠原纖維組織增生（圖3 箭頭②），諸多炎細胞浸潤（圖3 箭頭③），大量血管增生（圖3 箭頭④）；與模型組相比，電針組和西藥組滑膜結(jié)構(gòu)較好，細胞密度明顯降低，滑膜組織增生一定程度緩解，出現(xiàn)較小面積的膠原纖維組織增生，炎細胞浸潤較模型組大鼠少，偶見血管生成。

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學結(jié)果（HE，×100）

2.4 各組大鼠滑膜組織中CD31 蛋白表達的比較

空白組大鼠滑膜組織見少量CD31 蛋白表達。與空白組相比，模型組CD31 表達明顯增加（P＜0.05），表明血管生成增加；與模型組相比，西藥組和電針組CD31 表達有一定減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖4—5。

圖4 各組大鼠滑膜組織CD31 表達水平（免疫組織化學，×400）

圖5 各組大鼠滑膜組織CD31 表達水平比較（±s，n=5）

2.5 各組大鼠滑膜組織中VEGF、Rac1、Vav2 的蛋白表達比較

與空白組相比，模型組大鼠滑膜組織中VEGF、Rac1、Vav2 蛋白表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，西藥組、電針組中VEGF、Vav2、Rac1 蛋白表達量下降（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見圖6。

圖6 各組大鼠滑膜組織VEGF、Vav2、Rac1 蛋白表達水平比較（±s，n=5）

3 討論

RA 是最常見的自身免疫性關(guān)節(jié)炎癥疾病，其臨床最大危害在于關(guān)節(jié)軟骨與骨的破壞，影響正常關(guān)節(jié)活動，導致活動受限。 RA 基本病理是關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜炎癥及血管翳形成[20-21]。 血管翳主要由滑膜炎癥、滑膜增生以及血管新生等共同構(gòu)成。 血管新生是RA 早期促進滑膜增生和炎癥發(fā)展的核心病理特征，是RA 關(guān)節(jié)侵蝕破壞最主要的原因[1,22]。 因此，血管新生在RA 的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用， 已成為當前RA 研究的熱點和治療靶點之一[3,23]。 RA 在中醫(yī)學中屬于“痹病”范疇。 《素問·痹論》曰“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，指出感受外邪是痹病發(fā)病的外因；《金匱要略·中風歷節(jié)病脈證并治第五》曰“寸口脈沉弱……故曰歷節(jié)”，指出正氣虛弱是痹病發(fā)病的內(nèi)因[24]?！罢龤獠蛔悖瑥透型庑啊?，內(nèi)外相合發(fā)病，虛實夾雜、本虛標實為其病機特點[25-26]。 臨床上，多遵循扶正祛邪、活血化瘀的治療原則[27-28]。 針刺是治療RA 常用的中醫(yī)技法之一，有扶正祛邪、通脈止痛的作用[29]。 根據(jù)RA 的治療原則，本實驗選取足三里、關(guān)元和阿是穴，足三里為胃經(jīng)之合穴，關(guān)元為先天之氣海，兩者均有補益氣血、扶正培元的功效，阿是穴具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效。

與空白組比較，本實驗AA 模型大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹明顯，足跖容積明顯增大（P＜0.01），電針干預后足跖容積減少（P＜0.01），與既往研究結(jié)果一致[7-8]。組織形態(tài)學顯示，模型組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)排列異常，大量炎細胞浸潤，血管生成增多，電針干預后滑膜組織結(jié)構(gòu)較好，炎細胞浸潤、血管生成明顯減少。CD31是公認的血管特異性標志物[30]，免疫組織化學結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組關(guān)節(jié)滑膜組織中CD31表達明顯增加（P＜0.05），電針干預后CD31 表達差異雖無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但有明顯下降趨勢，提示電針干預后RA 滑膜血管數(shù)量減少。因此，初步證實電針治療RA 可能與抑制滑膜血管新生有關(guān)。 另外，Western blot 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、Vav2 和Rac1 表達均明顯增多（P＜0.01），電針干預后VEGF、Rac1、Vav2 蛋白表達量均下降（P＜0.05，P＜0.01），這提示VEGF/Vav2/Rac1 信號通路可能在這一過程中發(fā)揮了重要作用。

RA 血管新生是一項極為復雜的過程，內(nèi)皮細胞遷移是其中的重要環(huán)節(jié)之一，而偽足生成在細胞遷移中占據(jù)了重要位置[31-32]。VEGF 及其信號通路參與血管新生全部過程，有著無可替代的作用[33]。研究表明，電針調(diào)節(jié)血管新生可能與調(diào)控VEGF表達有關(guān)[34-35]。 已有研究證實，VEGF 通過誘導其下游Vav2激活Rac1 引起內(nèi)皮細胞遷移[6]。Rac1 作為小蛋白酶家族的一員，在細胞遷移過程中發(fā)揮了重要作用，參與細胞前端片狀偽足的形成并向前伸出[36]。 Rac1 作為分子開關(guān)被Vav2 激活，從不活躍的GDP結(jié)合態(tài)循環(huán)到活躍的GTP 結(jié)合態(tài)，活性狀態(tài)下的Rac1通過信號通路作用于肌動蛋白結(jié)合蛋白，使得肌動蛋白細胞骨架發(fā)生聚合的重構(gòu)變化，最終使得細胞前端片狀偽足生成，誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生遷移[37-40]。

本實驗以VEGF 及其下游Vav2/Rac1 信號通路為切入點展開研究，結(jié)合組織形態(tài)學結(jié)果及血管內(nèi)皮細胞標記物CD31 結(jié)果，模型組大鼠滑膜組織中CD31 較空白組表達升高（P＜0.05），VEGF 含量明顯升高（P＜0.01），說明模型大鼠血管新生增多，且與VEGF 表達增多密切相關(guān)。 電針干預后CD31 表達差異雖無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但有明顯降低趨勢，提示血管新生較少，同時VEGF 表達明顯降低，這表明VEGF 可能是電針發(fā)揮抑制血管新生的關(guān)鍵信號途徑。 同時，本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠滑膜組織中Vav2、Rac1 蛋白表達量較空白組大鼠均明顯增多（P＜0.01），電針干預后Vav2、Rac1 蛋白表達量明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），提示電針可能通過抑制VEGF的表達，從而抑制Vav2、Rac1 活性和血管新生，減少血管翳浸潤，減輕關(guān)節(jié)腫脹。 因此，VEGF/Vav2/Rac1 信號通路可能介導了電針抑制AA 模型大鼠滑膜血管新生這一作用。

綜上所述，電針治療RA 的效應機制可能是通過抑制VEGF/Vav2/Rac1 信號通路，抑制內(nèi)皮細胞偽足生成及其遷移，從而抑制RA 血管新生，改善關(guān)節(jié)癥狀，為電針抑制RA 血管新生提供了一定證據(jù)支持。為了進一步確定VEGF/Vav2/Rac1 信號通路在電針抑制RA 血管新生中的作用機制，后續(xù)將通過設(shè)置其信號通路關(guān)鍵蛋白的阻斷劑或激動劑展開研究，同時補充內(nèi)皮細胞偽足生成直接證據(jù)的檢測。