補腎活血方對內(nèi)源性“筋傷”腰椎失穩(wěn)兔模型的影響

蔡楚豪，展嘉文，韓 濤，謝 瑞，張偉業(yè)，王戈文，朱立國*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100015；2.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100015；3.北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京 101300

退行性腰椎失穩(wěn)（degenerative lumbar spinal instability, DLSI）是導(dǎo)致下腰痛（low back pain, LBP）的常見疾病，患者以反復(fù)發(fā)作的腰痛，時常伴有局部酸脹無力，伴或不伴下肢放射痛為主要臨床癥狀。該病病程遷延難愈，對患者身心健康及生活質(zhì)量造成負(fù)面影響，是導(dǎo)致中老年人活動障礙的常見原因[1-3]。據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究結(jié)果顯示[4]，在所調(diào)查的204個國家范圍內(nèi)，369 種疾病中，LBP 是導(dǎo)致全球負(fù)擔(dān)升高的10 個關(guān)鍵病種之一，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。有研究表明，80%的成年人曾受到腰痛的困擾[5]。 流行病學(xué)調(diào)查顯示，30%的腰痛與腰椎失穩(wěn)相關(guān)[6-7]。隨著我國人口逐漸老齡化，DLSI 將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。

近年來，國內(nèi)外對于DLSI 的研究投入逐漸增加，在該病影像學(xué)、病理學(xué)、生物力學(xué)、診斷學(xué)及治療學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)研究正在逐步深入開展[8-13]?，F(xiàn)代研究普遍認(rèn)為，人體脊柱穩(wěn)定性由兩大部分組成：一是內(nèi)源性穩(wěn)定，包括椎體、附件、椎間盤、韌帶，維持靜力平衡；二是外源性穩(wěn)定，主要由肌肉調(diào)節(jié)和控制，是脊柱活動的原動力，維持著脊柱的動力平衡[14]?！端貑枴ゐ粽摗分赋觯骸白诮钪魇嵌P(guān)節(jié)也?！薄敖睢钡睦碚擉w系對中醫(yī)骨傷科發(fā)展有著重要意義，相關(guān)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對人體脊柱穩(wěn)定系統(tǒng)的認(rèn)識相類似。 “筋，肉之力也”“諸筋者皆屬于節(jié)”，筋的主要功能為連屬關(guān)節(jié)，絡(luò)綴形體，主司關(guān)節(jié)運動。由此可見，脊柱相關(guān)結(jié)構(gòu)中的關(guān)節(jié)突、關(guān)節(jié)囊、韌帶以及肌肉均發(fā)揮著“筋”的作用，維持著脊柱的穩(wěn)定與運動。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝藏血，主疏泄，在體合筋。 腎藏精，肝腎同源，精血同源，“筋”發(fā)揮正常功能賴于精血的濡養(yǎng)，而肝以血為體，以氣為用，氣帥血行，使血脈通利，不滯不瘀，才能濡養(yǎng)筋骨肌肉。本研究團(tuán)隊前期以腎虛血瘀立法，根據(jù)古方青娥丸加減形成的補腎活血方，在臨床中治療腰痛類疾病取得了較好療效[15]，并且通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討了補腎活血中藥治療DLSI 的作用機制[16]。因此，本實驗探究補腎活血方對內(nèi)源性“筋傷”腰椎失穩(wěn)的影響，以期為該病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

體質(zhì)量為2.5～3.0 kg，4～6 月齡，健康新西蘭兔33 只，雌雄混合，單獨飼養(yǎng)于北京市昌揚西山養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK（京）2021-0008。 自由飲食水及飼料，環(huán)境溫度為20～25 ℃。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

補腎活血方藥物組成：杜仲15 g，補骨脂10 g，懷牛膝10 g，丹參12 g，威靈仙10 g，木瓜9 g。 按照補腎活血方原方用量制備藥液（由中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥房提供）。

伊紅（批號：MD23021607）、蘇木素染液（批號：MD23021607）、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：MD23032511）均購自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

石蠟切片機（型號：RM2235）、加熱石蠟包埋系統(tǒng)（型號：G1150 H）均購自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 分組與造模

取22 只健康新西蘭兔，根據(jù)施杞等[17]與張鵬等[1]報道的實驗方法，進(jìn)行韌帶損傷型“筋傷”腰椎失穩(wěn)動物模型手術(shù)，暴露出L2～L6 棘突和腰背最長肌，用刀柄沿椎板向兩邊將肌肉分開，暴露出L2～L6 椎板，用小組織剪或手術(shù)刀切除L2～L6 棘上韌帶、棘間韌帶，切除關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的部分關(guān)節(jié)囊，造模動物出現(xiàn)椎體水平位移的數(shù)值增大、椎間高度指數(shù)（disc height index, DHI）減小，提示造模成功[11]。 造模后的新西蘭兔按照隨機數(shù)字表法分為模型組、補腎活血方組，每組11 只。另取11 只健康新西蘭兔行造模手術(shù)相同的皮膚切口后立即縫合，為假手術(shù)組。術(shù)后對實驗兔按每千克體質(zhì)量20 U 給予青霉素，每日肌內(nèi)注射1 次，連續(xù)注射5 d。

1.4 給藥方案

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)動物劑量折算表計算（相當(dāng)于臨床等效劑量）：動物每日用藥量=成人每日用藥量/正常成人體質(zhì)量×換算常數(shù)×校正系數(shù)[18]，參照課題組前期實驗給藥方案，補腎活血方組新西蘭兔按生藥3.597 g·kg-1·d-1灌胃[19]，每日給藥1 次，自造模后連續(xù)給藥8 周。 模型組與假手術(shù)組按同法灌服等體積的生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 影像學(xué)指標(biāo) 分別于術(shù)前、術(shù)后4 周、術(shù)后8周每組取4 只實驗兔，進(jìn)行影像學(xué)X 線攝片。 用實驗兔固定裝置固定實驗兔頭部，拍攝腰椎正、側(cè)位X線片，進(jìn)行椎體水平位移及DHI 測量。

（1）椎體水平位移測量

在側(cè)位X 線片上，應(yīng)用Mimics 醫(yī)學(xué)影像控制系統(tǒng)，測繪L1～L7 椎體水平位移，即上位椎體后下角至下位椎體后緣連線的垂直距離（如圖1A、B）。

圖1 腰椎影像學(xué)指標(biāo)測量示意圖

（2）DHI 測量

根據(jù)AKEDA 等[20]提出的DHI 計算公式，DHI=（椎體間前側(cè)高度+椎體間后側(cè)高度）/（上位椎體下緣寬度+下位椎體上緣寬度），如圖1C 所示。 在實驗兔X 側(cè)位片上，應(yīng)用Mimics 醫(yī)學(xué)影像控制系統(tǒng)進(jìn)行L1/2～L7/S1 椎間盤相關(guān)數(shù)據(jù)參數(shù)測量，并計算DHI，作為反應(yīng)具體椎間隙高度的指標(biāo)（圖1D）。

1.5.2 病理學(xué)檢測

（1）HE 染色

于第4、第8 周隨機取各組實驗兔3 只，空氣栓塞處死后，取出腰段脊柱，切割、修整后得到完整椎間盤組織，進(jìn)行HE 染色。固定椎間盤組織，脫鈣，乙醇濃度階梯依次脫水，使用二甲苯溶液進(jìn)行透明。將浸蠟后的組織包埋于石蠟中，切片、鋪片。貼片、烘片，脫蠟。 蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)。 脫水封片，顯微鏡觀察，最后進(jìn)行圖像采集分析。

（2）TUNEL 染色

于第4、第8 周隨機取各組實驗兔3 只，空氣栓塞處死后，取出腰段脊柱，切割、修整后得到完整椎間盤組織，進(jìn)行TUNEL 染色。脫蠟，蒸餾水洗脫。于37 ℃蛋白酶K 中孵育，洗滌蛋白酶K。 加入TUNEL反應(yīng)液，37 ℃避光孵育，洗滌反應(yīng)液。用抗熒光淬滅封片液封片后，于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組椎體水平位移比較

與假手術(shù)組比較，模型組、補腎活血方組第4、第8 周椎體水平位移明顯增大（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血方組第8 周椎體水平位移明顯減?。≒＜0.05）。 詳見表1。

表1 各組椎體水平位移比較（±s，n=4，×10-2 mm）

表1 各組椎體水平位移比較（±s，n=4，×10-2 mm）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組補腎活血方組術(shù)前42.44±14.30 39.66±12.53 39.30±15.32第4 周41.28±16.23 63.42±17.11*63.52±22.43*第8 周46.01±18.45 102.26±31.72*81.50±23.81*#

2.2 各組DHI 比較

與假手術(shù)組比較，模型組第4、第8 周DHI 明顯減?。≒＜0.05）；與模型組比較，補腎活血方組第8 周DHI 明顯增大（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組DHI 比較（±s，n=4，%）

表2 各組DHI 比較（±s，n=4，%）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組補腎活血方組第0 周36.18±3.25 35.87±2.86 35.95±3.58第4 周36.12±6.27 33.03±3.63*35.21±3.54第8 周34.12±3.84 29.66±3.02*32.83±3.84#

2.3 各組椎間盤組織細(xì)胞凋亡率比較

與假手術(shù)組比較，第4、第8 周模型組、補腎活血方組椎間盤組織細(xì)胞凋亡率明顯增大（P＜0.05）；與模型組比較，第4、第8 周補腎活血方組椎間盤組織細(xì)胞凋亡率明顯減小（P＜0.05）。 詳見表3、圖2。

表3 各組椎間盤組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3，%）

表3 各組椎間盤組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3，%）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組補腎活血方組第0 周36.58±7.55 36.58±7.55 36.58±7.55第4 周31.26±0.16 55.98±1.32*47.8±3.19*#第8 周40.33±6.25 63.24±1.53*52.1±2.12*#

圖2 第0、第4、第8 周時各組椎間盤組織TUNEL 染色圖片（×400）

2.4 各組HE 染色結(jié)果

第4 周時，假手術(shù)組椎間盤相對完整，形態(tài)正常，纖維環(huán)排列規(guī)整，髓核含豐富的軟骨細(xì)胞，基質(zhì)中可見大液泡；模型組可見纖維環(huán)排列紊亂；補腎活血方組較模型組纖維環(huán)排列更規(guī)整。第8 周時，隨著自然退變，假手術(shù)組椎間盤組織切片標(biāo)本可見纖維環(huán)排列存在一定程度的紊亂；模型組椎間盤纖維環(huán)退變較其他兩組更明顯，纖維環(huán)排列紊亂且存在縫隙，髓核皺縮，基質(zhì)較少；補腎活血方組與模型組比較，纖維環(huán)裂隙較少，與髓核交界區(qū)更清楚，髓核基質(zhì)更多。 詳見圖3。

圖3 第4、第8 周時各組實驗兔椎間盤HE 染色圖（×100）

2.5 各組腰椎側(cè)位片觀察

觀察對比各組第4 周拍攝的X 線片，未見明顯差異。 對比第8 周X 線側(cè)位片，與假手術(shù)組相比，補腎活血方組、模型組均有明顯的骨質(zhì)增生，可見一定的椎體滑移表現(xiàn)，模型組可見椎間隙變窄。 詳見圖4。

圖4 第4、第8 周時各組實驗兔腰椎側(cè)位X 線片

3 討論

DLSI 的主要臨床癥狀為腰痛或下肢疼痛，屬于中醫(yī)學(xué)“腰痛”“腰痹”等范疇。隨著年齡增加，肝腎虧虛，或長期勞傷，或外邪侵襲等，出現(xiàn)局部氣血瘀滯，筋骨失衡，從而產(chǎn)生疼痛與失穩(wěn)。其中腎虛為關(guān)鍵病機。中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院朱立國教授根據(jù)《太平惠民和劑局方》中的青娥丸，結(jié)合自身臨床經(jīng)驗加減化裁，形成補腎活血方，全方補腎助陽、強筋健骨、活血通絡(luò)，標(biāo)本兼治，用于治療臨床腎虛血瘀型腰痛。方中鹽杜仲為君藥，其性溫，助陽補虛，主入肝腎二經(jīng)，可補肝腎、強筋骨。 臣藥為補骨脂與牛膝，一方面輔杜仲補腎溫陽，補骨脂辛熱香燥，苦甘并存，能補能澀，強腰固精，能治風(fēng)冷侵襲之腰膝冷痛；另一方面，助君藥發(fā)揮補肝腎、強筋骨之功效，且牛膝歸肝腎二經(jīng)，可治腰膝酸痛、筋骨無力，亦可活血化瘀、通經(jīng)止痛。 佐使藥丹參、威靈仙、木瓜，丹參可佐助牛膝活血化瘀，其性微寒，避免全方一味溫補；威靈仙辛散溫通，性猛善走，通行十二經(jīng)脈，通絡(luò)止痛，驅(qū)散風(fēng)濕外邪；木瓜舒筋活絡(luò)，驅(qū)散風(fēng)濕外邪。

目前普遍認(rèn)為，椎間盤的變性與腰椎不穩(wěn)直接相關(guān)，椎間盤變性是腰椎不穩(wěn)的誘發(fā)因素[21]。本研究結(jié)果顯示，補腎活血方組椎間盤組織細(xì)胞凋亡率在第4、第8 周均低于模型組。 椎間盤內(nèi)大量的細(xì)胞凋亡可使椎間盤內(nèi)環(huán)境的平衡被破壞，加速椎間盤退變的進(jìn)程[22]。在第8 周時，補腎活血方組椎體水平位移較模型組更小，DHI 較模型組更高。椎間盤退變是導(dǎo)致腰椎失穩(wěn)的重要病理因素[23]，一定程度的椎間盤高度下降使椎間關(guān)節(jié)以及韌帶松弛，失去維持穩(wěn)定的必要張力，會導(dǎo)致椎體滑移和動力不穩(wěn)[21]。綜合實驗結(jié)果，認(rèn)為補腎活血方干預(yù)可延緩內(nèi)源性“筋傷”腰椎失穩(wěn)新西蘭兔模型的退變失穩(wěn)進(jìn)展。

本研究在模型的建立上存在不足，兔作為四足行走的哺乳動物，脊柱節(jié)段在數(shù)量和結(jié)構(gòu)方面與人體有著一定差異，人類脊柱相關(guān)的腰痛癥狀的發(fā)生，與直立行走活動時，腰椎受到的應(yīng)力刺激有關(guān)。 有研究[24]設(shè)計了無創(chuàng)性脊柱軸向加壓的方法來建立實驗兔椎間盤退變模型，在今后腰椎失穩(wěn)相關(guān)的實驗研究中，建立動物模型時可與之合理結(jié)合，加以創(chuàng)新，使模型更接近人類腰椎退變情況。本實驗研究主要采用破壞韌帶等組織結(jié)構(gòu)，即破壞靜力平衡的方式，造成實驗兔腰椎失穩(wěn)的模型。 今后可行進(jìn)一步實驗，增設(shè)破壞脊柱動力平衡的分組，對比觀察補腎活血方對其的影響。