植物提取物對4 株水稻病原菌的抑菌活性篩選

趙鵬, 楊態(tài)嬌, 張東華, 張學良, 黃朝政, 伍建榕,2, 劉麗, 閆曉慧*

(1.云南省高校森林災害預警控制重點實驗室 西南林業(yè)大學 生物多樣性保護學院, 云南 昆明 650224;2.國家林業(yè)和草原局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室 西南林業(yè)大學 林學院, 云南 昆明 650224)

中國約70%的人以稻米為主食, 水稻的種植面積占全國糧食作物種植面積的1/3 左右, 稻米產(chǎn)量約占糧食總產(chǎn)量的一半[1]。稻米品質(zhì)優(yōu)劣的影響因素很多, 其中惡苗病、稻瘟病、褐變穗病、稻曲病等真菌病害是影響稻米品質(zhì)較為關(guān)鍵的病害,不僅造成產(chǎn)量損失, 稻米品質(zhì)也會因此降低。目前采取的防治措施主要有選育抗病種質(zhì)資源、化學防治及生物防治。但抗病種質(zhì)資源面臨著抗原不足、抗性喪失等問題, 農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、抗藥性等化學防治問題也頻頻出現(xiàn)[2]。水稻的產(chǎn)量及品質(zhì)關(guān)乎我國民生、民計及國家戰(zhàn)略, 而且隨著時代的進步與發(fā)展, 人們對于稻米的要求也越來越高。因此, 尋求新型環(huán)保的生物農(nóng)藥, 生產(chǎn)綠色健康的稻米, 是目前亟需解決的問題[3], 為保證稻米質(zhì)量的安全, 緊跟生產(chǎn)綠色產(chǎn)品和發(fā)展有機農(nóng)業(yè)的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展趨勢, 保護生態(tài)環(huán)境安全, 應(yīng)該重視植物源農(nóng)藥在水稻病害防控中起到的關(guān)鍵作用。

目前常見的有除蟲菊、魚藤、魚尼丁、苦木、沙巴草、毛葉藜蘆和印楝等被應(yīng)用于植物源農(nóng)藥[4]。近年來, 組合化學技術(shù)、生物技術(shù)和高通量篩選技術(shù)的發(fā)展更是極大地推動了植物源農(nóng)藥的發(fā)展進程[5-6], 對于植物源農(nóng)藥的研發(fā)也成為研究人員探索的重點, 研究發(fā)現(xiàn), 夾竹桃 (Nerium indicum) 提取物對黃瓜褐斑病病原菌 (Corynespora cassiicola) 和番茄葉霉病病原菌 (Cladosporium fulvun) 菌絲生長抑制率超過 70%; 花椒(Zanthoxylumbungeanum) 提取物對番茄葉霉病病原菌 (Cladosporiumfulvun) 和小麥紋枯病病原菌(Rizoctoniacerealis) 菌絲生長抑制率超過60%[7];濃度為20 g·L-1的丁香 (Syzygiumaromaticum)提取物可以完全抑制山核桃干腐病病原菌(Botryosphaeriadothidea) 和油茶炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides); 牡 丹 (Paeonia suffruticosa) 提取物對山核桃干腐病病原菌的抑制率為93.81%, 對油茶炭疽病病原菌的抑制率為100%[8]。

植物源農(nóng)藥開發(fā)的核心就是找到更多有抑菌活性的成分, 本文對引起水稻惡苗病、稻瘟病、水稻褐變穗病和稻曲病的病原菌進行分離鑒定, 并測定了17 種植物的23 種提取物對4 種水稻病菌的抑制作用, 篩選出茵陳蒿提取物對水稻惡苗菌、稻瘟菌和水稻褐變穗菌有較好抑制效果, 魚眼草提取物對水稻稻曲菌有較好抑制效果, 為今后水稻病害的生物防治提供新的思路, 為開發(fā)新型植物源殺菌劑提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

材料共17 種 (表1), 分別采自云南、遼寧和廣西, 由西南林業(yè)大學林學院胡世俊副教授鑒定,標本存放于云南省森林災害預警與控制重點實驗室。

表1 供試植物情況

1.1.2 供試菌株

供試菌株有木賊鐮孢 (Fusariumequiseti)、稻梨孢 (Pyriculariaoryzae)、極細鏈格孢 (Alternaria tenuissima)、稻綠核菌 (Ustilaginoideaoryzae)。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物提取物的制備

將植物材料風干粉碎, 乙醇回流提取3 次, 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到提取物, 對于量大的提取物進一步采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取獲得不同溶劑萃取物, 精確稱量各提取物用二甲基亞砜(DMSO) 配成100 mg·mL-1的母液, 4 ℃冷藏備用。

1.2.2 病原菌的分離鑒定

病害標本采自石林田間自然發(fā)病的水稻植株,對癥狀典型的病害標本進行田間采集, 并在室內(nèi)進行顯微切片觀察初步確定病害種類。采用組織分離對病原菌進行分離、純化獲得病原菌, 接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA) 上待病原菌產(chǎn)孢后, 取菌落于載玻片上, 顯微觀察其形態(tài)特征并拍照記錄, 通過與文獻比對, 并結(jié)合分子鑒定技術(shù)確定病原菌種類。

1.2.3 菌絲生長抑制活性測定

采用帶毒平板法[10]測定。PDA 培養(yǎng)基高壓滅菌, 冷卻至50 ℃以下, 在培養(yǎng)基中加入巴氏消毒的提取物母液混合均勻, 使終濃度為2 mg·mL-1,以PDA 培養(yǎng)基混合相同濃度的DMSO 溶劑作為對照。在培養(yǎng)的菌落邊緣用打孔器打取直徑為5 mm的生長整齊一致的菌餅接種于平板中央, 每組處理3 個重復。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 直到對照組的菌落長滿培養(yǎng)皿, 采用十字交叉法測量各處理組的菌落直徑, 計算抑菌率, 并使用SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

1.2.4 孢子萌發(fā)實驗

參考康卓等[9]選取培養(yǎng)的已產(chǎn)孢菌種平板,在培養(yǎng)皿中滴加適量無菌水, 用三角刮棒輕輕刮下菌絲表面孢子, 用3 層無菌紗布過濾菌絲, 得到孢子懸浮液。通過血球計數(shù)將孢子懸浮液濃度調(diào)到每個視野100 個左右孢子備用。在加有供試提取物的溶液中加入孢子懸浮液使提取物終濃度為2 mg·mL-1, 以含相同濃度DMSO 的孢子懸浮液作為對照, 將孢子懸浮液滴在載玻片上, 保濕培養(yǎng), 15 h后顯微鏡下檢查萌發(fā)孢子數(shù)量, 計算孢子萌發(fā)率、萌發(fā)抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻病原真菌的分離鑒定

采用組織分離法對采集自石林田間的水稻惡苗病、褐變穗病、穗頸瘟病及稻曲病的植株標本進行了病原菌分離鑒定 (圖1), 顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),水稻惡苗病的病原菌大型分生孢子多孢, 形狀呈鐮刀形, 小型分生孢子單孢為橢圓至卵圓形, 分生孢子內(nèi)壁芽式, 確定為木賊鐮孢 (Fusarium equiseti)[11], 經(jīng)ITS 測序、BLAST 比對進一步確認了菌種鑒定結(jié)果。水稻褐變穗病的病原菌分生孢子的梗顏色較深, 以合軸式延伸, 頂端產(chǎn)生倒棍棒形、橢圓形或卵圓形的分生孢子, 褐色, 具橫、縱或斜隔膜, 頂端無喙或有喙, 單生或串生, 通過與文獻比較及分子鑒定結(jié)果確定為稻梨孢(Pyriculariaoryzae)[12]。水稻穗頸瘟病菌的分生孢子梗無色, 有橫隔膜, 細長, 不分支, 頂端以合軸式產(chǎn)生全壁芽生式分生孢子, 呈屈膝狀; 分生孢子為梨形至橢圓形, 確定為極細鏈格孢 (Alternaria tenuissima)[13-15]。稻曲病菌分生子座形成于寄主子房內(nèi), 上密生分生孢子, 分生孢子梗細小, 分生孢子單生, 單胞, 表面有疣狀突起, 橄欖綠色, 確定為稻綠核菌 (Ustilaginoideaoryzae)[16]。

圖1 水稻病原真菌的分離鑒定

2.2 菌絲生長抑制活性

以15 種植物的18 種提取物為供試藥劑, 采用菌絲生長速率法對水稻惡苗病菌進行室內(nèi)抑菌活性測定 (表2)。抑菌效果最高的是茵陳蒿提取物,抑制率為71.66%, 顯著高于其他提取物; 其次為牛尾蒿提取物, 抑菌率為63.33%; 此外, 魚眼草和全葉馬蘭提取物的抑菌活性也相對較高, 抑菌率分別為50.00%和41.25% (圖2); 其余的14 種植物提取物抑菌率均小于40.00%。

圖2 茵陳蒿、牛尾蒿、魚眼草提取物對木賊鐮孢的抑菌效果

表2 植物提取物對木賊鐮孢的抑菌活性

以14 種提取物為供試藥劑, 采用菌絲生長速率法對稻瘟病菌進行室內(nèi)抑菌實驗。分析結(jié)果如表3 所示, 最高的為茵陳蒿提取物, 抑制率為33.33%; 其次為香絲草提取物處理, 抑菌率為30.83%; 其余的12 種植物提取物的處理結(jié)果均小于30.00% (圖3)。

圖3 茵陳蒿、香絲草提取物對稻梨孢的抑菌效果

表3 植物提取物對稻梨孢的抑菌活性

2.3 孢子萌發(fā)抑制活性

以10 種提取物為供試藥劑, 對稻曲病菌的孢子進行孢子萌發(fā)實驗。如圖4 所示, 抑制孢子萌發(fā)效果最好的是魚眼草提取物, 抑制率為49.68%,其次為墨西哥鼠尾草和茵陳蒿提取物, 抑制率分別為45.38%和43.23%, 其余7 種提取物的抑制率均小于40.00%。

圖4 植物提取物對稻綠核菌的抑菌結(jié)果

以7 種植物的8 種提取物為供試藥劑, 對水稻褐變穗病菌的孢子進行孢子萌發(fā)實驗。如圖5 所示, 其中抑制率最高的為茵陳蒿提取物, 抑制率為73.69%, 其次為牛尾蒿提取物, 抑制率為50.60%, 第 3 為香絲草提取物, 抑制率為45.02%, 其余的5 種提取物的抑制率均小于40.00%。實驗發(fā)現(xiàn), 鬼針草地下部分提取物對水稻褐變穗病菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)起到了促進的作用。

圖5 植物提取物對極細鏈格孢的抑菌結(jié)果

進一步對茵陳蒿提取物進行不同濃度梯度的抑菌活性研究, 濃度分別為: 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1。結(jié)果如表4 所示, 在1.0～3.0 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi), 隨著提取物濃度升高, 處理組孢子萌發(fā)率從24.25%逐漸降至6.87%, 抑制率從47.01%逐漸升高至84.10%, 抑制率具有一定的線性關(guān)系, 線性方程為:y= 3.67x- 0.25,EC50=1.164 mg·mL-1,R2=0.960。

表4 不同濃度茵陳蒿提取物對極細鏈格孢的抑制活性

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、食品安全、病蟲害抗藥性等都是大量使用化學農(nóng)藥帶來的問題, 從植物中開發(fā)替代化學農(nóng)藥的高效低毒且環(huán)境友好的新型農(nóng)藥一直是植物保護研究的熱點領(lǐng)域[17]。Wang研究表明, 千層金 (Melaleucabracteata) 提取物對稻瘟病菌的EC50為33.78 μg·mL-1。金素心等[19]研究發(fā)現(xiàn), 澤漆和薄荷的植物提取物可以明顯抑制稻曲病菌。李麗娜等[20]的研究結(jié)果表明,0.1 g·mL-1的苦參根提取物對水稻稻瘟菌的孢子萌發(fā)抑制率達到100%; 獨角蓮提取物對番茄葉霉病菌的孢子萌發(fā)抑制率為99.50%。江茂生等[21]發(fā)現(xiàn), 濃度為50 mg·mL-1的艾蒿乙醇提取物對水稻紋枯病菌的抑制率大于90%, 對稻瘟病菌的孢子萌發(fā)抑制率大于90%, 表明艾蒿具有很大潛力開發(fā)為新型植物源農(nóng)藥。閆燕林[22]選用不同溶劑采取索式提取法獲得了16 種中草藥植物的粗提物,在供試質(zhì)量濃度為10 g·L-1時, 對稻瘟病的抑制率都大于50%。駱海玉等[23]的研究結(jié)果表明, 黔桂千金藤塊根、廣西地不容塊根、石菖蒲根莖和木防己塊根的地下根莖提取物對水稻白葉枯病菌都有較好的抑菌活性。朱奇奇等[24]的抑菌初篩研究表明, 八角多酚對水稻紋枯病菌的抑制率高達98.50%。Persaud 等[25]的研究結(jié)果表明, 15%的檸檬草、萬壽菊、厚葉百里香和丁香提取物對玉米紋枯病菌 (Rhizoctoniasolani) 菌絲生長的抑制作用較強。梁琪研究發(fā)現(xiàn), 甘草、黃連、肉桂的植物提取物可影響稻瘟菌菌絲的生長, 經(jīng)處理之后, 稻瘟病菌菌絲的生長明顯表現(xiàn)得不正常。由此可見, 這3 種植物提取物抑制稻瘟病菌效果突出,具有開發(fā)為稻瘟病菌抑制劑的巨大潛力[27]。這些成果說明, 從植物中尋找高效低毒的綠色農(nóng)藥用于水稻病害的生物防治具有廣闊的前景。

綜合各類不同的植物提取物對水稻惡苗病菌、紋枯病菌、稻曲病菌、褐變穗病菌的處理結(jié)果來看, 茵陳蒿、牛尾蒿2 種提取物對4 種水稻病原菌相對都有較為顯著的抑制效果。侯海利[28]采用生長速率法測定了茵陳蒿乙醇提取物對23 種植物病原真菌菌絲生長的抑制作用, 發(fā)現(xiàn)其濃度為50 mg·mL-1時對小麥赤霉病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌、玉米大斑病菌的抑制率為100%, 對番茄晚疫病菌的抑制中濃度為1.36 mg·mL-1。何彥儀用5 種蒿屬植物的乙醇提取物測定對馬鈴薯晚疫病pn5502 和pn7604 菌株的抑菌活性, 其中1 mg·mL-1牛尾蒿粗提物的抑菌活性最強, 抑菌率分別為89.04%和71.38%。通過本試驗可知,茵陳蒿和牛尾蒿2 種菊科蒿屬植物對4 株水稻病原菌的抑菌活性相對高于其他植物。這2 種植物在野外常見, 來源廣且易于成活, 可以作為新型植物源農(nóng)藥開發(fā)的原材料。但本試驗未進行深入的濃度梯度實驗以及抑菌活性物質(zhì)分析和抑菌機理的研究,今后可進一步追蹤研究, 進而為水稻病原菌的生物防治及植物源殺菌劑的研制提供更多的理論支持。