鞭毛主調控因子flhDC 調控機制及其在PGPR 定殖中的功能

劉慧, 藍明明, 邢蕾蕾

(東北林業(yè)大學 生命科學學院, 黑龍江 哈爾濱 150040)

革蘭氏陰性菌的鞭毛是其重要的運動器官, 長5～20 μm, 直徑約20 nm[1], 能夠幫助細菌趨近營養(yǎng)物質, 遠離不利生態(tài)位。細菌鞭毛由基體、鉤型鞘、鞭毛絲3 部分構成?；w包括環(huán) (外膜的L環(huán)、肽聚糖層的P 環(huán)、內膜的MS 環(huán)、胞內C 環(huán))、桿狀蛋白 (FlgG、FlgF、FlgC、FlgB、FliE 蛋白組成)、Ⅲ型蛋白質輸出裝置、定子 (MotA、MotB組成), 負責將鞭毛錨定在細胞膜上。鞭毛絲由FliC 或FljB 螺旋組裝而成, 起到推動鞭毛向前運動的作用。鉤型鞘由FlgE 組成, 負責基體與鞭毛絲的連接[2-4]。

作為一個結構復雜的大分子運動器官, 革蘭氏陰性菌鞭毛的合成至少涉及70 多個基因, 這期間蛋白的生產、組裝和運行需要消耗大量能量[5]。鞭毛的級聯(lián)調控可以有效保證鞭毛合成的高效性。flhDC位于級聯(lián)調控層次結構的頂部, 是大腸埃希菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌等細菌鞭毛合成的一級調節(jié)基因和主要調節(jié)因子, 在細菌鞭毛生物合成過程中起著關鍵作用[6]。flhDC直接或間接調控鞭毛生物合成過程中所有結構和成分的轉錄以應對外界環(huán)境和營養(yǎng)的變化, 同時,flhDC也受到諸多環(huán)境和生理因素的調控, 并將其整合到鞭毛合成過程[7]。

PGPR 的定殖對于細菌與植物間的相互作用至關重要, 能夠在植物根部定殖是PGPR 發(fā)揮促生作用的前提[8]。PGPR 在植物根系的定殖過程主要分為3 步: 首先, 鞭毛推動PGPR 朝著宿主植物根部趨化與運動; 其次, 單個PGPR 細胞接觸并初步附著于植物根表面; 最后, PGPR 在細胞膜等物質的作用下牢固黏附于根表面, 并在植物根系中長期存活和繁殖[8-10]。flhDC作為細胞的全局調節(jié)因子可以調控PGPR 在植物根表定殖過程中的運動和趨化, 參與PGPR 生物膜合成, 提高PGPR 在植物根部的定殖效率。

本文綜述了革蘭氏陰性菌中鞭毛主調控因子flhDC在轉錄水平、mRNA 翻譯水平、翻譯后水平受到的多重調節(jié), 以及flhDC在PGPR 定殖過程中發(fā)揮的重要作用。

1 鞭毛主調節(jié)因子flhDC 的概述

鞭毛的級聯(lián)調控使得鞭毛各元件的合成和組裝受到時間上嚴格的調控和管理。根據(jù)表達時間的不同將控制鞭毛合成的操縱子分為一級操縱子、二級操縱子和三級操縱子[6,11]。一級操縱子flhDC編碼兩個基因:flhD和flhC, 這兩個基因轉錄生成相應的蛋白FlhD 和FlhC。FlhD 和FlhC 主要由α-螺旋結構組成, 其中FlhC 含有獨特的鋅結合結構域[12]。FlhD4C2是由4 個FlhD、2 個FlhC 組成的六聚體復合物。其中, 每一個FlhC 原聚體與一個FlhD 二聚體結合形成D2C, 兩個D2C 異質三聚體進行組裝最終形成FlhD4C2六聚體[13]。FlhD4C2轉錄復合體的形成是鞭毛合成的必要條件, 是革蘭氏陰性菌二類操縱子的轉錄激活劑[14]。FlhD4C2識別并結合靶基因起始位點上游約28～88 bp 的位點,在σ70存在的前提下招募RNA 聚合酶, 通過與RNA 聚合酶α 亞基C 末端區(qū)域相互作用激活鞭毛二級操縱子的轉錄[15-16]。

7 個 FlhD4C2依賴型二級操縱子flgAMN、flgBCDEFGHIJ、flhBAE、fliAZY、fliE、fliFGHIJK和fliLMNOPQR編碼鞭毛的組裝蛋白、相關輸出裝置及調節(jié)蛋白FliA 和FlgM。在HBB (基體) 組裝完成之前, 抗σ 因子FlgM 與σ28結合, 從而阻止σ28與RNA 聚合酶相互作用, 抑制下游基因的轉錄。一旦HBB (基體) 組裝完成, 分泌裝置的特異性就會發(fā)生變化, 將FlgM 從細胞中分泌出去,同時釋放FliA, 激活三級操縱子的轉錄[17-18]。目前, 公認的三級操縱子主要包括flgKL、fliDST、flgMN、fliC、fljBA、tar-tap-cheRBYZ、motABcheAW、tsr、aer, 負責編碼鞭毛絲、馬達蛋白和趨化蛋白等鞭毛合成后期裝配所需的產物[11,15]。

2 鞭毛主調控因子flhDC 受到的多重調節(jié)

細菌的運動是極端復雜的過程, 眾多全局性調控、群體感應、新陳代謝和環(huán)境信號相關因子參與其中, 使得轉錄因子flhDC 在調控鞭毛合成的同時自身也受到轉錄、mRNA 翻譯、翻譯后3 個水平的多重調控 (圖1)。

圖1 革蘭氏陰性菌鞭毛主調控因子flhDC 受多重調節(jié)示意圖

2.1 flhDC 在轉錄水平受到的調節(jié)

flhDC基因表達受到諸多調控因子的影響, 絕大多數(shù)調控因子在flhDC轉錄水平發(fā)揮作用。某些情況下, 環(huán)境等因素對基因的調控由調節(jié)蛋白介導, 如DNA 復制起始蛋白DnaA[19]、DNA 結合轉錄雙調節(jié)因子Lrp[20]、反轉刺激因子Fis[21]、DNA結合蛋白HU[22-23]、組蛋白樣類核結構蛋白HNS[23-24]。Soutourina 等[25]發(fā) 現(xiàn), 在 大 腸 埃 希 菌(Escherichiacoli) 中, 細菌通過H-NS 調控flhDC的轉錄以響應外界酸性環(huán)境。H-NS 參與染色體組織化, 通過改變flhDC啟動子區(qū)域的DNA 拓撲結構減少flhDC的轉錄[6]。另外, H-NS 依賴的flhDC調節(jié)因子HdfR 通過與flhDC的上游區(qū)域結合也能夠抑制細菌的鞭毛合成[26]。Campoy 等[27]發(fā)現(xiàn),在鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonellatyphimurium) 中,DNA 結合轉錄雙調節(jié)蛋白Fur 通過與flhDC啟動子結合正向調控鞭毛合成。Winter 等[28-30]發(fā)現(xiàn), 在鼠傷寒沙門氏菌中 EnvZ/OmpR 雙組分系統(tǒng)和Rcs系統(tǒng)分別對滲透壓和包膜應激 (envelope stress)作出響應, 輔助蛋白TviA 整合這兩條通路的信號并負向調控flhDC基因和Ⅲ型分泌系統(tǒng) (T3SS-1)基因的表達, 抑制細菌運動。除此之外, Wang發(fā)現(xiàn), RcsA 作為RcsB 的輔因子進一步加強對鞭毛合成抑制。Kim 等[32-33]在穎殼伯克霍爾德菌(Burkholderiaglumae) 中發(fā)現(xiàn), 群體感應 (QS)相關蛋白QsmR 與flhDC的啟動子區(qū)結合, 并激活后者表達。此后, Sircili 等[34-35]發(fā)現(xiàn), 在腸致病性大腸埃希菌 (enteropathogenicEscherichiacoli) 中,flhDC基因的轉錄由群體感應調節(jié)器QseB 和QseC激活, 被QseA 抑 制。Soutourina 等[36-37]發(fā) 現(xiàn), 在大腸埃希菌中, 環(huán)磷酸腺苷及其受體蛋白的復合物(cAMP-CRP) 可以結合flhDC操縱子調控區(qū)域并在此與RNA 聚合酶相互作用, 正向調控flhDC的轉錄。Shi 等[38]發(fā)現(xiàn), 大腸埃希菌中熱休克蛋白DnaK、DnaJ 和GrpE 通過影響flhDC轉錄影響細菌運動, 從而使細菌對外界溫度變化作出反應。

除環(huán)境因子外, 還有許多其他調節(jié)因子能夠在轉錄水平調控flhDC的表達, 其中大部分是起負調控作用, 抑制flhDC的表達。Mouslim 等[21]發(fā)現(xiàn),沙門氏菌中flhDC基因的啟動子區(qū)存在DNA 結合轉錄雙重調節(jié)蛋白LrhA 和SlyA 的結合位點, 二者通過抑制基因flhDC的轉錄減少細菌鞭毛的合成。Kakkanat 等[39]發(fā)現(xiàn), 在尿路致病性大腸埃希菌(UropathogenicEscherichiacoli, UPEC) 中, 多藥耐藥調控蛋白基因mprA、N5-谷氨酰胺甲基轉移酶基因hemK和EF-P-賴氨酸轉移酶基因yjeA的突變導致flhD和fliC基因轉錄顯著增加。Meng 等[40]發(fā)現(xiàn), 在青枯雷爾氏菌 (Ralstoniasolanacearum) 中,運動相關蛋白MotN 和雙組分調節(jié)因子VsrA/D 均對flhDC的轉錄起負調節(jié)作用。Thota 等[41]發(fā)現(xiàn),多重耐藥調控因子MarA、SoxS、Rob 和RamA 參與調控鼠傷寒沙門氏菌中鞭毛基因的表達, 其中MarA 和Rob 直接與flhDC啟動子相互作用, 從而抑制細菌運動。Lemke 等[42]發(fā)現(xiàn), 大腸埃希菌中ppGpp (四磷酸鳥苷) 和RNA 聚合酶結合轉錄因子DksA 共同調節(jié)細胞鞭毛的合成, DksA 和ppGpp與flhDC啟動子區(qū)域直接且特異性地結合并抑制flhDC轉 錄。Singer 等[43]發(fā) 現(xiàn), 沙 門 氏 菌 中FlhD4C2蛋白復合物可以激活LuxR 家族轉錄調節(jié)蛋白RflM 基因的轉錄, RflM 蛋白與flhDC啟動子區(qū)域結合并抑制flhDC的轉錄, 進而實現(xiàn)了FlhD4C2對flhDC操縱子的自我反饋調節(jié)。除此之外, 還有多種蛋白, 如轉錄調節(jié)蛋白RtsB[44]、DNA 結合轉錄激活蛋白UvrY[45]、雙組分信號轉導系統(tǒng) RssA/B[46]、菌 毛 相 關 調 控 蛋 白 PapX[47]、LuxR 型轉錄因子MatA[48]和 FimZ[49]、DNA 結合轉錄抑制因子YjjQ[50]、轉錄調節(jié)因子MrpJ[51]、LysR家庭轉錄調節(jié)蛋白CrgA[52], 均可以通過降低flhDC的轉錄水平抑制細菌鞭毛的合成。

諸多調控因子通過促進flhDC的轉錄調控細胞合成 鞭 毛。Mouslim 等[21]發(fā)現(xiàn), 在沙門氏菌中,AraC 家族轉錄調節(jié)器HliD 直接與flhDC的啟動子區(qū)域結合, 激活flhDC的轉錄。Dong發(fā)現(xiàn),大腸埃希菌中flhDC操縱子的轉錄受到RNA 聚合酶Sigma 因子RpoN 的正向調控。Theodorou 等[54]發(fā)現(xiàn), 大腸埃希菌中, 雙組分系統(tǒng)AtoS/C 通過增強flhDC和fliAZY操縱子的轉錄, 參與調節(jié)大腸埃希菌的運動性和趨化性。Chen 等[55]發(fā)現(xiàn), 鼠傷寒沙門氏菌中, 反義RNA AsfD 從flhDC操縱子的互補鏈轉錄而來, 并覆蓋整個flhDC操縱子, AsfD 對細胞運動性和生物膜的增強可能是通過上調flhDC轉錄水平實現(xiàn)。Rahimpour 等[56]發(fā)現(xiàn), 大腸埃希菌糖原合成調控蛋白基因glgS突變體中,flhDC的轉錄水平顯著降低。Andreozzi 等[57]發(fā)現(xiàn), 轉錄調節(jié)蛋白基因pchE的敲除使得大腸埃希菌中flhDC轉錄水平下調, 而回補菌株中pchE通過上調flhDC等細菌趨化性、運動性和鞭毛結構相關基因的轉錄水平促進鞭毛的生物合成和細菌運動。

2.2 flhDC 在mRNA 翻譯水平受到的調節(jié)

多項研究結果表明, 非編碼小RNA (sRNAs)與細胞的氨基酸代謝、碳代謝、金屬感應有關, 部分sRNA 參與調控細胞群體感應、生物膜合成、毒力感染、應激適應等過程, 因此, sRNAs 是細胞調控生理過程的關鍵因素[58]。在大腸埃希菌及沙門氏菌中, 細胞通過精確快速地改變mRNAs 的含量影響蛋白質的合成以應對外界壓力與環(huán)境變化。sRNAs 通常與RNA 伴侶Hfq 結合, 有助于sRNA與靶mRNA 在flhDCmRNA 的5′未翻譯區(qū)域 (5′TUR) 的配對, 二者的結合可以增加靶mRNA 的穩(wěn)定性或招募單鏈特異性內核糖核酸酶RNase E 對mRNA 進行定向切割, 造成核糖體結合和翻譯受阻[59]。

Thomason 等[60]發(fā)現(xiàn), 大腸埃希菌中, 生物膜合成相關的sRNA McaS 可以通過堿基互補配對直接與flhDC的mRNA 結合, 從而避免其不被核酸酶降解, 這一過程增加了flhDCmRNA 的穩(wěn)定性, 促進細菌鞭毛的合成。Schachterle 等[61-62]發(fā)現(xiàn), 在噬淀粉歐文氏菌 (Erwiniaamylovora) 中, ArcZ 受到ArcB/ArcA 雙組分系統(tǒng)的負調節(jié)以應對細胞可用氧氣的變化, 通過與flhDCmRNA 核糖體結合位點上游區(qū)域的直接堿基配對負調節(jié)基因flhD和flhC的表達。Romilly 等[63-64]發(fā)現(xiàn), 大腸埃希菌中sRNA OmrA 和OmrB 被EnvZ/OmpR 雙組分系統(tǒng)激活轉錄以響應滲透壓變化, 二者通過與flhDCmRNA 相互作用阻礙了flhDC的翻譯。De Lay 等[64]發(fā)現(xiàn), 大腸埃希菌中OxyR 通過增加OxyS 的胞內含量以應對細菌的氧化應激, OxyS 與flhDC的堿基互補配對抑制了flhDC的翻譯, 減少細胞鞭毛的合成。

除sRNA 外, 部分調節(jié)蛋白也參與到flhDCmRNA 穩(wěn)定性調控中。Yakhnin 等[65]在大腸埃希菌flhDC轉錄本中發(fā)現(xiàn)了RNA 結合調節(jié)因子CsrA 的結合位點, 研究表明, CsrA 蛋白通過保護flhDCmRNA 不被RNase E 內切而促進flhDC的表達。

2.3 flhDC 在翻譯后水平受到的調節(jié)

多種抗FlhD4C2因子能夠調節(jié)蛋白FlhD4C2的活性, 抑制其對下游二類啟動子的激活, 減少鞭毛合成。Yamamoto 等[66]發(fā) 現(xiàn), 鼠 傷 寒 沙 門 氏 菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium) 中, 鞭毛特異性伴侶蛋白FliT 作為一種抗FlhD4C2因子與FlhD4C2的FlhC 亞單位結合, 從而減少與下游二類操縱子啟動子的結合。在基體的組裝過程中, 胞質中過量的鞭毛絲帽蛋白FliD 與FliT 結合, 使得FlhD4C2從FliT 中釋放出來激活二類操縱子的轉錄, 促進基體結構蛋白的表達?；w組裝完成后,FliD 被運輸?shù)郊毎? 游離的FliT 通過與FlhD4C2的相互作用關閉二類操縱子的表達, 這有利于降低細胞鞭毛的合成成本, 避免不必要的能量損耗[67]。Wada發(fā)現(xiàn), 腸道沙門氏菌 (Salmonella enterica) 中抗FlhD4C2因子YdiV 能夠與FlhD4C2結合形成一個大的異質復合物, 該過程不僅抑制了FlhD4C2與二類啟動子的結合還可以從 DNAFlhD4C2復合物中釋放FlhD4C2, 終止二類操縱子的轉錄。作為一種雙功能蛋白, YdiV 還可以將FlhD4C2傳遞給蛋白酶ClpXP, ClpXP 與FlhD 的C末端結合逐步降解FlhD4C2[70]。Chatterjee 等[71-73]在黑腐果膠桿菌 (Pectobacteriumatrosepticum) 和胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌 (Erwiniacarotovorasubsp.Carotovora) 中發(fā)現(xiàn)16S rRNA 甲基轉移酶RsmC 可以與FlhD 和FlhDC 復合體結合, 作為抗FlhD4C2因子發(fā)揮作用。Li 等[74]發(fā)現(xiàn), 沙門氏菌中類EAL樣蛋白STM1697 通過與FlhD4C2的外周FlhD 直接結合限制FlhD4C2招募RNA 聚合酶啟動下游基因的轉錄。

部分調控因子可以通過參與FlhD4C2蛋白的折疊和修飾調控FlhD4C2蛋白活性。Shi 等[38,75]發(fā)現(xiàn), 沙門氏菌中將基因dnaK突變之后, 伴侶蛋白DnaK 參與的多肽折疊和寡聚蛋白激活過程異常,這導致FlhD 和FlhC 組成的復合物在激活下游二類啟動子時只保持部分活性。Ma 等[76]在沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)了一種新型蛋白翻譯后修飾, 即應激相關蛋白YdiU 的單磷酸尿苷酸化修飾 (UMP), YdiU 對FlhC 亞基的 Ser31 殘基進行修飾, 修飾后的FlhD4C2不能與鞭毛的二類啟動子結合, 從而關閉了鞭毛的合成途徑。這也是針對FlhD4C2確定的第一個翻譯后修飾。

3 flhDC 在PGPR 定殖過程中的作用

隨著研究的深入, 越來越多人意識到鞭毛在細菌眾多生理過程中發(fā)揮了重要的作用, 如PGPR 的定殖過程。由PGPR 制成的根際生防微生物制劑已經被證明是一種能夠有效提高植物產量、防治病蟲害的安全環(huán)保的制劑[77-78]。根際生防微生物制劑的合理使用降低了化學肥料對土壤的污染, 是提高生產力、促進農林經濟的有力手段, 同時也為可持續(xù)發(fā)展提供了有效途徑[79-82]。然而, 根際生防微生物制劑的功效可能會受細菌定殖能力的限制。能夠在植物根部定殖是PGPR 發(fā)揮促生作用的前提。目前影響PGPR 在植物根部定殖的因素主要有: 植物根系分泌物中化學信號和營養(yǎng)物質的種類與濃度; PGPR 的運動性; PGPR 的生物膜合成能力;PGPR 的抗氧化活性; 以及PGPR 逃避和抑制宿主免疫系統(tǒng)等能力[9,83]。鞭毛通常被認為是促進細菌和宿主有益互作的關鍵成分, 其中, 主調控因子flhDC在PGPR 定殖過程中調控了PGPR 的運動性及生物膜的形成。

3.1 flhDC 調控PGPR 的運動性

在陸生植物中, 根系是植物與微生物互作最主要的場所。植物的根系分泌物可以為微生物提供豐富的營養(yǎng)物質, 對于微生物來說, 根系是非常有吸引力的生態(tài)位[10]。鞭毛提供的動力推動PGPR 向宿主根系靠近, 這對于PGPR 在植物根系的定殖十分重要。Barahona 等[84-86]發(fā)現(xiàn), 在PGPR 熒光假單胞菌 (Pseudomonasfluorescens) 中, 當基因flhDC的表達受到抑制時, 鞭毛合成系統(tǒng)部分關閉, 鞭毛數(shù)量減少, 這導致PGPR 在植物根部競爭性定殖能力下降。因此,flhDC可以通過調控PGPR 的運動性影響PGPR 在植物根部的定殖。

3.2 flhDC 參與PGPR 生物膜的形成

在植物根表面PGPR 形成生物膜并以黏附的方式進行固著。生物膜是由核酸、脂質、胞外多糖、蛋白質及嵌入其中的微生物組成的胞外基質。與浮游細胞相比, PGPR 生物膜具有更高的生長素(IAA) 產量、固氮酶活性和產氨能力[9]。另外,生物膜為PGPR 提供了保護, 提高其對不良環(huán)境的耐受性, 使得PGPR 在土壤惡劣的環(huán)境中得以存活且維持較高的生物量, 進一步加強與植物之間的有益 互 作[87]。Thai 等[88]發(fā) 現(xiàn), 伯 克 霍 爾 德 菌 屬(Paraburkholderiasp.) 中, 將基因flhDC敲除后,基因缺失突變體的運動性和生物膜形成能力幾乎完全喪失。Teplitski 等[89]發(fā)現(xiàn), 在沙門氏菌中基因flhD和flhC的敲除突變體生物膜形成能力有所提高。生物膜形成是一個復雜的調控網絡, 受到由鞭毛介導的運動性的雙重調控, 但無論是促進還是抑制,flhDC在此過程中都發(fā)揮著不可或缺的作用。

總之, 除在鞭毛合成中起著關鍵作用外,flhDC還是許多非鞭毛基因的全局調節(jié)器。flhDC在PGPR 植物根部定殖過程中調控了細菌運動性,參與PGPR 生物膜形成, 提高PGPR 在植物根部的定殖量和定殖效率, 促進了PGPR 與植物間的有益互作。

4 展望

隨著人口的增加和社會的發(fā)展, 我國對于農林產品的需求也不斷增加。化肥、農藥、殺蟲劑的大量濫用導致土壤肥力和質量下降, 這加劇了脆弱的生態(tài)環(huán)境的惡化。所以, 近年來更提倡采用更加高效環(huán)保的生物肥料和生物防治, 根際生防微生物制劑就是其中之一。土壤、溫度、氣候、降水量等環(huán)境因素造成的遲效性和不穩(wěn)定性是根際生防微生物制劑目前所要面對的主要問題, 提高 PGPR 在植物根部的定殖能力可以在一定程度上彌補這一缺陷。flhDC是編碼鞭毛生物合成的主要調節(jié)因子,調控了PGPR 在植物根表定殖過程中的運動和趨化, 參與了該過程中PGPR 生物膜的形成。此外,flhDC面臨轉錄水平、mRNA 翻譯水平、翻譯后水平上的多重調控, 這在一定程度上解釋了根際生防微生物制劑的遲效性和不穩(wěn)定性, 同時也為提高PGPR 在植物根部的定殖效率提供理論指導。