乳酸乳球菌生產(chǎn)2'-巖藻糖基乳糖的途徑構(gòu)建及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

程亞楠 張文聰 周圓 孫雪 李玉 李慶剛

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津財經(jīng)大學珠江學院，天津 301811）

人乳寡糖（human milk oligosaccharides, HMOs）是一類不可被人體直接吸收利用，但可被人體腸道中的有益菌群分解利用的復(fù)雜碳水化合物，是母乳中含量僅次于乳糖和脂肪的第三大成分，目前已被鑒定的就有200多種，是保護新生兒身體健康的重要組成成分［1-2］。其可作為益生元，刺激雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳桿菌（Lactobacillus）等有益菌群的生成［3］，作為配體類似物預(yù)防病原體黏附腸道［4］，也可作為免疫調(diào)節(jié)因子，減輕免疫相關(guān)炎癥的反應(yīng)，提高嬰兒腸道免疫功能［5］。同時，HMOs在大腦發(fā)育、神經(jīng)元傳遞和突觸的形成中具有重要作用［6-7］。2′-巖藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose, 2′-FL）在HMOs中含量占比最高，可達31%［8］，同時也是結(jié)構(gòu)最為簡單的寡糖，而且具有HMOs的大部分功能，所以探索2′-FL如何安全高效合成，對促進2′-FL的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

2′-FL的合成方法主要有3種，化學法、酶法和微生物全細胞合成法。其中微生物全細胞合成法具有條件溫和、成本低廉等特點，是最常用的2′-FL合成方法［9-10］。2′-FL的微生物合成過程如圖1所示，其中GDP-巖藻糖的從頭合成途徑，以胞內(nèi)果糖-6-磷酸為前體，通過甘露糖-1-磷酸異構(gòu)酶ManA、磷酸甘露糖變位酶ManB、甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脫水酶Gmd，以及GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖3,5-變旋酶/4-還原酶WcaG來合成GDP-巖藻糖［11］。補救合成途徑則以L-巖藻糖為合成起始物質(zhì)，通過雙功能酶L-巖藻糖激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶Fkp來合成GDP-巖藻糖［12-13］。GDP-巖藻糖和乳糖在α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，生成2′-FL。目前2′-FL生產(chǎn)研究大多在大腸桿菌（Escherichia coli）中，但大腸桿菌并不適合直接在食品中應(yīng)用，因此其他食品安全級微生物，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等也已被證實可用于生產(chǎn)2′-FL。在酵母細胞中通過對外源基因gmd、wcaG、fkp共表達，可以得到相對豐富的GDP-巖藻糖［14-16］，進一步過表達巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶fucT2和乳糖轉(zhuǎn)運蛋白lac12，2′-FL產(chǎn)量達到0.5 g/L左右［17-18］。谷氨酸棒桿菌具有將甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖的manB和manC基因，共表達manB、manC、gmd和wcaG，可有效合成GDP-巖藻糖［19］，在此基礎(chǔ)上表達巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因fucT2和乳糖透過酶基因lacY，以葡萄糖和乳糖為底物，2′-FL產(chǎn)量達到0.246 g/L［20］。而本研究中所選用的乳酸乳球菌是一種可直接應(yīng)用于乳制品中的食品安全級微生物［21-22］，目前還沒有用于合成2′-FL的報道，但有報道證明，通過對乳酸乳球菌進行改造，可用于表達酶類和活性蛋白等［23-24］。

圖1 2′-FL的從頭合成途徑和補救合成途徑Fig.1 De novo and salvage synthesis pathways of 2′-FL

本研究在乳酸乳球菌原有的代謝途徑基礎(chǔ)上，將2′-FL合成途徑中所需的異源微生物的相關(guān)基因，以在質(zhì)?；蚧蚪M上表達的方式轉(zhuǎn)入選取的乳酸乳球菌宿主中，構(gòu)建從頭合成途徑，進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，實現(xiàn)以葡萄糖和乳糖為底物的2′-FL有效合成，為2′-FL的生物制備提供了新策略，具有重要的科研價值和研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒信息以及引物序列 本研究中所用菌株、質(zhì)粒和引物信息見表1。

1.1.2 主要試劑 實驗中用到的主要試劑包括PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取試劑和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，一步法無縫克隆試劑盒（ClonExpress? CE II）購自南京諾唯贊生物科技公司，PCR擴增使用的phusion DNA polymerase購自Thermo Fisher Scientific公司，酵母粉購自英國Oxoid公司，氨芐青霉素、3-（N-嗎啉）丙磺酸（MOPS）、Nisin乳鏈菌肽購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 實驗中用到的主要儀器設(shè)備包括PCR擴增儀（Applied Biosystems），DNA凝膠電泳槽（Baygene），高速冷凍離心機（Sigma），高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），Bio電擊轉(zhuǎn)化儀（美國BTX公司），超聲波細胞破碎機（加拿大愛威斯?。?，分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基成分（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。發(fā)酵培養(yǎng)基成分（g/L）：磷酸氫二鈉10.0，硫酸鎂1.4，氯化鈉4.0，無水乙酸鈉1.5，酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，抗壞血酸0.5，MOPS 40.0，金屬溶液10.0 mL/L，pH 7.0；利用補救途徑合成2′-FL時，添加10.0 g/L的巖藻糖和5.0 g/L的乳糖；從頭合成途徑時，添加20.0 g/L葡萄糖和5.0 g/L的乳糖。如菌株攜帶誘導(dǎo)型啟動子Pnis時，則在培養(yǎng)基中加入終濃度為0.04 μg/mL的Nisin誘導(dǎo)劑。金屬溶液成分（g/L）：硫酸亞鐵10.0，硫酸鋅2.2，硫酸銅1.0，硫酸錳0.38，四硼酸鈉0.02，七鉬酸銨0.1，氯化鈣2.0。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 以質(zhì)粒pNZ8148-1為模板，用引物48-F/R擴增出pNZ8148-1載體片段；以質(zhì)粒pNZ-fkp、pET-futC為模板，用引物fkp-F1/R1、futC-F1/R1分別擴增出fkp、futC片段；以L.lactis NZ3900基因組為模板，用引物lacF-F/R擴增出lacF片段。利用重疊PCR技術(shù)擴增出片段fkp-futC-lacF。利用無縫克隆技術(shù)連接片段pNZ8148-1、fkp-futC-lacF，轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，然后對轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pNZ8148-2f（圖2-A）。其中基因fkp來自Bacteroides fragilis，基因futC來自Helicobocton pyloni，基因lacF來自L.lactis。

圖2 2′-FL從頭合成途徑所需質(zhì)粒的構(gòu)建流程Fig.2 Construction of plasmids required for the de novo synthesis of 2′-FL

以質(zhì)粒pNZ8148-2f為模板，用引物pz-F/R擴增出線性片段pNZ8148-futC-lacF；以E.coli MG1655基因組為模板，用引物manC-F/R擴增出manC片段。利用無縫克隆技術(shù)連接片段pNZ8148-futC-lacF、manC，轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，然后對轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pNZ8148-CfF1（圖2-A）。再以質(zhì)粒pNZ8148-CfF1為模板，利用引物FP-F1/R1擴增出線性片段pNZ8148-manC-futC-lacF；以質(zhì)粒pNZ5319為模板，用引物P32-F3/R3擴增出啟動子P32片段。利用無縫克隆技術(shù)連接片段pNZ8148-manC-futC-lacF、P32，轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，然后對轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pNZ8148-CfF2（圖2-A）。

以質(zhì)粒pNZ5319為模板，用引物5319-F/R、P32-F1/R1、P32-F2/R2擴增出pNZ5319載體片段、啟動子P32-1（含連接基因up、manB的同源臂）、P32-2（含連接基因manA、gmd的同源臂）片段；以L.lactis NZ9000基因組為模板，用引物up-F/R、down-F/R，擴增出同源重組所需的基因upp上游同源臂片段（up）和下游同源臂片段（down）；以E.coli MG1655基因組為模板，用引物manB-F/R、manA-F/R、manA-F/R1、gmd-F/R、wcaG-F/R分別擴增出manB、manA-1（不含同源臂）、manA-2（含連接基因gmd的同源臂）、gmd和wcaG片段；以質(zhì)粒pNZ8148-1為模板，用引物Pnis-F1/R1、Pnis-F2/R2擴增出啟動子Pnis-1（含連接基因manA、gmd的同源臂）、Pnis-2（含連接基因up、manB的同源臂）片段。利用重疊PCR技術(shù)分別擴增出片段pNZ5319-updown、P32-manB-manA-gmd-wcaG、Pnis-manB-manA-gmd-wcaG、P32-manB-manA、P32-gmd-wcaG、PnismanB-manA、Pnis-gmd-wcaG。利用無縫克隆技術(shù)連接片段pNZ5319-up-down、P32-manB-manA、Pnisgmd-wcaG，轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，然后對轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pNZ5319-UBAgwD1（圖2-B）。

1.2.2 菌株構(gòu)建 將質(zhì)粒pNZ8148-2f分別轉(zhuǎn)化到L.lactis NZ3900、L.lactis NZ9000中，得到菌株NZ3900（pNZ8148-2f）和NZ9000（pNZ8148-2f）。

將質(zhì)粒pNZ5319-UBAgwD1轉(zhuǎn)化到L.lactis NZ9000中，平板上長出的轉(zhuǎn)化子即為理論上的單交換菌株。對單交換成功的菌株連續(xù)傳代7次，排除質(zhì)粒pNZ5319-UBAgwD1造成的假陽性。又以單交換突變株具有同源性極高的片段，具有遺傳的不穩(wěn)定性，可以自發(fā)進行第二次重組。篩選能夠在5-氟尿嘧啶平板上生長而氯霉素平板上不生長的轉(zhuǎn)化子，獲得已成功完成雙交換的菌株，命名為NZ9000 1。利用同樣的重組技術(shù)可得帶有up-Pnis-manB-manAP32-gmd-wcaG-down片段的菌株NZ9000 2、帶有up-P32-manB-manA-gmd-wcaG-down片段的菌株NZ9000 3、帶有up-Pnis-manB-manA-gmd-wcaG-down片段的菌株NZ9000 4。

將質(zhì)粒pNZ8148-CfF1轉(zhuǎn)化到NZ9000 1中，得到菌株NZ9000 5。利用同樣的方法將菌株NZ9000 1、NZ9000 2、NZ9000 3、NZ9000 4和質(zhì)粒pNZ8148-CfF1、pNZ8148-CfF2分別組合，共得到8株不同的菌株NZ9000 5、NZ9000 6、NZ9000 7、NZ9000 8、NZ9000 9、NZ9000 10、NZ9000 11、NZ9000 12［25-26］。

1.2.3 菌株培養(yǎng) 常規(guī)的菌株培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中進行。進行發(fā)酵培養(yǎng)時，取甘油保存菌株10 μL接入到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)作為種子液，按2%的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)使用250 mL三角瓶進行，裝液量為30 mL，在振蕩搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min。如菌株攜帶表1所示含有氯霉素抗性的質(zhì)粒，則培養(yǎng)基中加入終濃度為50 mg/L的氯霉素。利用分光光度計檢測培養(yǎng)液OD600測試菌株的生長狀況，利用高效液相色譜/蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）檢測發(fā)酵液中2′-FL的產(chǎn)量。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化 以含胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，不含氯化高鐵血紅素的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，測定菌株生長和發(fā)酵生產(chǎn)2′-FL所需最適氯化高鐵血紅素的濃度，添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL，每組3個平行。

以含氯化高鐵血紅素2.5 μg/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，組合優(yōu)化胰蛋白胨和酵母粉的濃度對菌株生長和發(fā)酵產(chǎn)2′-FL的影響。如表2所示，共有16組不同的組合形式，每組3個平行。

表2 胰蛋白胨與酵母粉協(xié)同優(yōu)化濃度組合Table 2 Co-optimized concentration combination of tryptone and yeast extract

1.2.5 使用HPLC檢測發(fā)酵液中2′-FL濃度 取1 mL發(fā)酵液，利用超聲波破碎細胞，將破碎細胞懸液置于沸水中10 min，13 000 r/min離心10 min，收集上清。向上清中加入三倍體積的乙腈，混勻后13 000 r/min離心10 min。吸取上清，用0.22 μmol/L的有機系濾膜過濾處理后利用HPLC-ELSD檢測。所用的色譜柱為Carbohydrate ES 5 μm 250 mm × 4.6 mm，檢測器為蒸發(fā)光檢測器，流動相組成為：70%的乙腈（乙腈∶水，體積比），柱溫為30℃，進樣量為10 μL，流速為0.8 mL/min［27-28］。利用不同濃度的2′-FL標準品繪制峰面積對應(yīng)濃度的標準曲線，計算樣品中2′-FL的含量。

2 結(jié)果

2.1 2′-FL補救合成途徑的構(gòu)建與底盤菌株評價

L.lactis NZ9000中本身沒有乳糖吸收和分解利用途徑，不會利用作為2′-FL前體的乳糖，在構(gòu)建2′-FL生產(chǎn)菌株時需要引入乳糖透過酶基因lacF。將片段fkp、futC、lacF與表達載體pNZ8148-1連接并轉(zhuǎn)化到E.coli JM109后，用引物fkp-F1和lacF-R1進行PCR驗證，如果構(gòu)建不成功，則無條帶產(chǎn)生，如果構(gòu)建成功，條帶大小約為4 000 bp。結(jié)果如圖3-A所示，PCR條帶約為4 000 bp，與片段fkp-futC-lacF理論大小一致，表明質(zhì)粒pNZ8148-2f構(gòu)建成功。

圖3 驗證菌株的菌落PCR電泳圖Fig.3 Electrophoresis diagram of PCR product for strain validation

利用發(fā)酵培養(yǎng)基，添加10 g/L的巖藻糖和5 g/L的乳糖，測試NZ3900（pNZ8148-2f）和NZ9000（pNZ8148-2f）搖瓶發(fā)酵過程中的2′-FL生產(chǎn)和菌株生長狀況。同時，為驗證基因fkp、futC和lacF過表達，以及質(zhì)粒pNZ8148-1本身對菌株生長的影響，同時測試了不含質(zhì)粒的野生菌以及含有空載質(zhì)粒的野生菌生長狀況。2′-FL產(chǎn)量如圖4-A所示。隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)量逐漸提高，48 h產(chǎn)量達到最高，分別為0.16 g/L和0.40 g/L。菌株的生長曲線如圖4-B, C所示，菌株NZ3900（pNZ8148-2f）和NZ9000（pNZ8148-2f）生長速率稍慢于分別對應(yīng)的帶有空載質(zhì)粒的野生型菌株NZ3900（pNZ8148-1）和NZ9000（pNZ8148-1）。隨著生長周期的延長，NZ9000（pNZ8148-2f）的培養(yǎng)液菌體濃度能夠與其對照出發(fā)菌株持平，而NZ3900（pNZ8148-2f）則最終低于其對照菌株。綜上，將L.lactis NZ9000用作2′-FL生產(chǎn)的底盤菌種。

2.2 利用NZ9000構(gòu)建從頭合成途徑生產(chǎn)2'-FL

尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的編碼基因upp是乳酸乳球菌中公認的非必須基因，是常用的基因插入位點。在敲除upp基因的同時將基因P32、manB、manA、Pnis、gmd、wcaG整合到L.lactis NZ9000細胞中。將片段up、P32、manB、manA、Pnis、gmd、wcaG、down與表達載體pNZ5319連接并轉(zhuǎn)化到E.coli JM109后，用引物P32-F1和wcaG-R進行PCR驗證，如果構(gòu)建不成功，則無條帶產(chǎn)生，如果構(gòu)建成功，條帶大小約為5 000 bp。結(jié)果如圖3-B所示，PCR條帶約為5 000 bp，與片段P32-manB-manAPnis-gmd-wcaG理論大小一致，表明質(zhì)粒pNZ5319-UBAgwD1構(gòu)建成功。同理可得質(zhì)粒pNZ5319-UBAgwD2、pNZ5319-UBAgwD3、pNZ5319-UBAgwD4。

將質(zhì)粒pNZ5319-UBAgwD1化轉(zhuǎn)進L.lactis NZ9000中，用引物P32-F1和wcaG-R進行PCR驗證，如果單交換不成功，則無條帶產(chǎn)生，如果單交換成功，條帶大小約為5 000 bp。結(jié)果如圖3-C所示。條帶約為5 000 bp，與片段P32-manB-manA-Pnis-gmd-wcaG理論大小一致，證明菌株已成功進行單交換。將單交換菌株連續(xù)7次傳代，篩選能夠在5-氟尿嘧啶平板上生長而氯霉素平板上不生長的轉(zhuǎn)化子，用引物U-F和D-R進行PCR驗證，如果雙交換不成功，則條帶大小約為3 000 bp，與原始菌株L.lactis NZ9000在該位點的基因up-upp-down大小一致，表明菌株恢復(fù)成野生型，如果雙交換成功，條帶大小約為7 000 bp。結(jié)果如圖3-D所示，條帶約為7 000 bp，與片段up-P32-manB-manA-Pnis-gmd-wcaG-down理論大小一致，說明已成功完成雙交換，菌株NZ9000 1構(gòu)建成功。同理可得菌株NZ9000 2、NZ9000 3、NZ9000 4。

將片段manC、futC、lacF與表達載體pNZ8148-1連接并轉(zhuǎn)化到E.coli JM109后，用引物manC-F和lacF-R進行PCR驗證，如果構(gòu)建不成功，則無條帶產(chǎn)生，如果構(gòu)建成功，條帶大小約為3 000 bp。結(jié)果如圖3-E所示，PCR條帶約為3 000 bp，與片段manC-futC-lacF理論大小一致，表明質(zhì)粒pNZ8148-CfF1構(gòu)建成功。同理可得質(zhì)粒pNZ8148-CfF2。

利用發(fā)酵培養(yǎng)基，添加20 g/L的葡萄糖和5 g/L的乳糖，對菌株NZ9000 5、NZ9000 6、NZ9000 7、NZ9000 8、NZ9000 9、NZ9000 10、NZ9000 11、NZ9000 12進行搖瓶發(fā)酵，檢測2′-FL生產(chǎn)和菌株生長狀況，結(jié)果如圖5所示。8株菌株的2′-FL最高產(chǎn)量具有明顯的差異，NZ9000 6最多，產(chǎn)量約為0.28 g/L；NZ9000 8次之，為0.26 g/L；NZ9000 11最少，為0.09 g/L（圖5-A）。結(jié)果證明成功打通了L.lactis NZ9000從頭合成2′-FL的途徑。途徑酶表達水平的優(yōu)化是構(gòu)建生產(chǎn)菌株的重要步驟，該研究中，對途徑酶進行了不同程度的表達，構(gòu)建出8個不同的菌株，結(jié)果（圖5-A）顯示，通過雙啟動子以P32-manB-manA-Pnis-gmd-wcaG的方式在基因組上過表達相關(guān)基因，通過雙啟動子以Pnis-manC-P32-futC-lacF的方式在質(zhì)粒上過表達相關(guān)基因，構(gòu)建出的菌株NZ9000 6，最有利于高產(chǎn)2′-FL。為了分析途徑表達水平對菌株生長的影響，利用菌株NZ9000、NZ9000（pNZ8148-1）為對照，比較了產(chǎn)量最高的菌株NZ9000 6和產(chǎn)量最低菌株NZ9000 11的生長曲線。兩者的生長速率和穩(wěn)定期的生物量差別很小，但是均明顯低于原始菌株，說明2′-FL合成途徑的強化一定程度上影響了菌體生長（圖5-B）。

圖5 帶有從頭合成途徑菌株的2′-FL產(chǎn)量和生長曲線Fig.5 Productions and growth curves of different strains with 2′-FL de novo synthesis pathway

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 添加氯化高鐵血紅素提高菌株生產(chǎn)性能 乳酸菌呼吸鏈不完整，TCA循環(huán)途徑受限，氯化高鐵血紅素能夠幫助L.lactis形成完整的呼吸鏈，來提高菌株的性能，但是L.lactis本身不具有氯化高鐵血紅素合成能力。該研究中，為了提高最優(yōu)菌株NZ9000 6的水平，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL的氯化高鐵血紅素，測試了菌株生產(chǎn)和生長狀況。結(jié)果如圖6所示，隨著氯化高鐵血紅素濃度從0-2.5 μg/mL逐漸升高，菌株生長10 h后的OD600無明顯變化，2′-FL產(chǎn)量明顯逐漸增加，濃度為2.5 μg/mL時產(chǎn)量最高，為0.66 g/L。綜合來看，濃度為2.5 μg/mL的氯化高鐵血紅素最適合菌株生長和發(fā)酵產(chǎn)2′-FL。

圖6 氯化高鐵血紅素濃度對菌株生長和2′-FL生產(chǎn)的影響Fig.6 Effects of hemin chloride concentration on cell growth and 2′-FL production

2.3.2 胰蛋白胨和酵母粉濃度協(xié)同優(yōu)化提高菌株生產(chǎn)性能 由于L.lactis天然的代謝缺陷，其對營養(yǎng)要求較高。該研究中考察了胰蛋白胨和酵母粉濃度對菌株NZ9000 6生長和生產(chǎn)2′-FL的協(xié)同影響。在含有2.5 μg/mL氯化高鐵血紅素的發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，測試不同胰蛋白胨和酵母粉濃度組合（表2）的影響。胰蛋白胨濃度為15 g/L時，2′-FL的產(chǎn)量總體處在較高水平，其中，酵母粉濃度為6 g/L時，2′-FL的產(chǎn)量最高，為1.58 g/L，菌株生長也處于最高水平，菌株生長10 h后OD600為10.06。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中胰蛋白胨為15 g/L，酵母粉為6 g/L用于菌株NZ9000 6生長和生產(chǎn)2′-FL（圖7）。

圖7 胰蛋白胨和酵母粉濃度對菌株生長和2′-FL生產(chǎn)的影響Fig.7 Effects of tryptone and yeast extract concentration on cell growth and 2′-FL production

3 討論

3.1 L.lactis NZ9000菌株是2'-FL生產(chǎn)的優(yōu)勢宿主

2′-FL是一種含量最豐富的人乳寡糖，在嬰幼兒成長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。L.lactis作為可直接用于乳制品的食品級微生物，同時也是一種重要的工業(yè)底盤菌種。構(gòu)建生產(chǎn)人乳寡糖的L.lactis菌株具有重要意義，目前還沒有相關(guān)報道。出發(fā)菌株的特性對生產(chǎn)水平具有較大影響，本研究在常用的乳酸乳球菌底盤NZ3900和NZ9000中，利用含有fkp、futC和lacF基因的重組質(zhì)粒，構(gòu)建2′-FL補救合成途徑，2′-FL的產(chǎn)量分別為0.16 g/L和0.40 g/L，從而證實了L.lactis可用于生產(chǎn)2′-FL，結(jié)合菌株自身性狀和生長代謝分析，認為NZ9000更適合作為2′-FL生產(chǎn)的底盤菌。

3.2 優(yōu)化途徑關(guān)鍵酶的表達對提高2'-FL生產(chǎn)具有重要作用

補救合成途徑需要昂貴的巖藻糖作為底物，利用從頭途徑合成2′-FL是實現(xiàn)其規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的必然。以NZ9000為底盤，構(gòu)建了2′-FL的從頭合成途徑，其中涉及到大量基因，而基因的表達優(yōu)化是構(gòu)建菌株，提高產(chǎn)量的重要方法。根據(jù)分析，L.lactis中缺乏合成2′-FL的途徑，而E.coli作為獲取方便、途徑明確的常用菌株，具有2′-FL相對完整的基因，H.pylori中futC表達活性相對較高，因此為保證基因的高效穩(wěn)定表達，將E.coli來源的manA、manB、gmd和wcaG基因整合到L.lactis NZ9000染色體的upp位點上進行表達［29-31］，將manC和futC基因，以及為futC提供胞內(nèi)底物的乳糖透過酶lacF基因通過質(zhì)粒表達［32］。另外，manC和futC分別為途徑中固定GDP和釋放GDP分子的酶，分析其用質(zhì)粒高表達可能能夠提高途徑的效率。本研究利用不同的啟動子對途徑酶的表達水平進行調(diào)控，經(jīng)過48 h發(fā)酵后，2′-FL的產(chǎn)量出現(xiàn)了明顯的差異，最優(yōu)菌株NZ9000 6的2′-FL搖瓶產(chǎn)量為0.28 g/L，是最低產(chǎn)量菌株的3.11倍，結(jié)果證明途徑調(diào)控對于菌株產(chǎn)量影響較大，NZ9000 6的2′-FL從頭合成途徑得到了較好的優(yōu)化。改造后菌株NZ9000 6、NZ9000 11在生長速率和穩(wěn)定期的生物量方面明顯低于野生菌株NZ9000、NZ9000（pNZ8148-1），可能是因為2′-FL合成途徑的強化對菌體自身的代謝造成負擔，影響菌體生長。

3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基添加血紅素有利于2'-FL生產(chǎn)

乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，缺失部分呼吸鏈，無法解除氧氣對菌株的毒害作用，也不能形成完整的三羧酸循環(huán)，可能限制菌株作為工業(yè)菌株的生產(chǎn)水平［33］。付龍云［34］通過在乳酸乳球菌中添加氯化高鐵血紅素，使細胞具有了完整的呼吸鏈，提高了細胞的生存能力。本研究進一步優(yōu)化了培養(yǎng)基中氯化高鐵血紅素濃度，并協(xié)同優(yōu)化了胰蛋白胨和酵母粉濃度。添加2.5 μg/mL的氯化高鐵血紅素后，菌株生長有明顯的改善，2′-FL產(chǎn)量明顯提升，達到0.66 g/L。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化獲得了最佳的胰蛋白胨濃度15 g/L、酵母粉濃度6 g/L，菌株NZ9000 6生長和生產(chǎn)進一步改善。以往的研究中，利用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等作為底盤，通過2′-FL途徑過表達，利用適合底盤的發(fā)酵培養(yǎng)基，2′-FL搖瓶發(fā)酵水平一般為0.50-1.00 g/L［17-18,35］。本研究中，通過途徑優(yōu)化和培養(yǎng)基優(yōu)化，NZ9000 6的2′-FL搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到1.58 g/L。未來，通過基因工程改造底盤的代謝缺陷，并進一步敲除2′-FL支路途徑、提高底盤和2′-FL途徑的適配性等，有可能進一步提高菌種的生產(chǎn)水平。

4 結(jié)論

本研究篩選出更適合2′-FL生產(chǎn)的L.lactis NZ9000。通過優(yōu)化表達manA、manB、gmd、wcaG、manC、futC和lacF，在L.lactis NZ9000中構(gòu)建了從頭合成途徑，實現(xiàn)了2′-FL的積累；優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化高鐵血紅素濃度、協(xié)同優(yōu)化胰蛋白胨和酵母粉濃度，進一步提高了2′-FL的產(chǎn)量，為實現(xiàn)2′-FL在可直接用于乳制品的食品級微生物乳酸乳球菌中的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。