褪黑素緩解空腸黏膜上皮細(xì)胞氧化損傷的效果研究

康凌云 韓露露 韓德平 陳建勝 甘瀚凌 邢凱 馬友記 崔凱

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；4.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

動(dòng)物腸道是重要的營養(yǎng)物質(zhì)吸收部位，與生長發(fā)育密切相關(guān)。同時(shí)腸道作為重要的先天黏膜免疫屏障器官，在防御病原感染和細(xì)菌毒素等方面發(fā)揮重要作用［1］。其中，黏膜上皮細(xì)胞是直接接觸腸道內(nèi)環(huán)境的細(xì)胞，包括柱狀細(xì)胞、微皺褶細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等，它們的主要功能是吸收營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也具有抗原遞呈和分泌細(xì)胞因子的功能。另外，它們彼此間利用緊密連接蛋白相互嵌合形成一道物理性機(jī)械屏障［1-2］，減少腸道上皮的通透性，進(jìn)而減少腸道內(nèi)容物與黏膜固有層的接觸。一旦上皮細(xì)胞發(fā)生病理性損傷，引起緊密連接蛋白減少，會(huì)增加腸道黏膜的通透性［3］。此外，腸道黏膜表面分泌有免疫球蛋白，上皮細(xì)胞間分布有大量先天淋巴細(xì)胞，固有層散在有各種免疫細(xì)胞，黏膜下層發(fā)育形成具有特定免疫細(xì)胞的彌散淋巴組織結(jié)構(gòu)，它們構(gòu)成了腸道黏膜重要的免疫屏障［4］。黏膜上皮細(xì)胞受到刺激后，會(huì)分泌一系列的調(diào)控介質(zhì)，協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，共同來維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［5］。

在飼養(yǎng)管理過程中，畜禽容易遭受各種應(yīng)激源刺激，如夏季高溫、長途運(yùn)輸、限制飼喂和早期斷奶等［6-10］，它們均會(huì)引起腸黏膜屏障不同程度的損傷。這些應(yīng)激因素會(huì)打破腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，增加細(xì)菌粘附能力、黏膜上皮通透性和致病菌內(nèi)毒素，進(jìn)一步加重局部感染，誘導(dǎo)趨化大量炎性細(xì)胞遷移至感染部位，引起炎性損傷。嚴(yán)重時(shí)，黏膜上皮細(xì)胞死亡脫落，直接暴露黏膜固有層，增加腸腔內(nèi)病原微生物的感染機(jī)會(huì)，誘發(fā)過激的炎癥反應(yīng)［11］。其中，多種應(yīng)激因素的共同特點(diǎn)是引起局部自由基的蓄積，如超氧陰離子和羥自由基等，由此誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷［12］。所以，減少應(yīng)激反應(yīng)時(shí)自由基的產(chǎn)生和累積，可以保護(hù)黏膜上皮細(xì)胞損傷，有效地維護(hù)腸道黏膜屏障，減少飼養(yǎng)管理中的經(jīng)濟(jì)損失。

褪黑素具有提高機(jī)體免疫和抗氧化等多種生理功能，是目前眾多內(nèi)源性和合成的神經(jīng)保護(hù)劑中關(guān)注和研究的熱點(diǎn)［13-14］。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素（melatonin,MT）可以有效緩解氧化應(yīng)激、增強(qiáng)固有免疫功能，而且這種緩解氧化損傷的能力在不同物種之間呈現(xiàn)出很強(qiáng)的保守性。褪黑素發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性，主要是由免疫細(xì)胞上的褪黑素受體（MT1和MT2）介導(dǎo)，參與中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用［15-16］。在免疫抑制條件下，褪黑素通過結(jié)合T細(xì)胞表面MT受體促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的功能發(fā)揮，增加2型輔助性T細(xì)胞（T helper cell 2，Th2細(xì)胞）的免疫應(yīng)答［17］。同時(shí)，褪黑素還可通過調(diào)控免疫調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子的表達(dá)對免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)［18］。研究發(fā)現(xiàn)，采用褪黑素處理抗原致敏小鼠，可增加白介素-10（interleukin-10,IL-10）的表達(dá)，同時(shí)減少腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)Th2細(xì)胞反應(yīng)［19］。同時(shí)，褪黑素可增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力，促進(jìn)T細(xì)胞活化，增加主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）分子和白介素-1（interleukin-1, IL-1）的表達(dá)［20］。當(dāng)給予山羊褪黑素處理后，可以增加血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的含量，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力［21］。此外，腸道神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）遍布腸道組織，能夠?qū)⑹占降男畔⒀杆賯鬟f到自體的其它細(xì)胞［22］。最新研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，ENS可以作為免疫系統(tǒng)的感應(yīng)平臺(tái)作用于腸道上皮細(xì)胞，促進(jìn)杯狀細(xì)胞抗菌蛋白（antimicrobial protein，AMP）的表達(dá)，維持腸道穩(wěn)態(tài)［23］。施用外源靶向神經(jīng)遞質(zhì)受體的神經(jīng)調(diào)節(jié)化合物對腸道上皮細(xì)胞黏液和抗菌蛋白（AMP）的分泌產(chǎn)生廣泛影響［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在人為模擬熱應(yīng)激條件下，通過添加褪黑素處理，可以有效緩解熱應(yīng)激造成的綿羊顆粒細(xì)胞的死亡，同時(shí)也可抑制綿羊成纖維細(xì)胞的凋亡［21,24］。而當(dāng)給予小鼠和仔豬提前斷奶處理，并同時(shí)飼喂外源性褪黑素，可以明顯改善它們腸道黏膜屏障和免疫功能的受損情況，有效緩解提前斷奶造成的應(yīng)激反應(yīng)［25-26］。綜上，褪黑素可在抵抗畜禽腸道氧化應(yīng)激損傷，維持黏膜屏障方面發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 原代小鼠空腸黏膜上皮細(xì)胞，購自華普奧科生物科技（北京）有限公司。

1.1.2 試劑 褪黑素（購買于Sigma，配制方法：將褪黑素用無水乙醇稀釋至100 mmol/L，作為儲(chǔ)液保存在-20℃冰箱中），上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司），Gibco胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、青鏈霉素和細(xì)胞培養(yǎng)用PBS（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），硫酸亞鐵和30%過氧化氫（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），4%多聚甲醛固定液（索萊寶科技有限公司），CK-18抗體（proteintech），Alexa Fluor 594 conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（proteintech），MTT檢測試劑盒（索萊寶科技有限公司），Trizol RNA提取試劑盒（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器和工具 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），酶標(biāo)儀（美國BioRad iMark），倒置熒光顯微鏡（Leica），超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，德國），蘇州凈化雙人超凈工作臺(tái)（LR-1500CP），恒溫水浴鍋，細(xì)胞培養(yǎng)板（美國康寧）。

1.2 方法

1.2.1 原代空腸黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光鑒定 原代小鼠空腸黏膜上皮細(xì)胞，用含100 mL/L的胎牛血清和10 g/L青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿至80%-90%左右時(shí)，用0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞，按照1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。后續(xù)試驗(yàn)過程中所用細(xì)胞均在F6代內(nèi)。

將細(xì)胞按2×104個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次。加入800 μL 4%多聚甲醛溶液，室溫固定20 min。PBS清洗2次，加入800 μL 0.1% triton X-100室溫孵育10 min。PBS清洗2次，3%過氧化氫室溫處理15 min。PBS清洗2次，加入，4℃孵育過夜。PBS清洗3次，加入二抗37℃孵育1 h。PBS清洗3次，加入500 μL即用型DAPI溶液，室溫處理5 min。PBS清洗3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 細(xì)胞氧化損傷模型 將F3代空腸黏膜上皮細(xì)胞按2×104個(gè)/孔接種于96 孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿至80%左右，加入200 μL含不同濃度FeSO4和H2O2（0、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L）的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h。小心吸去上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、Formazan溶解液），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、Formazan溶解液），每組設(shè)定5個(gè)重復(fù)孔。

1.2.3 褪黑素緩解氧化損傷分析 將F5代空腸黏膜上皮細(xì)胞按2×104個(gè)/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞完全貼壁后，吸棄上清，每孔加入800 μL不同濃度的褪黑素（MT）溶液（終濃度分別為5、10、15、30、50、100、150、250、500 μmol/L），置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。同時(shí)設(shè)置空白組（CON）和氧化損傷模型組（FeSO4/H2O2），空白組不做任何處理。褪黑素處理2 h后，吸棄對照組和褪黑素處理組的細(xì)胞上清，分別加入2 mL含10 mmol/L FeSO4和H2O2的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后，吸取細(xì)胞上清，6 000 r/min離心10 min，棄沉淀，留取上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的ELISA檢測。

1.2.4 ELISA檢測 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后加待測細(xì)胞上清10 μL。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，用封板摸封板后37℃溫育60 min。洗滌液重復(fù)洗滌5次，盡量拍干。每孔分別加入顯色劑A和B各50 μL，37℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)，于450 nm波長測定各孔的吸光度。其中，檢測指標(biāo)包括MDA、SOD、CAT、GSH-Px、LDH、IL-6和IL-8。

1.2.5 核酸提取和RT-qPCR反應(yīng) 使用Trizol RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA；使用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)對提取的 RNA 濃度和純度進(jìn)行檢測，選取OD260/ OD280介于 1.8-2.1，OD260/ OD230大于2.0的RNA 樣品，并經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳對其完整性進(jìn)行檢測。選擇質(zhì)量合格的RNA樣品，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明中的兩步法完成cDNA第一鏈的合成。從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索羊TNF-α（NM_001024860.1）、IL-1β（NM_001009465.2）、IL-6（NM_001009392.1）的mRNA序列，并利用Pick Primers進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，之后通過NCBI上的Blast檢測引物特異性，最后由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒建議的體系進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。RT-qPCR擴(kuò)增體系：2×SR PreMix Plus 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA模板 1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL，每個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)至少重復(fù) 3 次。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel初步整理后，采用SAS 9.2軟件（SAS Inst.Inc., Cary, NC）進(jìn)行分析。使用one-way ANOVA模型分析，單因素為不同的處理方式，P ＜ 0.05和P ＜ 0.01為差異顯著，具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空腸黏膜上皮細(xì)胞可進(jìn)行分離培養(yǎng)

對原代分離培養(yǎng)的空腸黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣生長（圖1-A，1-B）。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞可穩(wěn)定傳代10代以上。經(jīng)CK-18免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞呈明顯強(qiáng)陽性表達(dá)（圖1-C，1-D），純度達(dá)到90%以上。說明分離的細(xì)胞是空腸黏膜上皮細(xì)胞，純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 空腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)及CK-18免疫熒光染色Fig.1 Jejunum epithelial cell morphology and CK-18 immunofluorescence staining

2.2 FeSO4 /H2O2處理可引起黏膜上皮細(xì)胞明顯氧化損傷

為了探索FeSO4/H2O2處理粘膜上皮細(xì)胞一定時(shí)間后造成的損傷情況，以不同濃度（0、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L）的FeSO4/H2O2處理接種細(xì)胞的96孔板，利用MTT法檢測其在相同作用時(shí)間下對黏膜上皮細(xì)胞的影響。結(jié)果如圖2所示，利用FeSO4/ H2O2處理黏膜上皮細(xì)胞，可明顯引起細(xì)胞氧化損傷，與空白組細(xì)胞相比（圖2-A），F(xiàn)eSO4/ H2O2處理后，黏膜上皮細(xì)胞皺縮變圓，大量細(xì)胞脫落（圖2-B）。

圖2 FeSO4/H2O2處理可明顯引起黏膜上皮細(xì)胞氧化損傷Fig.2 FeSO4/H2O2 treatment significantly causing the oxidative damage to mucosal epithelial cells

MTT結(jié)果表明，F(xiàn)eSO4/ H2O2處理后，細(xì)胞存活率明顯下降（圖2-C，P ＜ 0.05），且MDA的含量在FeSO4/ H2O2處理后顯著增加（圖2-D，P ＜0.05）；圖2-E的結(jié)果表明，細(xì)胞的致死率隨FeSO4/H2O處理濃度的增大而增大，且呈現(xiàn)出明顯的依賴性，不同處理組的細(xì)胞致死率與正常對照組差異顯著（P＜0.05）。2.5、5、10、20、40、80 mmol/L FeSO4/H2O2處理后，細(xì)胞的存活率分別為80.1%、70.5%、65.8%、58.9%、38.1%、21.6%（圖2-E），其中40、80 mmol/L FeSO4/ H2O2作用黏膜上皮細(xì)胞后，細(xì)胞成片脫落，大量死亡，造成不可逆損傷，無法利用藥物進(jìn)行修復(fù)。

綜合分析MTT和MDA結(jié)果，決定使用10 mmol/L 的FeSO4/H2O2處理空腸黏膜上皮細(xì)胞，建立氧化損傷模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.3 褪黑素對黏膜上皮細(xì)胞具有明顯的抗氧化保護(hù)作用

為了探索不同濃度外源添加褪黑素對空腸黏膜上皮細(xì)胞具有明顯的抗氧化保護(hù)作用，我們分別以不同的濃度（5、10、15、30、50、100、150、250、500 μmol/L）的褪黑素處理接種細(xì)胞的96孔板，利用MTT法檢測不同濃度褪黑素在不同作用時(shí)間下對黏膜上皮細(xì)胞的影響。如圖3-A所示，褪黑素濃度為5-15 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率＞90%，而當(dāng)其濃度超過100 μmol/L時(shí)，會(huì)對空腸黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生傷害；因此我們選擇10 mmol/L褪黑素作為后續(xù)的安全濃度。Calcein-AM/PI雙染結(jié)果顯示，褪黑素的添加明顯緩解了FeSO4/H2O2引起的氧化損傷，死細(xì)胞數(shù)量大幅度下降（圖3-B，3-C），這表明褪黑素對空腸黏膜上皮細(xì)胞具有明顯的抗氧化保護(hù)作用。

圖3 褪黑素處理可明顯緩解黏膜上皮細(xì)胞的氧化損傷Fig.3 Melatonin treatment significantly ameliorating the oxidative damage to mucosal epithelial cells

同時(shí)，與對照組相比，F(xiàn)eSO4/H2O2處理明顯引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，MDA的表達(dá)顯著增加（表2）；而添加不同濃度的褪黑素預(yù)處理后，MDA的表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。此外，F(xiàn)eSO4/H2O2的處理可引起黏膜上皮細(xì)胞中LDH的顯著提高，而預(yù)先加入0.01 mmol/L和1 mmol/L的褪黑素，可明顯減少LDH的釋放。FeSO4/H2O2處理能夠降低黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)SOD、GSH-Px和CAT的表達(dá)，而通過外源添加不同濃度的褪黑素后，可顯著提高GSH-Px在黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)（P＜0.05）。

表2 不同濃度褪黑素預(yù)處理對黏膜上皮細(xì)胞抗氧化因子的表達(dá)影響Table 2 Effects of pretreatment with different concentrations of melatonin on the expressions of antioxidant factors in mucosal epithelial cells

2.4 褪黑素可調(diào)節(jié)黏膜上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)

外源添加褪黑素可影響?zhàn)つど掀ぜ?xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)（圖4）。檢測發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L 的FeSO4和H2O2氧化損傷模型并沒有明顯影響?zhàn)つど掀ぜ?xì)胞IL6和IL8的含量變化。但是，與對照組和氧化損傷模型組相比，1 mmol/L的褪黑素處理后，黏膜上皮細(xì)胞顯著降低了IL-6的表達(dá)（P＜0.05）。而10 mmol/L褪黑素添加可顯著增加黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)IL-8的含量（P＜0.05）。應(yīng)用 RT-qPCR，以內(nèi)參基因β-actin對各組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)量進(jìn)行校正；結(jié)果如圖5所示，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 表達(dá)水平與ELISA檢測結(jié)果基本一致，說明外源添加褪黑素可影響?zhàn)つど掀ぜ?xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)。

圖4 褪黑素調(diào)節(jié)黏膜上皮細(xì)胞氧化損傷時(shí)IL-6和IL-8的表達(dá)Fig.4 Melatonin regulating the expressions of IL-6 and IL-8 during oxidative injury of mucosal epithelial cells

圖5 褪黑素調(diào)節(jié)粘膜上皮細(xì)胞氧化損傷時(shí)TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表達(dá)水平Fig.5 Melatonin regulateing the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 during oxidative injury of mucosal epithelial cells

3 討論

氧化應(yīng)激主要與活性氧的大量累積有關(guān)?；钚匝酰╮eactive oxygen species, ROS）主要包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基，其作為重要的第二信使可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)特定信號(hào)通路，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而維持細(xì)胞的特定生理功能［27］。而當(dāng)ROS產(chǎn)生過多時(shí)，超過了機(jī)體的抗氧化能力，會(huì)引起ROS在體內(nèi)的異常蓄積。此時(shí)，ROS失去了正常的生理調(diào)節(jié)功能，反而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核DNA和線粒體DNA突變或缺失，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和蛋白氧化損傷，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)膜流動(dòng)性改變、重要酶失活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織結(jié)構(gòu)損傷［28］。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可引起機(jī)體氧化損傷，與多種病理過程密切相關(guān)。如心肌缺血再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡、睪丸支持細(xì)胞和精子細(xì)胞的損傷、神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷、卵巢衰老及儲(chǔ)備功能下降等［29-33］。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eSO4和H2O2反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基和羥自由基，可引起腸黏膜上皮細(xì)胞的明顯損傷，導(dǎo)致細(xì)胞皺縮變圓，并形成凋亡小體，說明自由基確實(shí)可引起腸黏膜上皮細(xì)胞的明顯凋亡和壞死。

機(jī)體內(nèi)存在重要的抗氧化防御機(jī)制，主要包括抗氧化酶和各種抗氧化活性物質(zhì)［34-35］。其中，抗氧化酶包括SOD、CAT、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、GSH-Px等?？寡趸钚晕镔|(zhì)包括褪黑素、α硫辛酸、谷胱甘肽、類胡蘿卜素、維生素C和E、微量元素銅鋅硒錳等。我們發(fā)現(xiàn)FeSO4和H2O2引發(fā)的氧化損傷，可引起腸黏膜上皮細(xì)胞抗氧化酶的表達(dá)下降，而通過添加褪黑素后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)明顯增加，抗氧化能力明顯增強(qiáng)。

此外，炎癥反應(yīng)伴有大量炎性細(xì)胞的浸潤和免疫應(yīng)答，它們在發(fā)揮免疫效應(yīng)的同時(shí)，細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生大量自由基［36］。如果機(jī)體此時(shí)抗氧化能力下降或由于組織損傷缺失抗氧化能力，便會(huì)進(jìn)一步加劇炎性損傷。伴隨著活性氧自由基的積累，動(dòng)物血液中IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ等促炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平升高，進(jìn)而誘發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)［37-38］；而IL-8則被認(rèn)為是非常重要的中性粒細(xì)胞分化誘導(dǎo)物，具有抗炎作用［39］。我們的研究結(jié)果表明，褪黑素可以引起腸黏膜上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)下降，而趨化因子IL-8的表達(dá)上升，說明褪黑素可以減少炎性因子對上皮細(xì)胞的損害，還可通過趨化誘導(dǎo)其它免疫細(xì)胞的遷移來修復(fù)局部黏膜上皮的損傷。RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，添加褪黑素后，細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平均較之氧化應(yīng)激組有所下調(diào)，說明褪黑素可以減緩氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腸道免疫損傷。

4 結(jié)論

褪黑素可以明顯減輕自由基引起的細(xì)胞氧化損傷，下調(diào)氧化產(chǎn)物MDA的表達(dá)水平，增加抗氧化酶的含量。而且上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平降低，趨化因子的表達(dá)明顯增加。綜上，褪黑素可以保護(hù)自由基引起的空腸黏膜上皮細(xì)胞氧化損傷，并能夠減輕細(xì)胞損傷引起的炎癥反應(yīng)。