檸檬酸鐵銨對(duì)懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響機(jī)制探究

陳中元 王玉紅 代為俊 張艷敏 葉倩 劉旭平 譚文松 趙亮，

（1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；2.青島易邦生物工程有限公司，青島 266114；3.上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203）

HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，前景廣闊［1］。其中PEI介導(dǎo)的HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)［2］廣泛應(yīng)用于基因治療載體大規(guī)模生產(chǎn)［3］和臨床實(shí)驗(yàn)藥品生產(chǎn)領(lǐng)域［4-5］，是獲得大量目標(biāo)產(chǎn)物較為經(jīng)濟(jì)、高效的手段［6］。無血清全懸浮HEK293細(xì)胞培養(yǎng)過程具有高密度、易操作、易放大等優(yōu)勢，在該懸浮培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行外源DNA的轉(zhuǎn)染，有利于快速獲得大量目標(biāo)產(chǎn)品，已成為當(dāng)前的發(fā)展趨勢［7］。在轉(zhuǎn)染過程中達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率，是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、高滴度的前提［8］。然而懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，限制了該技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用［9］。在實(shí)際操作中，為消除懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中生長培養(yǎng)基的抑制作用，最常見的方法是轉(zhuǎn)染前進(jìn)行離心并更換培養(yǎng)液［10］，但該方法存在易污染、難放大等缺點(diǎn)，不適合規(guī)?；a(chǎn)。截至目前，對(duì)貼壁HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響因素的研究已較為深入［11］，但對(duì)影響懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的培養(yǎng)基關(guān)鍵組分研究報(bào)道相對(duì)較少。因此亟待探究懸浮HEK293細(xì)胞培養(yǎng)基中影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵組分，并分析其影響轉(zhuǎn)染效率的原因，據(jù)此開發(fā)合適的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基以及最優(yōu)轉(zhuǎn)染工藝。使HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)更加便捷可行，成為商業(yè)化生產(chǎn)中的首選。

近年來對(duì)轉(zhuǎn)染效率的研究大多集中在轉(zhuǎn)染過程的影響因素上。對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，良好的細(xì)胞狀態(tài)是成功轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵因素之一，轉(zhuǎn)染時(shí)使細(xì)胞處于指數(shù)生長期可提高轉(zhuǎn)染效率［12-15］。van Gaal［16］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前PEI與DNA的孵育液將影響轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率高低取決于DNA和PEI的比例、孵育時(shí)間以及孵育液pH值、離子強(qiáng)度和體積。此外，研究表明培養(yǎng)基的組分也是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。例如Pham等［17］在2003年發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)蛋白胨（酪蛋白來源）會(huì)影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，隨后在2004年發(fā)現(xiàn)防止細(xì)胞聚集所添加的肝素或硫酸葡聚糖等會(huì)干擾PEI-DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，極大地降低轉(zhuǎn)染效果［18］。Eberhardy等［19］在2009年發(fā)現(xiàn)，鐵的不同添加方式對(duì)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率存在顯著影響。對(duì)培養(yǎng)基中抑制轉(zhuǎn)染的組分濃度、添加方式等進(jìn)行優(yōu)化，是提高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。由于蛋白胨、肝素、硫酸葡聚糖并非細(xì)胞生長必需的物質(zhì)，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基開發(fā)時(shí)一般選擇將其去除。但鐵元素是無血清培養(yǎng)基中必須添加的物質(zhì)［20］。與其他鐵供體相比，檸檬酸鐵銨成分明確，可提高細(xì)胞存活率，并且其添加可以顯著提高抗體產(chǎn)量，因此檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基開發(fā)中不可或缺［21］。檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中一般單獨(dú)添加，添加量在50-100 μmol/L，此濃度會(huì)強(qiáng)烈抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過程。為解決此問題，Capella Roca等［22］采用轉(zhuǎn)染前離心換液的方式，解除其抑制作用。但這僅限于實(shí)驗(yàn)室水平的研究，因?yàn)殡x心換液等操作在大規(guī)模生產(chǎn)中難以適用，且存在較大的污染風(fēng)險(xiǎn)。綜上，一般采用離心換液和轉(zhuǎn)染工藝優(yōu)化的方式來提高轉(zhuǎn)染效率，但懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)若想大規(guī)模應(yīng)用，離心換液并不現(xiàn)實(shí)。因此，培養(yǎng)基組分對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響的深入研究仍是繞不開的話題。

本文從實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的懸浮HEK293細(xì)胞生長培養(yǎng)基（Celers101培養(yǎng)基）出發(fā)，首先對(duì)該培養(yǎng)基中影響懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的組分檸檬酸鐵銨進(jìn)行研究，然后對(duì)其如何影響轉(zhuǎn)染過程和目的基因表達(dá)的原因進(jìn)行分析，并據(jù)此提出轉(zhuǎn)染時(shí)培養(yǎng)基關(guān)鍵組分更可行的添加方式。本研究深入地認(rèn)識(shí)懸浮HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過程，了解DNA進(jìn)入細(xì)胞過程中的影響因素，為懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的理性設(shè)計(jì)與開發(fā)及轉(zhuǎn)染工藝的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 HEK293貼壁細(xì)胞由浙江理工大學(xué)提供，后經(jīng)本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的無血清培養(yǎng)基馴化為HEK293懸浮細(xì)胞；綠色熒光蛋白的表達(dá)質(zhì)粒由浙江理工大學(xué)提供；FAM標(biāo)記的DNA購買自北京擎科生物科技有限公司；檸檬酸鐵銨、檸檬酸鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鐵、檸檬酸鐵銨、氯化鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白、EDTA鈉鐵均購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：FG0110103）、Celers101培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：TP0102901）購自上海倍諳基生物科技有限公司；PEIMax（產(chǎn)品編號(hào)：24765-100）購自美國PolyScience公司；細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期試劑盒（細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)：C1052）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 倒置熒光顯微鏡：Olympus；流式細(xì)胞儀：Beckman Coulter；Size/Zeta電位儀：AntonPaar；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：Counter Star；0.22 μm濾膜：Millipore。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及溶液的配制 將Celers101培養(yǎng)基粉末加入對(duì)應(yīng)體積的超純水中充分?jǐn)嚢枞芙?0 min，按照配制說明依次加入其他物質(zhì)，再向已充分溶解的溶液中添加實(shí)驗(yàn)所需的特定組分（根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)添加對(duì)應(yīng)組分，對(duì)照組不添加），攪拌20 min后調(diào)節(jié)pH至7.0-7.4，滲透壓在300-320 mOsm/kg。通過0.22 μm濾膜過濾除菌，在4℃冰箱中避光保存。

PEI溶液（1 mg/mL）：稱取10 mg PEIMax試劑，加入到9 mL超純水中待其溶解后，定容至10 mL，pH調(diào)節(jié)至6.9-7.1。通過0.22 μm濾膜過濾除菌后，用滅菌的1.5 mL離心管進(jìn)行分裝。在4℃冰箱中保存。

PEI-DNA復(fù)合物配制：按照20 mL細(xì)胞培養(yǎng)體系計(jì)算，將60 μL PEI溶液和20 μg質(zhì)粒溶液分別添加至兩份DMEM培養(yǎng)基中（控制反應(yīng)總體積均為500 μL），移液器吸打混勻后靜置10 min，然后用移液槍再把兩溶液混勻靜置10 min，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將指數(shù)生長期的懸浮HEK293細(xì)胞離心后重懸于20 mL新鮮的Celers101培養(yǎng)基中（根據(jù)實(shí)驗(yàn)添加對(duì)應(yīng)組分，對(duì)照組不添加），細(xì)胞密度控制為1×106cells/mL，然后將提前配好的PEIDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液中完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，搖床130 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過熒光顯微鏡拍照或通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期測定 將指數(shù)生長期的懸浮HEK293細(xì)胞離心后重懸于20 mL含80 μmol/L檸檬酸鐵銨（Control組不添加）的Celers101培養(yǎng)基，細(xì)胞密度控制為1×106cells/mL，放在搖床上培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒步驟進(jìn)行細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡比例測定。

1.2.4 瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 配制PEI-DNA復(fù)合物時(shí)，將檸檬酸鐵銨（終濃度為80 μmol/L）加入DMEM培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組。制作1%（m/V）瓊脂糖凝膠，把配制好的PEI-DNA復(fù)合物加入點(diǎn)樣孔中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120 V，30 min后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.2.5 PEI-DNA復(fù)合物粒徑與Zeta電位分析 將配制好的PEI-DNA復(fù)合物加入到20 mL含80 μmol/L檸檬酸鐵銨（Control組不添加）的Celers101培養(yǎng)基中，置于搖床上130 r/min培養(yǎng)1 h，用Size/Zeta電位儀分別測定粒子粒徑和表面電位。

1.2.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PEI-DNA復(fù)合物數(shù)量的分析 將指數(shù)生長期的懸浮HEK293細(xì)胞離心后更換為20 mL含80 μmol/L檸檬酸鐵銨（Control組不添加）的Celers101培養(yǎng)基，用FAM標(biāo)記的DNA配制PEIDNA復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染30 min后PBS洗3遍，取樣通過流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度。

1.2.7 轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá)狀態(tài)的觀察 將40 mL指數(shù)生長期的懸浮HEK293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染3 h后等分為兩份，1 000 r/min離心5 min，用20 mL含80 μmol/L檸檬酸鐵銨（Control組不添加）的Celers101培養(yǎng)基重懸，搖床130 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過流式檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨對(duì)轉(zhuǎn)染效率的抑制作用

在Celers101培養(yǎng)基中添加檸檬酸鐵銨對(duì)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染影響的結(jié)果如圖1所示，圖中表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞視為成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果（圖1-A）表明，添加檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組視野綠色熒光微弱，表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)量少，可知其轉(zhuǎn)染效率較低，即細(xì)胞在含檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基中其轉(zhuǎn)染過程受到抑制。因此，培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨的添加對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染具有明顯抑制作用。

圖1 添加檸檬酸鐵銨對(duì)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響Fig.1 Effects of adding ferric ammonium citrate on HEK293 cell transfection

2.2 檸檬酸鐵銨濃度對(duì)懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

進(jìn)一步考察不同濃度檸檬酸鐵銨對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，結(jié)果（圖2）表明，細(xì)胞在不同濃度檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染效率差異顯著，當(dāng)檸檬酸鐵銨濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率接近100%；隨著檸檬酸鐵銨濃度的提高，轉(zhuǎn)染效率逐漸降低；直到檸檬酸鐵銨濃度為80 μmol/L時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率接近0。因此，檸檬酸鐵銨對(duì)懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率具有明顯的抑制作用，且隨濃度的升高而增強(qiáng)，檸檬酸鐵銨濃度不高于20 μmol/L時(shí)對(duì)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染不產(chǎn)生抑制作用。

圖2 濃度檸檬酸鐵銨對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響Fig.2 Effect of ferric ammonium citrate concentration on transfection efficiency

2.3 檸檬酸鐵銨影響轉(zhuǎn)染過程和目的基因表達(dá)的原因分析

2.3.1 檸檬酸鐵銨影響轉(zhuǎn)染的原因 含檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、氯化鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白、EDTA鈉鐵的實(shí)驗(yàn)組與含檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵的實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染效率存在顯著差異（圖3）。含檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、氯化鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白、EDTA鈉鐵的實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染效率均大于80%，而含檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵的實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染效率小于20%，說明細(xì)胞在含檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染受到抑制。

圖3 不同檸檬酸根供體和鐵供體對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響Fig.3 Effects of different citrate donors and iron donors on transfection efficiency

檸檬酸鐵銨屬于一種復(fù)鹽，是檸檬酸鐵和檸檬酸銨的混合物，其中兩個(gè)物質(zhì)的占比因合成條件不同而異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀都含有檸檬酸根，氯化鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白、EDTA鈉鐵都含有鐵離子，但以上物質(zhì)添加均未對(duì)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染造成明顯抑制作用；只有檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過程存在顯著抑制作用。這表明檸檬酸根和鐵離子同時(shí)存在時(shí)才會(huì)抑制HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染，而檸檬酸根或者鐵離子單獨(dú)存在并不會(huì)抑制轉(zhuǎn)染。

2.3.2 檸檬酸鐵銨對(duì)轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞狀態(tài)的影響 結(jié)果（圖4-A）表明，在含檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞處于G0/G1期、S期、G2/M期的比例與對(duì)照組相比，差異均不顯著。因此檸檬酸鐵銨對(duì)細(xì)胞狀態(tài)未存在明顯抑制作用。

圖4 檸檬酸鐵銨對(duì)細(xì)胞周期（A）和細(xì)胞凋亡（B）的影響Fig.4 Effect of ferric ammonium citrate on cell cycle（A）and apoptosis（B）

檸檬酸鐵銨對(duì)細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-B所示。在含檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組中，早期凋亡、晚期凋亡的細(xì)胞比例與對(duì)照組相比，差異均不顯著。在Celers101培養(yǎng)基中細(xì)胞死亡比例為52.8%，而在含有檸檬酸鐵銨的Celers101培養(yǎng)基中細(xì)胞死亡比例為47.98%。其中死亡細(xì)胞包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞死亡比例略低于對(duì)照組，可能由于壞死細(xì)胞水平略低。上述結(jié)果顯示，檸檬酸鐵銨對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡水平均無顯著影響，可能有利于降低細(xì)胞壞死水平。

2.3.3 檸檬酸鐵銨對(duì)PEI-DNA復(fù)合物形成的影響 當(dāng)PEI與DNA質(zhì)量比為0.2時(shí)，樣品的電泳結(jié)果均出現(xiàn)了明顯的DNA條帶（圖5）。隨著PEI添加量逐漸升高，泳道中的條帶清晰度逐漸變小。當(dāng)PEI為DNA質(zhì)量比3倍時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的泳道均沒有條帶。

圖5 檸檬酸鐵銨對(duì)PEI與DNA結(jié)合的影響Fig.5 Effects of ferric ammonium citrate on the binding of PEI to DNA

PEI對(duì)DNA的質(zhì)量比越大，與DNA結(jié)合越緊密，過量地PEI將DNA包裹起來，電泳時(shí)表現(xiàn)為向正極遷移的DNA條帶清晰度逐漸減少至消失。當(dāng)PEI與DNA質(zhì)量比為0.2時(shí)，PEI無法完全包裹DNA，造成電泳后條帶明顯。質(zhì)量比為1.2時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的條帶有比較明顯的差別。當(dāng)質(zhì)量比為3時(shí)（即細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的用量），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)應(yīng)的泳道中均沒有條帶。因此，檸檬酸鐵銨對(duì)PEI和DNA結(jié)合程度的影響與PEI和DNA的比例有關(guān)，且當(dāng)PEI的添加量提高到DNA的3倍（細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的用量）時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的DNA與PEI均充分結(jié)合，檸檬酸鐵銨未影響此時(shí)PEI和DNA的結(jié)合。

加入檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組PEI-DNA復(fù)合物的粒徑（圖6-A）與對(duì)照組存在顯著差異。對(duì)照組有一部分復(fù)合物粒徑在100-500 nm范圍內(nèi)，而含有檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物粒徑均大于500 nm；根據(jù)圖6-C可知，含有檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物平均粒徑是對(duì)照組的2倍左右。

圖6 檸檬酸鐵銨對(duì)復(fù)合物的粒徑分布（A）、表面電位分布（B）、平均粒徑（C）變化和平均電勢（D）變化的影響Fig.6 Changes of particle size distribution（A）, zeta potential distribution（B）, average particle size（C）and average potential（D）after ferric ammonium citrate（FAC）added

圖6-B的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物電勢峰值略低于對(duì)照組，其復(fù)合物電勢分布曲線峰形更“細(xì)長”，這說明添加檸檬酸鐵銨后使復(fù)合物粒子電勢分布更加集中。根據(jù)圖6-D可知，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的復(fù)合物平均電勢均為正值，兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)值差異不顯著。

實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中復(fù)合物的數(shù)量與對(duì)照組差異顯著（圖7）。含檸檬酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度僅為對(duì)照的14.07%，說明檸檬酸鐵銨使細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物數(shù)量明顯減少。

圖7 檸檬酸鐵銨對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中復(fù)合物數(shù)量的影響Fig.7 Effects of FAC on the number of complexes in transfected cells

2.3.4 檸檬酸鐵銨對(duì)轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá)的影響 結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染3 h后加入檸檬酸鐵銨，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（圖8-A）和細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（圖8-B）同對(duì)照組相比均無顯著差異。因此，檸檬酸鐵銨的添加未影響復(fù)合物在進(jìn)入細(xì)胞后的蛋白表達(dá)相關(guān)過程。

圖8 檸檬酸鐵銨在轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（A）和平均熒光強(qiáng)度（B）的影響Fig.8 Effects of FAC on the cell transfection efficiency（A）and mean fluorescence intensity（B）after transfection

3 討論

3.1 檸檬酸鐵銨對(duì)懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的抑制作用及解決方案

截至目前，培養(yǎng)基組分對(duì)懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響的文獻(xiàn)報(bào)道較少。在對(duì)CHO細(xì)胞的研究中，Eberhardy等［19］發(fā)現(xiàn)了檸檬酸鐵銨的抑制作用，與本研究結(jié)論一致。這表明檸檬酸鐵銨對(duì)不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程的抑制作用可能具有普適性。但本文結(jié)果表明，抑制濃度探究結(jié)果與Eberhardy等［19］在CHO細(xì)胞中的結(jié)論有顯著差異，檸檬酸鐵銨對(duì)貼壁CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率的影響十分顯著，僅1 μmol/L的檸檬酸鐵銨就會(huì)顯著抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，但根據(jù)本文實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過程對(duì)其濃度的敏感性較低。這種差異一方面可能是貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞的差異造成的，另一方面可能與細(xì)胞膜控制不同粒徑的物質(zhì)進(jìn)出差異有關(guān)［23］。

由于檸檬酸鐵銨對(duì)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的顯著抑制作用，Eberhardy等［19］在文中找到兩種策略，第一種策略為轉(zhuǎn)染前通過離心換液的方式去除環(huán)境中多余的檸檬酸鐵銨，轉(zhuǎn)染后再補(bǔ)加以維持細(xì)胞的產(chǎn)物表達(dá)過程；第二種策略則是換用其他鐵添加劑。但這兩種方式在實(shí)際執(zhí)行中均有不足之處，離心和補(bǔ)加不適合大規(guī)模轉(zhuǎn)染過程，在實(shí)際執(zhí)行中有耗時(shí)、耗能、需專業(yè)設(shè)備、影響細(xì)胞狀態(tài)、增加污染風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)；根據(jù)Bai等［21］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對(duì)鐵元素利用分為轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形式和非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形式。細(xì)胞首先利用轉(zhuǎn)鐵蛋白形式的鐵元素，當(dāng)此形式不存在時(shí)利用后者。在非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形式中，鐵元素需與檸檬酸鹽螯合，否則無法被細(xì)胞有效吸收，使細(xì)胞正常生長。本文研究結(jié)果表明，氯化鐵、EDTA鈉鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白均未影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染。但氯化鐵、EDTA鈉鐵中的鐵元素不易被細(xì)胞利用。因此若換用其他鐵添加劑，以轉(zhuǎn)鐵蛋白效果最佳。但轉(zhuǎn)鐵蛋白為動(dòng)物源性成分，需考慮批次間穩(wěn)定性和長時(shí)間存放不穩(wěn)定易失活等問題。因此如何在實(shí)際問題中找到鐵添加劑對(duì)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程的最優(yōu)解仍是難題，而懸浮HEK293細(xì)胞不存在此類困擾。通過本文研究，將培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨濃度控制在20 μmol/L內(nèi)可解決該問題。

3.2 檸檬酸鐵銨影響轉(zhuǎn)染過程和目的基因表達(dá)的原因分析

本文分別從檸檬酸鐵銨對(duì)細(xì)胞狀態(tài)、PEI-DNA復(fù)合物形成、轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá)幾方面進(jìn)行探究。結(jié)果表明檸檬酸鐵銨對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡水平均無顯著影響，可能有利于降低細(xì)胞壞死水平，這說明檸檬酸鐵銨不會(huì)使細(xì)胞狀態(tài)變差，和Eberhardy等［19］在CHO細(xì)胞中的結(jié)論一致。在轉(zhuǎn)染一段時(shí)間后補(bǔ)充檸檬酸鐵銨, 不僅不會(huì)抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率, 還可以為細(xì)胞提供鐵元素, 反而有利于產(chǎn)物的表達(dá)過程。檸檬酸鐵銨作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常見的鐵添加劑，鐵離子與DNA復(fù)制和一些酶的活性有關(guān)，對(duì)細(xì)胞的生長起促進(jìn)作用［24］。這為轉(zhuǎn)染工藝優(yōu)化提供了新思路，在轉(zhuǎn)染后適當(dāng)補(bǔ)充檸檬酸鐵銨可成為提高產(chǎn)物表達(dá)的方法之一。

Size/Zeta電位儀測量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明檸檬酸鐵銨改變了PEI-DNA復(fù)合物的粒徑和電勢，大量研究表明轉(zhuǎn)染試劑PEI與DNA結(jié)合時(shí)，復(fù)合物的粒徑在100-500 nm范圍內(nèi)且攜帶正電荷是其進(jìn)入細(xì)胞的必要條件［25］。粒徑過大會(huì)導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞難度變大，粒徑過小不利于DNA在細(xì)胞內(nèi)釋放，而復(fù)合物電勢較低或變?yōu)樨?fù)值均會(huì)影響其與細(xì)胞膜的結(jié)合作用［26］。因此，檸檬酸鐵銨抑制HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染主要是由于其影響PEI-DNA復(fù)合物的形成過程，使復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的難度增加。

綜上所述，本文將檸檬酸鐵銨對(duì)懸浮HEK293細(xì)胞的抑制濃度和抑制作用進(jìn)行了系統(tǒng)的探究，消除了HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染工藝優(yōu)化過程中添加鐵化合物的諸多顧慮，也為后續(xù)PEI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染過程分析以及目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提高的工藝優(yōu)化提供了新路徑。

4 結(jié)論

本研究表明檸檬酸鐵銨對(duì)懸浮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程的抑制作用明顯，其抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)，抑制作用是由于檸檬酸鐵銨使PEIDNA復(fù)合物的粒徑變大，復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的難度增加，從而使進(jìn)入細(xì)胞的復(fù)合物數(shù)量減少造成的。對(duì)于HEK293細(xì)胞，檸檬酸鐵銨仍是最優(yōu)的鐵添加劑，控制轉(zhuǎn)染時(shí)檸檬酸鐵銨濃度在20 μmol/L內(nèi)即可解決其對(duì)轉(zhuǎn)染過程的抑制作用。且在轉(zhuǎn)染后3 h，補(bǔ)加檸檬酸鐵銨不影響轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá)。