多基因同步調(diào)控結(jié)合高通量篩選構(gòu)建高產(chǎn)L-苯丙氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株

薛寧 王瑾 李世新 劉葉 程海嬌 張玥 毛雨豐王猛

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；3.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所低碳合成工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

L-苯丙氨酸（L-Phe）在人類和大多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)不能通過(guò)自身合成，是一種必需氨基酸，是重要的食品、化學(xué)品及藥品中間體［1］。目前，L-Phe可以通過(guò)天然蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵法合成［2-3］。而微生物發(fā)酵法由于其對(duì)環(huán)境友好、原料成本低、反應(yīng)條件溫和、容易大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，成為工業(yè)化生產(chǎn)L-Phe的主要方法［4］。

L-Phe的生物合成途徑是最復(fù)雜的氨基酸合成途徑之一，大致可以分為中心碳源代謝途徑、莽草酸途徑和分支酸途徑這3個(gè)模塊（圖1）。目前提高其生物合成的代謝調(diào)控策略主要集中在提高前體物質(zhì)的積累、解除關(guān)鍵酶的反饋抑制作用和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造等方面［5-7］。其基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)大多依賴于游離型質(zhì)粒對(duì)目標(biāo)基因（簇）進(jìn)行過(guò)表達(dá)，或者常規(guī)的基因組編輯技術(shù)對(duì)不同模塊內(nèi)的多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行逐輪迭代改造。但L-Phe代謝途徑較長(zhǎng)而且調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，僅依靠質(zhì)?；蛘咧芷诼L(zhǎng)的逐輪改造［8］，難以實(shí)現(xiàn)不同模塊之間的通量平衡，在一定程度上限制了其產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-Phe生物合成途徑Fig.1 L-phenylalanine biosynthesis pathway in C.glutamicum

目前工業(yè)化生產(chǎn)L-Phe的主要菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌，其中谷氨酸棒桿菌具有生物安全、底物譜廣泛、營(yíng)養(yǎng)需求低、基因組編輯技術(shù)豐富等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的微生物生產(chǎn)底盤［9-11］。近年來(lái)CRISPR/Cas［12-14］系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，極大地豐富了谷氨酸棒桿菌的基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，但基因組上的多基因同步調(diào)控方面仍然面臨很大挑戰(zhàn)。為此，本課題組前期基于CRISPR/Cas系統(tǒng)和胞苷脫氨酶的堿基編輯技術(shù)，在谷氨酸棒桿菌中開發(fā)了一套多基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)BETTER［15］。針對(duì)每個(gè)基因分別賦予8個(gè)G堿基構(gòu)成的待編輯核糖體結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)一輪堿基編輯后，成功實(shí)現(xiàn)10個(gè)基因的同步調(diào)控，以色素沉積情況為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最優(yōu)高產(chǎn)番茄紅素的菌株獲得了2.9 mg/g CDW的產(chǎn)率，優(yōu)于早先報(bào)道的谷氨酸棒桿菌產(chǎn)番茄紅素的最高紀(jì)錄（2.4 mg/g CDW）［16］。該方法使谷氨酸棒桿菌的多基因表達(dá)的大規(guī)模微調(diào)變得簡(jiǎn)易可行，但后續(xù)產(chǎn)品的篩選通量又面臨了新的挑戰(zhàn)。為此，本課題組近期針對(duì)L-Phe開發(fā)了一種可在體外使用的基于循環(huán)排列熒光蛋白（circularly permuted fluorescent protein, cpFP）的基因編碼L-Phe生物傳感器［17］，既可以應(yīng)用于胞內(nèi)反映L-Phe的濃度水平，也可將其純化在體外直接測(cè)定樣品中的L-Phe濃度，實(shí)現(xiàn)L-Phe濃度的準(zhǔn)確測(cè)定，其中L-Phe傳感器的底物結(jié)合域可以特異性結(jié)合L-Phe并發(fā)生蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，而對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化敏感的cpFP可將偶連的蛋白構(gòu)象變化轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑盘?hào)的變化。并與液滴微流控高通量篩選技術(shù)結(jié)合［18-19］，有望實(shí)現(xiàn)L-Phe高產(chǎn)菌株的快速篩選。

本研究采用BETTER多基因調(diào)控技術(shù)，針對(duì)谷氨酸棒桿菌中L-Phe生物合成途徑的3個(gè)模塊的7個(gè)關(guān)鍵基因ppsA、tktA、aroFfbr、aroE、aroL、pheAfbr和tyrB的RBS進(jìn)行同步調(diào)控，產(chǎn)生大量的不同RBS組合的菌株突變文庫(kù)，并通過(guò)L-Phe生物傳感器結(jié)合液滴微流控篩選技術(shù)，篩選L-Phe合成顯著提升的突變株，以期為L(zhǎng)-Phe工程育種提供一種可行策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究所用菌株和質(zhì)粒均為作者實(shí)驗(yàn)室保藏和構(gòu)建，詳見表1。

表1 本研究用到的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 酶、引物及相關(guān)試劑盒 Q5 High-Fidelity DNA聚合酶構(gòu)自NEB公司，2×Es Taq Master Mix（Dye）購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司；引物由北京擎科生物有限公司合成，詳見表2。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、基因組DNA快速抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，重組試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母提取物5；BHI 培養(yǎng)基（g/L）：BHI 37，（NH4）2SO410，K2HPO40.2，NaH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，pH 7.2；BHIS培養(yǎng)基（g/L）：山梨醇 91.1，BHI 18.5，pH 7.2；LBHIS培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，NaCl 5，酵母粉2.5，BHI 18.5，山梨醇91.1，pH 7.2；NCM培養(yǎng)基（g/L）：具體配方詳見參考文獻(xiàn)［20］；CGX II培養(yǎng)基（g/L）：具體配方詳見參考文獻(xiàn)［21］。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 對(duì)L-Phe生物合成途徑的3個(gè)模塊的7個(gè)關(guān)鍵基因ppsA、tktA、aroFfbr、aroE、aroL、pheAfbr和tyrB 作為目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行遺傳改造，如圖1所示。本研究用于質(zhì)粒構(gòu)建和構(gòu)建過(guò)程的引物序列表詳見表2。借助常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pK18-ΔaroP::tktA-ppsA和pK18-ΔldhA::aroE-aroL-tyrB重組質(zhì)粒，其中aroFfbr、pheAfbr課題組前期已完成整合。此外，為了表征突變后的RBS對(duì)于目標(biāo)基因翻譯效率的影響，構(gòu)建了含有不同RBS元件、不同目標(biāo)基因前180 bp、Linker（GGGGSGGGGSGGGGS）與綠色熒光蛋白GFP融合的pEC-XK99E系列質(zhì)粒。谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性重組子的篩選參考已發(fā)表工作［22］。

1.2.2 利用堿基編輯方法產(chǎn)生RBS突變庫(kù) 將質(zhì)粒pgRNA-RBS2和pXMJ19-nCas9-AID電轉(zhuǎn)入構(gòu)建好的底盤菌株感受態(tài)中，得到待編輯菌株并以初始OD600=0.2轉(zhuǎn)接至CGX II（20 g/L葡萄糖）中30℃誘導(dǎo)編輯20 h，IPTG濃度為0.5 mmol/L。隨后將其轉(zhuǎn)接到LBHIS培養(yǎng)基中在37℃搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，利用較高溫度將溫敏型質(zhì)粒pgRNA-RBS2和pXMJ19-nCas9-AID去除。利用菌落PCR分別擴(kuò)增整合至ΔCGP2、ΔaroP和ΔldhA位點(diǎn)的人工模塊的DNA片段，一代測(cè)序驗(yàn)證突變庫(kù)中的7個(gè)基因的RBS編輯結(jié)果。

1.2.3 液滴微流控分選

1.2.3.1 液滴生成 將上一節(jié)已去除質(zhì)粒的RBS突變文庫(kù)轉(zhuǎn)接至CGX II（60 g/L葡萄糖）培養(yǎng)基中并調(diào)整OD600=0.1，作為液滴生成第一水相；將體外純化的L-Phe生物傳感器（蛋白）溶于CGX II（60 g/L葡萄糖）培養(yǎng)基作為液滴生成的第二水相；含有表面活性劑008-fluoroSurfactant（2%）的HFE 7500作為油相；調(diào)整流速至液滴直徑為23 μm左右。收集大約100 μL液滴于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)取樣于熒光顯微鏡下觀察液滴亮度。

1.2.3.2 液滴分選 當(dāng)液滴中的熒光強(qiáng)度具有一定區(qū)別時(shí)進(jìn)行液滴分選。當(dāng)液滴經(jīng)過(guò)檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，在488 nm激光的照射下，液滴發(fā)射不同強(qiáng)度的熒光，熒光信號(hào)經(jīng)PMT進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換與信號(hào)放大作用后，電信號(hào)被采集卡處理，在軟件上顯示峰值。當(dāng)液滴中熒光信號(hào)高于設(shè)定的閾值時(shí)，高壓放大器輸出高壓電場(chǎng)，目標(biāo)液滴流向“SORT”通道，非目標(biāo)液滴流向“WST”通道，達(dá)到分選目的。后將分選出的液滴涂在LBHIS平板上，在30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。

1.2.4 分選菌株培養(yǎng)

1.2.4.1 孔板培養(yǎng) 將分選到的單菌落接種至CGX II（20 g/L葡萄糖）培養(yǎng)基的96淺孔板中，于30℃，800 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，以初始OD600=0.2將種子液接種至含有1 mL的CGX II（60 g/L葡萄糖）的96深孔板中，于30℃，800 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 搖瓶培養(yǎng) 將復(fù)篩產(chǎn)量高的菌株接種到含有CGX II（20 g/L葡萄糖）培養(yǎng)基，于30℃，220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，以初始OD600=0.2將種子液接種至含有30 mL的CGX II（60 g/L葡萄糖）的250 mL搖瓶中，于30℃，220 r/min培養(yǎng)72 h，并分別取0、24、48和72 h樣品1 mL測(cè)定L-Phe及OD600nm。

1.2.5 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定 L-Phe生物傳感器檢測(cè)96孔板發(fā)酵液中L-Phe含量：配置緩沖溶液100 mmol/L Tris，pH 7.5，其中ATP 1 mmol/L，MgCl22.5 mmol/L，待測(cè)傳感器0.5 μmol/L。將配置好的混合液轉(zhuǎn)移至96孔熒光酶標(biāo)板中，并加入10 μL去除菌體的發(fā)酵液上清，在熒光酶標(biāo)儀中以激發(fā)光480 nm，發(fā)射光510 nm測(cè)試每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度。高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)孔板及搖瓶發(fā)酵液中L-Phe含量：（1）12 000 r/min離心2 min去除發(fā)酵液中的菌體，按照一定的倍數(shù)稀釋發(fā)酵液。（2）用0.22 μm的過(guò)濾頭對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾，隨后注入樣品瓶中。（3）標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精密稱取L-Phe對(duì)照品0.165 2 g，定容于10 mL超純水中，配置成濃度為100 mmol/L的L-Phe對(duì)照品儲(chǔ)備液，并梯度稀釋。（4）色譜條件：Waters C18（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈∶水（10∶90），流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：192 nm，進(jìn)樣體積：20 μL，進(jìn)樣時(shí)間：15 min。

1.2.6 RBS強(qiáng)度測(cè)定 將pEC-XK99E系列質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中，并涂布在LBHIS平板上（25 μg/mL卡那霉素），30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，至長(zhǎng)出單克隆。將單克隆接種至LBHIS液體培養(yǎng)基（25 μg/mL卡那霉素）的96深孔板中，于30℃，800 r/min條件下培養(yǎng)16 h。隨后，以同樣接種量接種至含有1 mL的LBHIS液體培養(yǎng)基（25 μg/mL卡那霉素）的96深孔板中，于30℃，800 r/min條件下培養(yǎng)20 h。4 000 r/min離心15 min收集菌體，并用PBS洗滌3次，然后重懸于PBS緩沖液中。通過(guò)酶標(biāo)儀（Synergy H4, Bio Tek）測(cè)量細(xì)菌懸浮液的OD600nm和GFP熒光信號(hào)（激發(fā)波長(zhǎng)=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)= 520 nm）。

2 結(jié)果

2.1 谷氨酸棒桿菌多基因誘導(dǎo)編輯底盤菌株的構(gòu)建

前期實(shí)驗(yàn)室已將基因前端帶有組成型啟動(dòng)子P11F和RBS為GGGGGGGG的aroFfbr和pheAfbr整合到了谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組中，整合位點(diǎn)如圖2-A1所示，將其命名為C.g-0。將質(zhì)粒pK18-ΔaroP::tktA-ppsA電轉(zhuǎn)化至重組菌株C.g-0感受態(tài)中，整合位點(diǎn)如圖2-A2所示，得到重組菌株C.g-1。隨后將質(zhì)粒pK18-ΔldhA::aroE-aroL-tyrB質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至C.g-1感受態(tài)中，整合位點(diǎn)如圖2-A3所示，得到了重組菌株C.g-2。驗(yàn)證引物位置如圖2所示，結(jié)果如圖3所示。

圖2 整合基因在基因組上位置及驗(yàn)證引物位置Fig.2 Positions of integrated genes on the genome and verification of primer positions

圖3 C.g-1和C.g-2重組菌株兩輪單交換驗(yàn)證Fig.3 PCR identification of the first-cross and second-cross of recombinant strain C.g-1 and C.g-2

2.2 RBS突變庫(kù)編輯結(jié)果

對(duì)編輯混菌進(jìn)行菌落PCR進(jìn)行一代測(cè)序來(lái)檢測(cè)每個(gè)基因的RBS的編輯情況。結(jié)果如圖4所示，堿基編輯器對(duì)每個(gè)基因前的RBS都進(jìn)行了編輯，產(chǎn)生了富含G/A的RBS序列。由于蛋白質(zhì)翻譯起始階段依賴于序列的核糖體募集，所以RBS可以直接調(diào)控基因的表達(dá)，堿基編輯器可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行靶向編輯，產(chǎn)生大量具有不同表達(dá)水平的目標(biāo)基因的組合，從而大規(guī)模地?cái)_動(dòng)不同代謝模塊。

圖4 一代測(cè)序基因的RBS編輯結(jié)果Fig.4 Sequencing result of different RBSs of genes

2.3 RBS突變文庫(kù)的液滴生成、培養(yǎng)觀察及分選

液滴的生成過(guò)程如圖5-A所示，將油、傳感器、菌液分為3通道進(jìn)行共包埋。結(jié)果如圖5-B所示，獲得單分散液滴具有良好的均一性，其中有菌的液滴比例大約為20%，并且只有極少數(shù)兩個(gè)及以上的菌被封裝在同一個(gè)液滴中，基本符合泊松分布的分布規(guī)律。RBS突變文庫(kù)在0 h時(shí)，液滴熒光基本一致，所有液滴的熒光亮度都較低；在6 h時(shí)，RBS突變文庫(kù)中有菌的液滴與空液滴相比有一定亮度，但由于生長(zhǎng)時(shí)間較短，液滴中的菌未能充盈整個(gè)液滴；在12 h時(shí)，觀察到菌體數(shù)目變多，基本可充盈整個(gè)液滴；在16 h時(shí)，RBS突變文庫(kù)中部分液滴熒光亮度較12 h更明顯；在24 h時(shí)，所有液滴的熒光驟減，這可能是由于傳感器熒光淬滅造成的［23-24］。因此，選擇16 h進(jìn)行后續(xù)的液滴分選（圖5-C），此時(shí)突變庫(kù)的液滴熒光強(qiáng)度分布和分選情況如圖5-D所示。將熒光強(qiáng)度最高的前5%設(shè)置為分選閾值，從約7萬(wàn)個(gè)液滴中分選得到大約3 000個(gè)液滴（收集于一個(gè)EP管中），經(jīng)過(guò)LBHIS瓊脂板的進(jìn)一步培養(yǎng)，獲得大約100個(gè)單克隆。

圖5 液滴收集、培養(yǎng)與觀察及液滴分選Fig.5 Droplet collection, culture and observation, and droplet sorting

2.4 L-Phe高產(chǎn)菌株獲得及驗(yàn)證

將分選到的菌株單克隆接種到96孔板中發(fā)酵培養(yǎng)24 h，首先利用L-Phe生物傳感器進(jìn)行復(fù)篩，并選取熒光值排序最高的兩株菌株以及熒光值居中的兩株菌，使用HPLC測(cè)定L-Phe產(chǎn)量，結(jié)果如圖6-A所示，不同菌株的HPLC測(cè)定的L-Phe產(chǎn)量與生物傳感器得到的熒光值呈正相關(guān)性。相較于對(duì)照菌株C.g-2，所有突變菌株在L-Phe標(biāo)品的保留時(shí)間（～9.7 min）處的吸收峰均有明顯的提升（圖6-B）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合換算，突變株C.g-Mut1、C.g-Mut2、C.g-Mut3、C.g-Mut4的孔板發(fā)酵L-Phe產(chǎn)量分別為0.14、0.35、1.05和1.58 mmol/L，相比對(duì)照菌株C.g-2（0.008 mmol/L），提高了16.50、42.75、130.25和196.50倍。為了評(píng)估突變菌株的發(fā)酵性能，對(duì)其搖瓶發(fā)酵，各突變株的生物量在48 h后趨于穩(wěn)定（圖6-C）。產(chǎn)量如圖6-D所示，24 h和48 h搖瓶發(fā)酵與孔板發(fā)酵成正相關(guān)，72 h C.g-Mut1產(chǎn)量高于C.g-Mut2；72 h時(shí)C.g-Mut1、C.g-Mut2、C.g-Mut3、C.g-Mut4的搖瓶發(fā)酵L-Phe產(chǎn)量分別為2.06、1.30、4.42和7.44 mmol/L（1.23 g/L）。相比對(duì)照菌株C.g-2（0.6 mmol/L），提高了2.43、1.17、6.37和11.40倍。各個(gè)突變菌株中每個(gè)基因的RBS的測(cè)序結(jié)果如表3所示，任何一株篩選得到的突變株，均有至少5個(gè)基因的RBS發(fā)生編輯，這與2.3節(jié)針對(duì)混菌的測(cè)序結(jié)果基本一致。所有突變株的tktA、pheAfbr、aroFfbr基因的RBS均發(fā)生了一定程度的編輯。

表3 突變菌株RBS測(cè)序Table 3 RBS sequencing for mutated strains

2.5 RBS強(qiáng)度分析

對(duì)起始菌株C.g-2和篩選的L-Phe高產(chǎn)菌株C.g-Mut4進(jìn)行RBS強(qiáng)度測(cè)試，使用RBS強(qiáng)度報(bào)告系統(tǒng)表征RBS強(qiáng)度。結(jié)果如圖7所示，與原始C.g-2的GGGGGGGG相比，突變菌株C.g-Mut4的aroE、aroL、tktA翻譯效率分別提高了58%、34%、47%，tyrB、ppsA、pheAfbr、aroFfbr翻譯效率分別提高了4.37、8.62、6.24、22.29倍。L-Phe產(chǎn)量的提升與所有關(guān)鍵基因翻譯效率的提高呈正相關(guān)。其中，突變后的aroFfbr基因的RBS的單位細(xì)胞熒光信號(hào)的絕對(duì)值最高，翻譯效率提升幅度最大，pheAfbr和aroFfbr的表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外5個(gè)關(guān)鍵基因，說(shuō)明pheAfbr和aroFfbr是L-Phe生物合成途徑中至關(guān)重要的兩個(gè)基因。

圖7 使用染色體GFP報(bào)告基因測(cè)定C.g-2和C.g-Mut4的RBS的強(qiáng)度Fig.7 RBS intensity for C.g-2 and C.g-Mut4 determined using chromosomal GFP reporter genes

3 討論

3.1 多位點(diǎn)同步編輯對(duì)于平衡不同代謝模塊的優(yōu)勢(shì)討論

本研究將大腸桿菌MG1655來(lái)源的解除了反饋抑制的pheAfbr和aroFfbr基因，以及L-Phe合成途徑中的其他5個(gè)關(guān)鍵基因整合到了谷氨酸棒桿菌13032的基因組中，并通過(guò)堿基編輯技術(shù)編輯每個(gè)基因前端的RBS，從而協(xié)同調(diào)控7種酶在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)，并通過(guò)液滴微流控結(jié)合L-Phe生物傳感器對(duì)RBS突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，從而得到L-Phe高產(chǎn)菌株。在L-Phe生物合成的研究中，莽草酸途徑的DAHPS是公認(rèn)的限速酶，一方面受到L-Phe對(duì)酶活性的反饋抑制，另一方面其表達(dá)水平也受到嚴(yán)格調(diào)控。而隨著DAHPS的解調(diào)，中心代謝途徑中代謝物豐度相對(duì)較低的前體物E4P的供給可能不足，因此有大量研究嘗試對(duì)tktA基因過(guò)表達(dá)。隨著莽草酸途徑通量的增加，分支酸途徑中同樣受到L-Phe對(duì)酶活性的反饋抑制的CM/PDT又將成為新的限速步驟［25］。本研究結(jié)果中所有L-Phe產(chǎn)量提升的突變株的pheAfbr、aroFfbr、tktA的RBS均發(fā)生了編輯，表明通過(guò)協(xié)同調(diào)控中心代謝途徑（供給E4P）、莽草酸途徑（供給分支酸）和分支酸途徑（合成L-Phe）對(duì)于高產(chǎn)L-Phe具有重要的作用，這與前人的研究一致［26］。此外，本研究還從這3個(gè)模塊中選取對(duì)L-Phe合成有利的PEP合酶編碼基因ppsA（PEP回補(bǔ)途徑），莽草酸脫氫酶編碼基因aroE、莽草酸激酶編碼基因aroL、苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因tyrB，一同進(jìn)行協(xié)同調(diào)控與篩選。從不同菌株7個(gè)基因的RBS分布上來(lái)看，不同RBS的組合對(duì)L-Phe產(chǎn)量的影響很大，而產(chǎn)量最高的突變株C.g-Mut4的7個(gè)基因的RBS均發(fā)生了編輯，這暗示了越多基因的協(xié)同調(diào)控將越有利于不同模塊之間通量達(dá)到平衡，也充分說(shuō)明了BETTER技術(shù)在多基因精細(xì)調(diào)控方面的優(yōu)勢(shì)。此外，C.g-Mut2和C.g-Mut3的染色體上ΔaroP位點(diǎn)的人工簇中缺失了ppsA基因，這可能是由于BETTER技術(shù)進(jìn)行堿基編輯時(shí)nCas9會(huì)造成多點(diǎn)單鏈斷裂［15］，當(dāng)ΔaroP位點(diǎn)的ppsA基因的上下游存在重復(fù)出現(xiàn)的啟動(dòng)子P11F和終止子TrrnB時(shí)，有概率會(huì)發(fā)生同源重組將ppsA基因彈出基因組，暗示著在某些多基因協(xié)同表達(dá)的組合中，ppsA基因的強(qiáng)表達(dá)可能反而不利于L-Phe的積累，相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 突變株C.g-Mut4高產(chǎn)L-Phe的機(jī)制分析

RBS強(qiáng)度分析結(jié)果表明，來(lái)源于大腸桿菌MG1655的解除反饋抑制的aroFfbr和pheAfbr基因，突變后的RBS單位細(xì)胞熒光信號(hào)絕對(duì)值最高，說(shuō)明DAHPS和CM/PDT的反饋抑制的解除與強(qiáng)表達(dá)對(duì)于L-Phe的高產(chǎn)是至關(guān)重要的，這與現(xiàn)在研究的普遍認(rèn)識(shí)是相符的［25］。此外，PEP合酶編碼基因ppsA和苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因tyrB的突變后的RBS的單位細(xì)胞熒光信號(hào)，相比于對(duì)照菌株的RBS，分別提高了8.62和4.37倍。其相關(guān)機(jī)理可能是隨著DAHPS的解調(diào)，中心代謝途徑中代謝物豐度相對(duì)較低的前體物PEP的供給可能不足，因此會(huì)篩選出ppsA表達(dá)水平提高的突變；而隨著CM/PDT的解調(diào)，L-Phe合成的直接前體物苯甲酮酸的積累量提高，需要上調(diào)tyrB的表達(dá)水平，因此篩選到了相關(guān)突變。轉(zhuǎn)酮酶編碼基因tktA、莽草酸脫氫酶編碼基因aroE與莽草酸激酶編碼基因aroL的突變后RBS的單位細(xì)胞熒光信號(hào)，雖然相比于對(duì)照也均提升了約50%，但仍處于較低水平。這說(shuō)明在C.g-Mut4菌株中，這些基因暫時(shí)不是L-Phe合成的限速步驟。

3.3 應(yīng)用BETTER技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)L-Phe的可行性分析

相比于目前主流的基于游離型質(zhì)粒或者多輪迭代的基因組編輯對(duì)關(guān)鍵基因強(qiáng)化表達(dá)方式，本研究中采用的堿基編輯介導(dǎo)的多基因調(diào)控技術(shù)與液滴微流控高通量篩選技術(shù)，可以在很短的周期內(nèi)，獲得穩(wěn)定、安全、高效的高產(chǎn)菌株，而且后續(xù)發(fā)酵不需要額外添加抗生素和誘導(dǎo)劑。產(chǎn)量最高的突變株C.g-Mut4，在孔板評(píng)價(jià)階段，與對(duì)照菌株C.g-2相比提高196.50倍。在后續(xù)的搖瓶發(fā)酵評(píng)價(jià)中，雖然沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化（采用最通用的基本鹽培養(yǎng)基CGXII），也可以積累7.44 mmol/L（1.23 g/L）的L-Phe，較對(duì)照菌株C.g-2產(chǎn)量提高11.40倍，這充分證明了利用堿基編輯器同時(shí)調(diào)節(jié)多基因的表達(dá)水平并篩選組合文庫(kù)是提高谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-Phe性能的一種行之有效的策略。在未來(lái)的研究工作中可將C.g-Mut4作為底盤菌株，在此基礎(chǔ)之上繼續(xù)進(jìn)行代謝工程改造，例如提高L-Phe轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的效率、降低L-Phe競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的積累等，結(jié)合發(fā)酵工藝優(yōu)化與放大，有望獲得更具工業(yè)生成潛力的高產(chǎn)菌株。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)同源重組技術(shù)，將L-Phe生物合成途徑中的7個(gè)關(guān)鍵基因和相關(guān)調(diào)控元件分為3個(gè)人工模塊，分別整合到谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組的不同位點(diǎn)中，使用堿基編輯技術(shù)靶向編輯7個(gè)基因前端的RBS從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)3個(gè)代謝模塊的模塊內(nèi)與模塊間的協(xié)同調(diào)控，并結(jié)合液滴微流控技術(shù)對(duì)所得突變文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，成功得到一株產(chǎn)量為7.44 mmol/L（1.23 g/L）的L-Phe的高產(chǎn)菌株，較對(duì)照菌株C.g-2產(chǎn)量提高11.40倍。