羅氏沼蝦蛻皮周期中內(nèi)分泌調(diào)控和蛻皮信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)分析

丁麗 都婷婷 唐瓊英 高權(quán)新 易少奎 楊國(guó)梁，2

（1.湖州師范學(xué)院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313000；2.江蘇數(shù)豐水產(chǎn)種業(yè)有限公司，揚(yáng)州 225654）

蛻皮是甲殼類動(dòng)物整個(gè)生命周期中的一個(gè)重要生理現(xiàn)象，對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和肢體再生等過程起著重要作用［1］。蛻皮周期貫穿了甲殼動(dòng)物整個(gè)生命周期，主要分為蛻皮間期（C）、蛻皮前期（D）、蛻皮期（E）和蛻皮后期（AB）［2］。蛻皮激素（ecdysteroids hormone, EH）作為蛻皮過程的主要調(diào)節(jié)因子，在蛻皮、卵巢生長(zhǎng)和甲殼動(dòng)物發(fā)育方面起著關(guān)鍵作用［3-4］。目前節(jié)肢動(dòng)物的蛻皮激素信號(hào)通路的調(diào)控路徑已經(jīng)較為清晰［5-6］（圖1），蛻皮激素信號(hào)入核前的上游通路已經(jīng)基本明確，認(rèn)為蛻皮抑制激素（molt-inhibiting hormone, MIH）與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，經(jīng)過一系列的反應(yīng)激活了蛋白激酶（protein kinase A, PKA），而具有活性的蛋白激酶入核后會(huì)調(diào)控甲殼動(dòng)物蛻皮激素的產(chǎn)生［7］。蛻皮激素下游通路主要是蛻皮激素通過作用靶標(biāo)-蛻皮激素受體（ecdysone receptor, EcR）和維甲酸類X受體（retinoid receptor, RXR）形成的EcR/RXR聚合體復(fù)合物［8-9］，再利用應(yīng)答基因調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中應(yīng)答基因包括ECR、RXR、E75、E74、E98、Br-C（broad-complex）、HR3、FTZ-F1（fushi tarazu transcription factor-1）等［10］，最后通過幾丁質(zhì)合成、表皮幾丁質(zhì)降解、表皮蛋白質(zhì)再生、激素分泌等過程完成蛻皮［11］。蛻皮是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅是由蛻皮激素單獨(dú)作用，也有其他激素參與蛻皮過程，在煙草天蛾中發(fā)現(xiàn)了能夠誘導(dǎo)昆蟲蛻皮的第二個(gè)神經(jīng)肽激素-蛻皮啟動(dòng)激素（ETH），而ETH是由氣門上腺細(xì)胞（Inka細(xì)胞）所分泌的。蛻皮激素會(huì)作用于Inka分泌ETH，最終ETH會(huì)與其受體（ETHR）結(jié)合產(chǎn)生調(diào)節(jié)肌肉的神經(jīng)肽，從而控制身體完成蛻皮［12］。

圖1 節(jié)肢動(dòng)物蛻皮調(diào)控過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the regulation process of molting in arthropods

在蛻皮激素信號(hào)通路中，F(xiàn)TZ-F1作為晚期應(yīng)答基因調(diào)控靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控蛻皮、變態(tài)等生理過程［13］，信號(hào)通路中早期應(yīng)答基因?qū)TZ-F1基因的調(diào)控主要通過HR3和E75介導(dǎo)的聯(lián)合作用，F(xiàn)TZ-F1作為一種能力因子，也能通過促進(jìn)保幼激素調(diào)節(jié)E75A基因的表達(dá)［14］。已有研究表明當(dāng)FTZ-F1缺失的果蠅突變體，在向蛹轉(zhuǎn)變的過程中會(huì)出現(xiàn)不能正常蛻皮的現(xiàn)象，說明FTZ-F1在果蠅蛻皮過程發(fā)揮重要的作用［15］。FTZ-F1基因在昆蟲中研究較為深入，但在甲殼動(dòng)物中卻少有報(bào)道［16-17］。ETH信號(hào)通路是通過蛻皮啟動(dòng)激素受體（ecdysis triggering hormones receptor, ETHR）介導(dǎo)的，有研究表明蛻皮激素能刺激Inka細(xì)胞產(chǎn)生ETH和蛻皮前啟動(dòng)激素（pre-ecdysis triggering hormone, PETH），也可通過磷酸肌循聚集鈣離子誘導(dǎo)ETHR從而調(diào)控下游基因參與蛻皮［18］。蛻皮啟動(dòng)激素受體有兩種亞型，分別是ETHR-A和ETHR-B，這兩種基因型在功能進(jìn)化上承擔(dān)著不同的作用，ETHR-A通過激活蛻皮激素、激肽、甲殼類心臟活性肽和鞣化激素可誘導(dǎo)果蠅所有發(fā)育階段的蛻皮行為，而ETHR-B主要在蛹和成蟲蛻皮時(shí)期發(fā)揮重要作用［19］。在昆蟲類中，針對(duì)ETHR基因進(jìn)行廣泛研究并對(duì)其分型也有所研究，而在甲殼動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)了一種ETHR類型［20］。

羅氏沼蝦原產(chǎn)于東南亞地區(qū)，自上世紀(jì)70年代引入我國(guó)，因其生長(zhǎng)快、抗病性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)的廣東、江蘇和浙江地區(qū)廣泛養(yǎng)殖，目前已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蝦類之一［21］。羅氏沼蝦的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖及斷肢再生等生理過程都與蛻皮有關(guān)。在蛻皮過程中機(jī)體抵抗力會(huì)變?nèi)?，易感染病原?dǎo)致死亡，會(huì)嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。目前蛻皮調(diào)控機(jī)制在昆蟲中進(jìn)行了廣泛研究，而關(guān)于甲殼動(dòng)物中蛻皮調(diào)控機(jī)制還未完全明晰［22］，鑒于此，探究羅氏沼蝦蛻皮調(diào)控機(jī)制對(duì)于羅氏沼蝦高密度養(yǎng)殖具有重大意義。本研究以羅氏沼蝦為對(duì)象，檢測(cè)了谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS）、β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D glucosaminidase,NAGase）、幾丁質(zhì)酶活力（chitinase）和蛻皮激素含量，分析了蛻皮周期內(nèi)Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1以及蛻皮相關(guān)基因Mr-RXR、Mr-ECR和Mr-MIH的表達(dá)量變化，從內(nèi)分泌調(diào)控與基因調(diào)控兩個(gè)層面探究羅氏沼蝦蛻皮的調(diào)節(jié)機(jī)制，為甲殼動(dòng)物蛻皮調(diào)控機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料來源于江蘇省高郵市數(shù)豐水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖的同一家系的羅氏沼蝦，隨機(jī)選取健康且規(guī)格一致的羅氏沼蝦300尾，體重為（7-8）g并隨機(jī)分成3組，每組100尾蝦養(yǎng)殖于17 m2（6.87 m×2.55 m）的水泥池中，保持養(yǎng)殖水體pH 7-8.5，溶氧3-5 mg/L，水溫25℃，養(yǎng)殖用水來源于育種中心北部的高郵湖水并做過濾處理，日投喂商品飼料2次（8：00和17：00）各一次，每隔3 d進(jìn)行吸污換水，每次換1/3水，24 h增氧。根據(jù)形態(tài)特征與顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)合［23］的方法，選取蛻皮后期（AB期）、蛻皮間期（C期）、蛻皮前期（D期）和蛻皮期（E期）個(gè)體各6只，取血淋巴和肝胰腺組織，液氮速凍-80℃保存，用于酶活檢測(cè)與蛻皮激素的測(cè)定以及蛻皮相關(guān)基因表達(dá)分析。

1.2 方法

1.2.1 羅氏沼蝦蛻皮相關(guān)酶的活力測(cè)定 測(cè)定了蛻皮相關(guān)的幾丁質(zhì)酶、谷氨酰胺合成酶和β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性，取羅氏沼蝦4個(gè)蛻皮時(shí)期的血淋巴和肝胰腺組織，肝胰腺組織按照組織質(zhì)量（g）與PBS體積（mL）約為1∶9的比例進(jìn)行冰水浴勻漿，取上清；血淋巴以6 000 r/min離心15 min，取上清。每組3個(gè)重復(fù)。由于幾丁質(zhì)酶主要存在于甲殼動(dòng)物的外表皮中，少量存在于肝胰腺中，因此只測(cè)肝胰腺中的幾丁質(zhì)酶含量。使用幾丁質(zhì)酶檢測(cè)試劑盒、谷氨酰胺合成酶檢測(cè)試劑盒和β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）測(cè)定酶活性，參照試劑盒說明書在酶標(biāo)儀（Multiskan FC）中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 羅氏沼蝦蛻皮激素含量測(cè)定 取不同蛻皮周期的組織（血淋巴和肝胰腺），每個(gè)蛻皮周期采取3尾，肝胰腺組織與血淋巴組織進(jìn)行冰水浴勻漿，取上清。使用對(duì)蝦蛻皮激素酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海源桔生物科技中心，上海）測(cè)定EH含量參照試劑盒說明書在酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 羅氏沼蝦ETHR與FTZ-F1基因CDS序列的克隆 通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的日本沼蝦ETHR基因序列（NN13868.1）和FTZ-F1基因序列（UQC00153.1）以及羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄本序列為模板，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列信息見表1。采用Trizol法提取羅氏沼蝦肝胰腺組織總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）試劑盒合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至天一輝遠(yuǎn)（武漢）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。通過一代測(cè)序獲得的序列進(jìn)行手動(dòng)拼接，最終獲得羅氏沼蝦ETHR、FTZ-F1基因的CDS全長(zhǎng)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

1.2.4 羅氏沼蝦蛻皮相關(guān)基因生物信息學(xué)分析 獲得羅氏沼蝦Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1 CDS 全長(zhǎng)序列后，使用下列軟件與工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析：采用ORFfinder在線預(yù)測(cè)開放閱讀框，SMART在線翻譯蛋白氨基酸序列，BLAST對(duì)氨基酸序列進(jìn)行驗(yàn)證和同源性分析，在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量、不穩(wěn)定系數(shù)和親水性等特征，使用Expasy Protaram以及Expasy Protscale在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)與NCBI中保守結(jié)構(gòu)域（CDD）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，功能結(jié)構(gòu)，在線分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過ClustalX與GeneDoc進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA 6.0以鄰接法（Neighbor Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 羅氏沼蝦蛻皮相關(guān)基因表達(dá)分析 提取羅氏沼蝦2個(gè)組織（肝胰腺和血淋巴）、4個(gè)蛻皮階段（AB、C、D和E）總RNA，選取高質(zhì)量的RNA 樣品，進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，用于后續(xù)RT-qPCR。根據(jù)基因序列信息，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），選用18S rRNA為內(nèi)參基因，采用TB GreenTMPremix ExTaqTMII（TaKaRa，大連）試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，其反應(yīng)體系（20 μL）如下：SYBRRPremix Ex TaqTMII 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 1.6 μL，ddH2O 6.8 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量用2-△△Ct公式［24］進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan多重比較進(jìn)行組間差異分析，P＜0.05為差異顯著。采用TBtools［25］進(jìn)行熱圖繪制，并對(duì)基因進(jìn)行聚類分析。使用Graphpad prism（版本號(hào)9.5.0，GraphPad軟件公司，美國(guó)）進(jìn)行基因間相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 羅氏沼蝦蛻皮相關(guān)酶在蛻皮周期的變化

采集不同蛻皮時(shí)期羅氏沼蝦的血淋巴和肝胰腺組織進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果顯示肝胰腺中GS酶活性在D期顯著高于其他蛻皮時(shí)期（P＜0.05），在E期活性降至最低，C期和D期GS酶活性無明顯差異。血淋巴中GS酶活性在AB期顯著高于其他蛻皮時(shí)期（P＜0.05），且其他蛻皮時(shí)期GS酶活性無明顯差異；在肝胰腺和血淋巴中，NAG酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在D期活性達(dá)到最高。肝胰腺中NAG酶活性在C期顯著低于D期（P＜0.05），AB期和E期間NAG酶活性無明顯差異。血淋巴中NAG酶活性在D期顯著高于AB期（P＜0.05），且各個(gè)蛻皮時(shí)期NAG酶活性差異顯著；肝胰腺中幾丁質(zhì)酶活性在AB期達(dá)到最高，在E期活性最低，且各個(gè)蛻皮時(shí)期差異顯著，總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖2）。

2.2 羅氏沼蝦蛻皮激素在蛻皮周期的動(dòng)態(tài)變化

選取羅氏沼蝦不同蛻皮時(shí)期的肝胰腺和血淋巴組織進(jìn)行蛻皮激素含量測(cè)定，結(jié)果顯示：在肝胰腺和血淋巴中，EH含量在不同蛻皮時(shí)期的變化趨勢(shì)一致。在肝胰腺和血淋巴組織中，EH含量均在AB期達(dá)到最高。在肝胰腺和血淋巴中EH含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，AB期含量顯著高于C期（P＜0.05），且D期和E期間含量無明顯差異（圖3）。

圖3 羅氏沼蝦肝胰腺與血淋巴中不同蛻皮時(shí)期蛻皮激素含量變化Fig.3 Dynamics of ecdyhormone content in hepatopancreas and hemolymph in M.rosenbergii at different molting stages

2.3 羅氏沼蝦ETHR和FTZ-F1基因生物信息學(xué)分析

通過克隆獲取羅氏沼蝦ETHR基因和FTZ-F1基因的CDS序列，并命名為Mr-ETHR（Gene Bank No：OQ383351）和Mr-FTZ-F1（Gene Bank No：OQ383352）。Mr-ETHR基因開放閱讀框編碼區(qū)全長(zhǎng)1 173 bp，編碼390個(gè)氨基酸，蛋白的分子量為44.39 kD，理論等電點(diǎn)為9.04，具有親水性；與NCBI保守結(jié)構(gòu)域（CDD）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，表明Mr-ETHR具有G蛋白偶聯(lián)受體家族（G Protein-Coupled Receptors，GPCR）典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域，3個(gè)胞外環(huán)含有兩個(gè)高度保守的的半胱氨酸殘基，這兩個(gè)殘基可以形成二硫鍵用來穩(wěn)固受體。氨基酸序列多序列比對(duì)以及同源性分析，發(fā)現(xiàn)Mr-EHTR基因與日本沼蝦（M.nipponense, ANN13868.1）的同源性最高，為97.69%，主要是位于21aa和30aa分別由亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸和纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?，表明Mr-EHTR基因較為保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，10個(gè)物種分成兩大支，為甲殼綱和昆蟲綱支。在家蠶、煙草天蛾、赤擬谷盜和埃及伊蚊中ETHR-A和ETHR-B被單獨(dú)分支，說明ETHR-A和ETHR-B在功能上有所區(qū)別，而羅氏沼與日本沼蝦聚為一支，說明其親緣關(guān)系最近（圖4-A）。

Mr-FTZ-F1基因開放閱讀框編碼區(qū)全長(zhǎng)1 206 bp，編碼401個(gè)氨基酸，蛋白的分子量為43.65 kD，理論等電點(diǎn)為6.35，具有疏水性；利用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Mr-FTZ-F1基因存在NR_LBD_Ftz-F1_like結(jié)構(gòu)域（169-399 aa）。將羅氏沼蝦FTZ-F1基因氨基酸序列與其他甲殼動(dòng)物氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)Mr-FTZ-F1基因與日本沼蝦（M.nipponense,UQC00153.1）的同源性最高，為98.71%，與南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei, XP_027236937.1）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkia, XP_045625434.1）、日本對(duì)蝦（P.japonicus, XP_042874083.1）和斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon, XP_037803373.1）的同源性均高于80%，說明Mr-FTZ-F1基因具有一定的保守性。Mr-FTZ-F1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，13個(gè)物種被分成兩大支，并細(xì)分為5小支，甲殼綱中的7個(gè)物種聚為一支，羅氏沼蝦與同屬的日本沼蝦聚為一支，表明其親緣關(guān)系最近（圖4-B）。

2.4 羅氏沼蝦蛻皮相關(guān)基因在不同蛻皮周期的表達(dá)分析

選取不同蛻皮周期羅氏沼蝦的血淋巴和肝胰腺組織，分析Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1、Mr-RXR、Mr-ECR和Mr-MIH基因表達(dá)，結(jié)果顯示在肝胰腺和血淋巴中，Mr-ETHR均在AB期表達(dá)量最高。在肝胰腺中，Mr-ETHR在D期表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AB期（P＜0.05），總體呈上升趨勢(shì)。在血淋巴中，Mr-ETHR表達(dá)量在E期顯著低于其他蛻皮時(shí)期（P＜0.05），C期、D期和AB期間無明顯差異。Mr-FTZ-F1在肝胰腺和血淋巴中的表達(dá)量均在D期最高，Mr-FTZ-F1在D期的表達(dá)量顯著高于AB期（P＜0.05），總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)（圖5）。

圖5 在不同蛻皮時(shí)期內(nèi)Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1基因在肝胰腺和血淋巴組織中的表達(dá)情況Fig.5 Expressions of Mr-ETHR and Mr-FTZ-F1 in hepatopancreatic and hemolymphatic tissues at different molting stages

聚類分析結(jié)果表明，Mr-ECR在不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)模式與Mr-RXR相似，在肝胰腺和血淋巴組織中，均在AB期表達(dá)量最高，且總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。Mr-ETHR在肝胰腺與血淋巴組織中均在AB期表達(dá)量最高，Mr-ETHR的表達(dá)模式與Mr-ECR和Mr-RXR相似，而Mr-FTZ-F1與Mr-MIH被單獨(dú)聚為一支。在肝胰腺和血淋巴組織中Mr-FTZ-F1在D期表達(dá)量最高，在AB期表達(dá)量最低。Mr-MIH在C期表達(dá)量最高，總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。Mr-FTZ-F1與Mr-MIH表達(dá)模式與其他基因并不相似（圖6）。

2.5 羅氏沼蝦蛻皮基因間相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示：在肝胰腺組織中，Mr-FTZ-F1與Mr-ECR的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.833 9，P＜0.01），與Mr-ETHR的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.627 5，P＜0.01），而在血淋巴組織中，Mr-FTZ-F1與Mr-MIH表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（r=0.666 5，P＜0.01）；在肝胰腺組織中，Mr-RXR與Mr-ETHR表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（r=0.703 0，P＜0.01）。肝胰腺和血淋巴中Mr-ETHR與Mr-ECR表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（r=0.868 0，P＜0.01）。

3 討論

在羅氏沼蝦蛻皮過程中，會(huì)涉及到機(jī)體內(nèi)能量代謝以及滲透壓的變化。谷氨酰胺通過參與血淋巴滲透壓調(diào)控來維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)［26］，而谷氨酰胺合成酶（GS）是谷氨酰胺合成途徑必不可少的關(guān)鍵酶，在機(jī)體氨基酸代謝過程中具有重要作用［27］。已有研究發(fā)現(xiàn)在凡納濱對(duì)蝦［28］和克氏原螯蝦［29］蛻皮過程中谷氨酰胺合成酶中參與了能量代謝過程與滲透壓調(diào)節(jié)。在中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）的研究中發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶能通過間接的方式參與免疫防御過程［30］。本研究發(fā)現(xiàn)GS酶在羅氏沼蝦血淋巴組織中的活力明顯高于肝胰腺中，推測(cè)可能是因?yàn)樵谕懫み^程中機(jī)體抵抗力下降時(shí)，血淋巴作為甲殼動(dòng)物中主要的免疫與滲透調(diào)節(jié)器官起著免疫防御病毒感染作用［31］。已有研究表明肝胰腺是甲殼動(dòng)物的主要代謝器官，包含大量的酶與蛋白質(zhì)，而GS酶參與細(xì)胞內(nèi)多種酶活動(dòng)［32］。羅氏沼蝦蛻皮后，在肝胰腺組織中，GS酶活力驟降，推測(cè)羅氏沼蝦蛻皮后期短時(shí)間內(nèi)因不能進(jìn)食從而需要消耗機(jī)體自身大量的蛋白質(zhì)，而GS酶可通過催化合成谷氨酰胺并用于蛋白質(zhì)合成。

甲殼動(dòng)物的蛻皮包括舊的外骨骼蛻去、新的外骨骼形成等過程，在此過程中幾丁質(zhì)酶可起到降解外骨骼的作用，而NAGase作為幾丁質(zhì)級(jí)聯(lián)催化降解途徑的關(guān)鍵酶，在蛻皮過程中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用［33］。研究表明幾丁質(zhì)酶在斑節(jié)對(duì)蝦和中國(guó)對(duì)蝦甲殼動(dòng)物中參與了蛻皮過程［34-35］。在日本沼蝦（M.nipponense）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）甲殼動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，NAG酶活性均在蛻皮前期達(dá)到峰值，并與蛻皮激素含量呈正相關(guān)［36-37］。本研究測(cè)定了幾丁質(zhì)酶和NAG酶在不同蛻皮周期的活性變化，發(fā)現(xiàn)在肝胰腺和血淋巴組織中NAG酶均在蛻皮前期的活性達(dá)到最高，推測(cè)蛻皮前期是頭胸甲表皮結(jié)構(gòu)顯著變化的時(shí)期，而NAG酶在此時(shí)期高活力可保證高效降解舊的外骨骼，促進(jìn)羅氏沼蝦的順利蛻皮，而幾丁質(zhì)酶在蛻皮后期活性達(dá)到最高。

甲殼類動(dòng)物的蛻皮與生長(zhǎng)受多種激素及蛻皮相關(guān)基因的調(diào)控，黃姝等［38］發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹蛻皮激素含量變化在蛻皮周期中是波動(dòng)的，且在蛻皮間期含量最低。本研究結(jié)果表明，血淋巴與肝胰腺中的蛻皮激素含量在羅氏沼蝦不同蛻皮時(shí)期內(nèi)有差異，其中蛻皮間期的含量最低，在蛻皮后期含量達(dá)到峰值。ETH-ETHR信號(hào)通路在節(jié)肢動(dòng)物中普遍存在，ETHR與配體蛻皮啟動(dòng)激素（ETH）結(jié)合后會(huì)參與蛻皮過程，而蛻皮激素會(huì)介導(dǎo)ETHR基因的表達(dá)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)在肝胰腺組織中，Mr-ETHR在蛻皮后期的表達(dá)量最高，總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與蛻皮激素含量在不同蛻皮時(shí)期的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了蛻皮激素能夠誘導(dǎo)Mr-ETHR基因的表達(dá)。已有研究證實(shí)了甲殼動(dòng)物的蛻皮激素與FTZ-F1具有緊密聯(lián)系，通過去除三疣梭子蟹單側(cè)眼柄后檢測(cè)FTZ-F1基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蛻皮激素濃度升高到峰值會(huì)抑制FTZ-F1基因的表達(dá)［39］。本研究中蛻皮后期蛻皮激素含量最高，而Mr-FTZ-F1基因的表達(dá)量卻是最低，推測(cè)羅氏沼蝦蛻皮激素含量在一定峰值內(nèi)會(huì)抑制Mr-FTZ-F1的表達(dá)，兩者之間可能存在負(fù)調(diào)控作用。同樣，已有研究表明蛻皮激素含量與MIH的表達(dá)量具有顯著相關(guān)性［40］。本研究發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦MIH表達(dá)具有明顯規(guī)律：Mr-MIH在C期表達(dá)量最高，在AB期表達(dá)量最低，呈逐漸下降趨勢(shì)；通過關(guān)聯(lián)羅氏沼蝦蛻皮周期蛻皮激素含量的變化，結(jié)果顯示Mr-MIH表達(dá)量與蛻皮激素含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證了羅氏沼蝦MIH可以抑制蛻皮激素的合成從而調(diào)控著羅氏沼蝦蛻皮的發(fā)生。Mr-FTZ-F1和Mr-MIH的表達(dá)模式相近，并且呈強(qiáng)正相關(guān)，表明Mr-FTZ-F1和Mr-MIH在調(diào)控羅氏沼蝦蛻皮通路中的調(diào)控模式相近。在中華絨螯蟹、中國(guó)明對(duì)蝦的研究中，發(fā)現(xiàn)RXR基因與ECR基因能夠調(diào)控甲殼動(dòng)物的蛻皮［41-42］。本研究證實(shí)了羅氏沼蝦Mr-ETHR、Mr-RXR和Mr-ECR在蛻皮周期中表達(dá)量呈強(qiáng)正相關(guān)性，在血淋巴與肝胰腺組織中，Mr-RXR基因與Mr-ECR基因都在蛻皮后期的表達(dá)量最高，與蛻皮激素含量趨勢(shì)一致，推測(cè)RXR基因需與ECR基因結(jié)合形成二聚體從而介導(dǎo)羅氏沼蝦的蛻皮，在羅氏沼蝦的蛻皮功能上表現(xiàn)出協(xié)同作用。

4 結(jié)論

本研究通過測(cè)定在羅氏沼蝦中不同蛻皮時(shí)期內(nèi)蛻皮相關(guān)酶的活性、蛻皮激素的含量以及蛻皮信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶、β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和幾丁質(zhì)酶在不同蛻皮周期內(nèi)活性均有差異，Mr-ETHR、Mr-RXR和Mr-ECR共同參與調(diào)控羅氏沼蝦蛻皮且其表達(dá)量具有顯著的正相關(guān)性，并對(duì)蛻皮的發(fā)生起著正向調(diào)節(jié)作用，而Mr-FTZ-F1和Mr-MIH在蛻皮信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)節(jié)作用且具有相似的調(diào)控模式，證實(shí)了羅氏沼蝦的蛻皮受多種酶、蛻皮激素以及蛻皮通路中基因的調(diào)控，為甲殼動(dòng)物蛻皮調(diào)控機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。