化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)在天然產(chǎn)物分子靶標(biāo)鑒定中的應(yīng)用

周璐祺 崔婷茹 郝楠 趙雨薇 趙斌 劉穎超

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000；2.保定市氣象局，保定 071000）

糧食安全是關(guān)系到國(guó)民經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定的國(guó)家戰(zhàn)略，也是國(guó)家安全體系的重要內(nèi)容。綠色農(nóng)藥在保障農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量、防治各種農(nóng)作物病蟲(chóng)草害的發(fā)生、保障糧食安全方面起著重要作用。通過(guò)農(nóng)藥的合理使用，可挽回世界農(nóng)作物總產(chǎn)30%-40%的損失［1］。綠色新農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和利用有利于農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收和可持續(xù)發(fā)展，是各國(guó)農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。經(jīng)過(guò)20年的發(fā)展，雖然我國(guó)在綠色農(nóng)藥的創(chuàng)制和應(yīng)用上取得了較多原創(chuàng)性成果，但仍然存在較多問(wèn)題，例如原創(chuàng)性靶標(biāo)少、新農(nóng)藥品種單一、植物耐藥性增強(qiáng)等［2］。近年來(lái)，在醫(yī)學(xué)上，天然產(chǎn)物已經(jīng)逐漸被開(kāi)發(fā)為新型藥劑用于治療各類疾病［3］。在農(nóng)業(yè)上，我國(guó)的植物化學(xué)家們也基于天然的活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)了農(nóng)用化學(xué)品，但是品種相對(duì)較少，例如以白頭翁（Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel）、虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc）、蛇床花（Cnidium monnieri（L.）Cuss）、馬藍(lán)（Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek）等植物為材料，提取到活性物質(zhì)并以其為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)了原白頭翁素A、大黃素甲醚、蛇床子素、喹唑啉酮等4種新型殺菌劑［4］；基于苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）開(kāi)發(fā)出了對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有較好的殺蟲(chóng)效果的殺蟲(chóng)劑苦皮藤素［5］。盡管天然產(chǎn)物具有安全無(wú)毒、結(jié)構(gòu)新穎等特點(diǎn)，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜不能直接作為農(nóng)藥使用。天然產(chǎn)物具有多元的結(jié)構(gòu)，可以以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)設(shè)計(jì)新型衍生物或研究其新型作用靶標(biāo)，進(jìn)而加速具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型農(nóng)藥創(chuàng)制與開(kāi)發(fā)。

新農(nóng)藥創(chuàng)制可以采取不同策略，常見(jiàn)創(chuàng)制方法有表型篩選和靶向篩選。基于藥物靶向篩選策略是目前較為常用的新農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)方法；然而大量、重復(fù)使用單一靶標(biāo)農(nóng)藥，無(wú)疑會(huì)使“農(nóng)藥殘留、有害生物再猖獗及生物抗藥性”問(wèn)題日益凸顯，若輪換使用靶標(biāo)相同或相似的農(nóng)藥，也會(huì)增加此類風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)有研究表明，基于表型篩選發(fā)現(xiàn)新藥的成功率高于靶向篩選［6］，基于表型篩選獲得的生物活性化合物是以相關(guān)病蟲(chóng)草害為基礎(chǔ)進(jìn)行篩選，并不限于單一的基因或者蛋白質(zhì)。因此表型篩選近年來(lái)重新受到重視，但表型篩選的最大問(wèn)題在于得到的化合物靶點(diǎn)未知［7］，盡管在新農(nóng)藥創(chuàng)制的早期階段不一定需要了解藥物靶標(biāo)，但是對(duì)候選化合物的靶點(diǎn)研究對(duì)全面解析候選化合物的作用模式是非常有必要的［8］。同時(shí)一個(gè)新靶標(biāo)的價(jià)值往往高于一個(gè)新產(chǎn)品，例如以魚(yú)尼丁為探針發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上一類獨(dú)特的作用靶標(biāo)——魚(yú)尼丁受體（ryanodine receptors,RyRs），化學(xué)家們基于魚(yú)尼丁受體開(kāi)發(fā)出目前常用的鄰苯二甲酰類和鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲(chóng)劑［9］。新靶標(biāo)的發(fā)掘作為綠色農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑之一，已成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)是大多數(shù)藥物的主要靶點(diǎn)，小分子化合物與細(xì)胞內(nèi)的蛋白靶點(diǎn)相結(jié)合是藥物發(fā)揮藥理活性的基礎(chǔ)，然而監(jiān)測(cè)蛋白活性及功能的方法在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中仍未得到系統(tǒng)性的應(yīng)用［10］。同時(shí)，藥劑在發(fā)揮活性時(shí)往往不是針對(duì)單一蛋白，而是與多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用［11］。這種多靶點(diǎn)的作用模式使得確定天然產(chǎn)物的單一靶點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行特異性研究十分困難。因此迫切需要一種能夠全面識(shí)別天然產(chǎn)物靶點(diǎn)的方法。

以小分子天然產(chǎn)物為起點(diǎn)篩選靶標(biāo)蛋白常用技術(shù)手段，包括化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、化學(xué)基因組學(xué)和生物物理學(xué)等，其中化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)可以直接分析小分子化合物的靶標(biāo)蛋白，是一種捕獲和鑒定小分子化合物蛋白質(zhì)靶標(biāo)的有效方法，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組與藥物靶點(diǎn)研究和新藥研究的重要手段，及在蛋白質(zhì)水平上鑒定小分子化合物與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的主要方法之一［12-13］。在本綜述中，通過(guò)藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)實(shí)例，總結(jié)了基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)開(kāi)發(fā)出的藥物靶標(biāo)鑒定方法，包括標(biāo)記法和非標(biāo)記法，并詳細(xì)探討了它們的原理、實(shí)驗(yàn)流程、優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍。由于醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展要先于農(nóng)藥，因此本文以醫(yī)藥靶標(biāo)開(kāi)發(fā)方法為主，旨在通過(guò)闡述基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)藥物作用靶標(biāo)最新方法的進(jìn)展，為天然產(chǎn)物靶點(diǎn)及新農(nóng)藥創(chuàng)制研究提供參考。

1 基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識(shí)別方法

生物體中小分子化合物與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系是藥物結(jié)構(gòu)改造及成藥的關(guān)鍵，分析小分子藥物與靶點(diǎn)相互作用的信號(hào)和代謝規(guī)律變得日益重要，一方面通過(guò)活性分子的靶點(diǎn)信息可以對(duì)化合物進(jìn)行針對(duì)性的改造從而提高其作用效果，另一方面可以確定活性分子對(duì)目標(biāo)靶標(biāo)的選擇性，有效的預(yù)測(cè)其潛在的毒副作用，降低研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是化學(xué)生物學(xué)研究的重要手段之一，有別于以往對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或者定量鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)旨在通過(guò)一系列功能各異的化學(xué)探針，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，解決復(fù)雜體系如細(xì)胞裂解液、活細(xì)胞、組織中的蛋白質(zhì)如何與小分子藥物相互作用的問(wèn)題，目前已被應(yīng)用于小分子藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、藥物先導(dǎo)化合物的篩選等研究中［14］。其一般流程為將引入親和基質(zhì)或報(bào)告基團(tuán)的化學(xué)探針與蛋白質(zhì)組進(jìn)行孵育，利用親和純化等方法富集與探針結(jié)合的蛋白，再通過(guò)質(zhì)譜等其他輔助技術(shù)來(lái)分析。常用的基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的小分子藥物靶點(diǎn)研究方法有以化合物為中心的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)（compoundcentric chemical proteomics, CCCP）和以活性探針為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)譜分析（activity-based protein profiling,ABPP），工作流程如圖1所示［15］。

圖1 CCCP和ABPP化學(xué)蛋白質(zhì)組比較Fig.1 Comparison of CCCP and ABPP chemical proteome

1.1 以化合物為中心的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)鑒定方法

CCCP是最早用于確定靶標(biāo)蛋白的方法，早在20世紀(jì)90年代，Harding等［16］就通過(guò)親和層析方法篩選到天然免疫抑制劑 FK506 的結(jié)合蛋白——FKBP12（FK506 binding protein 12）。CCCP將藥物分子進(jìn)行修飾后引入標(biāo)簽分子，然后固定到基質(zhì)上如瓊脂糖凝珠或其他樹(shù)脂，富集可以與藥物分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定。這是鑒定化合物靶標(biāo)較為經(jīng)典的方法，具有快速、大量富集靶標(biāo)蛋白的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)主要用于研究具有生物活性的小分子化合物與蛋白質(zhì)的相互作用，更有利于識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)，為新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

Bach等［17］發(fā)現(xiàn)（R）-roscovitine除可作為周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）的專性抑制劑外，還可以抑制吡哆醛激酶的活性。酪蛋白激酶2（casein kinase 2, CK2）是一種臨床上常見(jiàn)的治療癌癥的靶點(diǎn)，Gyenis等［18］利用固定在Sepharose磁珠上的ATP/CK2抑制劑TBB，從細(xì)胞裂解液中捕獲和識(shí)別結(jié)合蛋白，證明CK2可以與TBB相互作用，同時(shí)還識(shí)別到一些潛在的目標(biāo)蛋白，如羰基磷酸合成酶I（carbamoyl-phosphate synthase I,CPSM）、真核細(xì)胞生長(zhǎng)因子1α（eukaryotic elongation factor 1-alpha 1, EEF1α1）等，并為CK2激酶抑制劑以及抗癌藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。Faiella等［19］對(duì)Hardwickiic acid（HAA）進(jìn)行修飾并固定在基質(zhì)載體上與細(xì)胞裂解液進(jìn)行孵育發(fā)現(xiàn)，HAA可以與Hsp27結(jié)合，為Hsp27化學(xué)抑制劑的開(kāi)發(fā)提供了方向［19］?？嗥ぬ偎刈鳛榛瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑可以影響昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)，Lu等［20］采用親和層析的方法，從昆蟲(chóng)中腸中鑒定到11種可以作為苦皮藤素的潛在靶標(biāo)蛋白的蛋白質(zhì)，并成功預(yù)測(cè)了苦皮藤素與V-ATPase的結(jié)合位點(diǎn)。

盡管利用親和色譜的方法鑒定小分子化合物靶標(biāo)較為經(jīng)典，但其對(duì)細(xì)胞材料要求較高，同時(shí)親和層析實(shí)驗(yàn)在體外進(jìn)行無(wú)法反映生理?xiàng)l件下藥物與活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的相互作用。在此基礎(chǔ)上，Hu等［21］開(kāi)發(fā)了水溶性納米聚合物藥物載體，并利用其在活細(xì)胞中篩選藥物靶點(diǎn)。此外，Bantscheff等［22］開(kāi)發(fā)出kinobeads技術(shù)，成功解決了小分子藥物無(wú)法進(jìn)行化學(xué)修飾的問(wèn)題。

1.2 以活性探針為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)譜靶標(biāo)鑒定方法

ABPP是由美國(guó)的Cravatt課題組最先提出的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)［23］，是目前應(yīng)用較為廣泛的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。其在CCCP技術(shù)的基礎(chǔ)上改進(jìn)，是一種更為簡(jiǎn)便且適用性更為廣泛的鑒定方法。與CCCP不同，ABPP的核心是將基于活性的探針（activitybased probes, ABPs）用于靶向功能相關(guān)的蛋白質(zhì)組，并且這些探針可以共價(jià)修飾從絲氨酸水解酶到糖苷酶等酶類的活性位點(diǎn)［24］。因此，ABPP技術(shù)的關(guān)鍵步驟在于活性探針的設(shè)計(jì)及合成。一般來(lái)說(shuō)，探針?lè)肿討?yīng)以活性化合物為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)，同時(shí)探針?lè)肿涌梢耘c靶標(biāo)蛋白共價(jià)結(jié)合，但在探針合成的過(guò)程中引入的標(biāo)記物會(huì)影響小分子化合物的活性，點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry）及光親和標(biāo)記技術(shù)（photoaffinity labeling technique）的引入進(jìn)一步開(kāi)拓了ABPP技術(shù)的適用范圍［25］，具體流程如圖2所示。

圖2 基于親和蛋白質(zhì)組分析策略Fig.2 Analysis strategies based on affinity proteomic

ABPP技術(shù)最初用于某一類蛋白質(zhì)的活性監(jiān)測(cè)，如半胱天冬酶、絲氨酸水解酶等［26］。除此之外，ABPP還可以作為工具來(lái)研究某一類化合物的具體作用機(jī)制，確定其有效官能團(tuán)或者骨架，為開(kāi)發(fā)更有效的藥物提供基礎(chǔ)［27］。近年來(lái)，利用ABPP鑒定小分子化合物在全蛋白組水平的作用靶標(biāo)也得到了越來(lái)越多的應(yīng)用，該技術(shù)以天然產(chǎn)物分子骨架中特定官能團(tuán)的活性/功能為基礎(chǔ)，選擇相應(yīng)的活性探針，利用競(jìng)爭(zhēng)性策略篩選靶標(biāo)蛋白［28］，主要通過(guò)如下手段來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1.2.1 生物素修飾 生物素修飾是一種被廣泛應(yīng)用的親和純化方法，生物素能與鏈霉抗生素蛋白（streptavidin）和親和素（neutr avidin）特異性結(jié)合，是目前已知蛋白-配體作用力中最強(qiáng)的一種，因此鏈霉抗生素蛋白或親和素常被用于與生物素結(jié)合來(lái)富集、純化和識(shí)別活性小分子在細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是生物素修飾的小分子化合物可以在進(jìn)行親和純化之前，與細(xì)胞蛋白質(zhì)組甚至與細(xì)胞膜內(nèi)的靶蛋白充分接觸。生物素富集方式主要為生物素與鏈霉親和素不可逆結(jié)合，因此會(huì)對(duì)ABPP工作流程的復(fù)雜程度和質(zhì)譜能檢測(cè)到的蛋白數(shù)量產(chǎn)生較大影響，因而被不斷優(yōu)化與開(kāi)發(fā)，如2019年，Zanon等［29］開(kāi)發(fā)了一種脫硫生物素（desthiobiotin, DTB，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3）標(biāo)簽可被輕松洗脫，排除了內(nèi)源生物素化的干擾，減少了肽段的損失，通過(guò)合成帶有DTB標(biāo)簽的探針?lè)肿优c金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)組進(jìn)行孵育，結(jié)果表明，帶有DTB標(biāo)簽的探針?lè)肿硬僮髌饋?lái)較為簡(jiǎn)便，同時(shí)增加了金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)組中半胱氨酸的覆蓋率。

圖3 DTB 標(biāo)簽的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of DTB label

Eriocalyxin B是從中草藥枇杷素中提取的抗腫瘤有效成分，Kong等［30］采用生物素富集的方式對(duì)Eriocalyxin B的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行富集，成功鑒定到P50蛋白為其靶標(biāo)蛋白。小白菊內(nèi)酯具有抗炎活性，為確定其在體內(nèi)的直接作用靶點(diǎn)，Kwok等［31］對(duì)小白菊內(nèi)酯結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造以合成親和素探針，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)脂可特異性結(jié)合并抑制IκB kinase β（IKKβ），導(dǎo)致核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）活化的喪失，為開(kāi)發(fā)新的抗炎藥物提供了方向。此外，表1列舉了近5年通過(guò)生物素富集進(jìn)行小分子化合物靶標(biāo)鑒定及作用機(jī)制探究的實(shí)例。

表1 生物素探針用于小分子化合物的靶點(diǎn)鑒定實(shí)例Table 1 Examples of biotin probes used for the target identification of small molecular compounds

1.2.2 生物正交化學(xué)反應(yīng) 生物素標(biāo)記的探針?lè)肿与m然被廣泛應(yīng)用, 但由于生物素體積較大，一般會(huì)影響小分子化合物的原始活性，造成活性下降或者消失，不利于靶標(biāo)蛋白的鑒定。隨著生物正交概念的出現(xiàn)及其反應(yīng)類型的不斷擴(kuò)充，生物正交反應(yīng)被引入到探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)中。原有的生物素標(biāo)簽被替換為結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的生物正交基團(tuán)——疊氮或炔基，后續(xù)可通過(guò) Cu（I）催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成（Cu（I）-catalyzed azide-alkyne cycloaddition, CuAAC）反應(yīng)連接上報(bào)告基團(tuán)［38］。在試驗(yàn)過(guò)程中，活性探針通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行靶向標(biāo)記，而后再憑借其末端手柄與報(bào)告基團(tuán)共價(jià)交聯(lián)，從而達(dá)到可視化呈現(xiàn)與富集下拉等目的。該設(shè)計(jì)可以減小探針的空間位阻，優(yōu)化探針對(duì)于靶標(biāo)蛋白的標(biāo)記效果，同時(shí)簡(jiǎn)化合成步驟，降低整個(gè)實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜程度。近年來(lái)，在天然產(chǎn)物骨架中引入生物正交反應(yīng)基團(tuán)是應(yīng)用最為廣泛的靶點(diǎn)鑒定策略之一。許多天然產(chǎn)物的作用靶標(biāo)在應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)合成探針后被解析，如膽固醇、姜黃素及青蒿素等［39-41］。甲磺酰菌唑作為高殺菌活性的候選藥物，Chen等［42］采用ABPP策略系統(tǒng)地研究了其作用機(jī)制，利用生物正交化學(xué)反應(yīng)設(shè)計(jì)親和探針成功鑒定到二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（dihydrolipoamide S-succinyltransferase, DLST）為其作用靶標(biāo)，為DLST作為殺菌劑靶標(biāo)及其抑制劑的創(chuàng)制打下了良好基礎(chǔ)。近5年基于CC-ABPP鑒定小分子化合物靶標(biāo)的實(shí)例如表2所示，該方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。

1.2.3 光親和基團(tuán)探針 上述所有化學(xué)探針均具有活性基團(tuán)，可以共價(jià)修飾靶蛋白中的氨基酸殘基，從而在點(diǎn)擊反應(yīng)和富集過(guò)程中使探針與靶標(biāo)之間穩(wěn)定結(jié)合，但不是所有化合物都以共價(jià)修飾的方式與靶標(biāo)蛋白結(jié)合，并且由于磁珠等外部因素的影響，易造成假陽(yáng)性的結(jié)果。對(duì)于這種情況，研究人員利用合成的光敏性小分子化合物作為探針開(kāi)發(fā)了光親和標(biāo)記法，形成具有位點(diǎn)特異性的不可逆共價(jià)結(jié)合，在藥物靶點(diǎn)的研究中發(fā)揮巨大作用。光親和標(biāo)記結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的在全細(xì)胞蛋白質(zhì)組水平上鑒定藥物分子的作用靶標(biāo)最有效的方法之一［49］。

茉莉酸（jasmonates, JA）是一種調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的植物激素，內(nèi)源性活性JA分子與F-box蛋白COI1和JAZ阻遏物形成復(fù)合物，以COI1依賴的方式通過(guò)26S蛋白酶體途徑誘導(dǎo)JAZ降解。為了揭示COI1能否與Jas直接結(jié)合，Yan等［50］設(shè)計(jì)了一系列光親和探針以驗(yàn)證COI1與Jas直接結(jié)合，為進(jìn)一步闡明茉莉素的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。除此之外，通過(guò)光親和探針進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別的代表性天然產(chǎn)物還有萬(wàn)古霉素［51］和環(huán)孢菌素［52］等。近5年通過(guò)光親和探針鑒定小分子化合物的靶標(biāo)實(shí)例如表3所示。

以上不同的探針合成方法都在小分子化合物靶標(biāo)鑒定過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，理論上親和磁珠、生物素及光親和基團(tuán)標(biāo)記的探針主要作用于細(xì)胞裂解液內(nèi)，用來(lái)富集與小分子化合物作用的靶標(biāo)蛋白，但不能獲得較為全面的靶標(biāo)蛋白。利用生物正交化學(xué)反應(yīng)合成的探針可作用于活細(xì)胞內(nèi)，獲取的靶標(biāo)蛋白較為全面，但同時(shí)也會(huì)存在非特異性結(jié)合造成假陽(yáng)性。當(dāng)同一化合物在不同官能團(tuán)設(shè)計(jì)合成探針，或者設(shè)計(jì)不同類型的探針，最后得到的標(biāo)記蛋白可能會(huì)有所不同［57-59］。因此在引入報(bào)告基因時(shí)應(yīng)盡可能保證小分子化合物的活性不會(huì)發(fā)生改變，同時(shí)需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置未加入探針的陰性對(duì)照。

2 非標(biāo)記化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識(shí)別方法

雖然基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識(shí)別方法已經(jīng)完善并廣泛應(yīng)用，但是這些方法仍然存在局限性?；跇?biāo)記法的靶標(biāo)鑒定方法需要對(duì)化合物進(jìn)行修飾，這往往會(huì)導(dǎo)致化合物活性改變甚至是喪失活性，同時(shí)部分小分子化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，沒(méi)有合適的修飾位點(diǎn)，這些都成為基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識(shí)別鑒定的干擾因素。隨著藥物靶標(biāo)識(shí)別方法的不斷發(fā)展，人們對(duì)小分子化合物結(jié)合靶標(biāo)蛋白后蛋白酶水解、化學(xué)變性和熱變性的認(rèn)識(shí)逐漸加深，非標(biāo)記化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識(shí)別方法應(yīng)運(yùn)而生。這些方法不需要對(duì)小分子化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，并且可以有效地篩選混合化合物中的目標(biāo)蛋白，較為快速的確定藥物的作用機(jī)制，有利于促進(jìn)天然產(chǎn)物藥物的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用，可對(duì)ABPP方法進(jìn)行必要補(bǔ)充。圖4列舉出了常見(jiàn)的基于非標(biāo)記化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)識(shí)別小分子化合物靶標(biāo)的示意圖。

圖4 非標(biāo)記法識(shí)別藥物靶標(biāo)蛋白策略Fig.4 Schematics of label-free target identification methods

2.1 藥物親和力反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性

藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）技術(shù)的概念最初由Lomenick等［60］在2009年提出并進(jìn)行的相關(guān)研究。該研究組推測(cè)藥物與靶蛋白結(jié)合后，靶標(biāo)蛋白會(huì)增強(qiáng)抗蛋白酶水解的能力，而在結(jié)合前后穩(wěn)定性發(fā)生變化的蛋白質(zhì)可以通過(guò)電泳檢測(cè)到，然后通過(guò)質(zhì)譜分析來(lái)確定小分子的直接靶點(diǎn)。該課題組首先通過(guò)雷帕霉素和FK506及其已知靶蛋白FKBP12驗(yàn)證了該方法的可行性，然后通過(guò)DARTS技術(shù)鑒定了白藜蘆醇的作用靶標(biāo)eIF4A。由于DARTS 技術(shù)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，得到了廣泛的應(yīng)用。Zhang等［61］運(yùn)用DARTS的策略發(fā)現(xiàn)Src激酶可以作為苦參堿的靶標(biāo)，這與親和層析的結(jié)果一致。Kim等［62］通過(guò)DARTS和MSI的系統(tǒng)結(jié)合，鑒定和驗(yàn)證VEGFR2激酶作為Voacangine的靶標(biāo)。Zhu等［63］采用 DARTS 技術(shù)篩選出 349 個(gè)與人參皂苷相關(guān)蛋白靶點(diǎn)，并最終確定人參皂苷可能通過(guò)靶向呼吸鏈復(fù)合物I和調(diào)節(jié)線粒體功能來(lái)緩解輕度認(rèn)知障礙。除此之外，利用該技術(shù)還找到了新型殺菌劑YZK-C22的靶標(biāo)蛋白丙酮酸激酶［64］、帕金森潛在治療藥物Andrographolide的靶蛋白DRP1（dynamin-related protein 1）［65］、結(jié)腸癌治療藥物Azelastine的靶蛋白ARF1（ADP-ribosylation factor 1）［66］。DARTS試驗(yàn)具有不需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾且不要求蛋白質(zhì)的純度，同時(shí)也不要求化合物的形式，既可以是單一的化合物，也可以是復(fù)雜的天然產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)［67］，這為確定天然產(chǎn)物的作用靶標(biāo)提供了有利條件。但由于DARTS試驗(yàn)后期主要依賴于SDS-PAGE和凝膠染色觀察，對(duì)蛋白豐度較低的蛋白鑒定有限［60］，同時(shí)DARTS試驗(yàn)選擇的裂解液和蛋白酶類型也會(huì)影響天然產(chǎn)物靶標(biāo)的鑒定［68］，這些因素也會(huì)限制DARTS技術(shù)的準(zhǔn)確性。

2.2 細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移分析

蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析（cellular thermal shift assay, CETSA）2013年由Molina等［69］首次提出，CETSA基于傳統(tǒng)的熱移位測(cè)定（thermal shift assay,TSA），該測(cè)定可檢測(cè)由配體結(jié)合誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化。這兩種方法最主要的區(qū)別是TSA是針對(duì)單個(gè)純化的重組蛋白或分離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的，而CETSA是用全細(xì)胞或細(xì)胞裂解物進(jìn)行的。CETSA最早通過(guò)PCR和蛋白免疫印跡（western blot）顯示靶標(biāo)結(jié)合情況，但這種方法鑒定出的蛋白數(shù)量有限而且工作量大，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，Savitski等［70］將CETSA與質(zhì)譜結(jié)合起來(lái)，建立起完整的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。辣椒素對(duì)癌細(xì)胞具有抑制活性，有證據(jù)表明辣椒素可以抑制與腫瘤相關(guān)的NADH氧化酶（tumor-associated NADH oxidase, tNOX），Islam等［71］利用CETSA技術(shù)發(fā)現(xiàn)辣椒素可以與tNOX結(jié)合并使tNOX降解。Dziekan等［72］利用CETSA結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，研究了奎寧和甲氟喹兩種抗瘧疾藥物的靶標(biāo)，證實(shí)了嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase, PfPNP）是這兩種藥物的共同靶標(biāo)。Destruxin A（DA）是一種環(huán)肽霉菌毒素，因其良好的殺蟲(chóng)活性具有成為新型殺蟲(chóng)劑的潛力，有研究表明DA參與轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)且精氨酸t(yī)RNA合成酶（BmArgRS）、Lamin-C蛋白（BmLamin-C）和ATP依賴性RNA解旋酶PRP1（BmPRP1）為其候選結(jié)合蛋白，Wang等［73］通過(guò)CETSA技術(shù)驗(yàn)證DA與BmArgRS和BmLamin-C結(jié)合，為DA靶蛋白的發(fā)現(xiàn)及新型殺蟲(chóng)劑的創(chuàng)制提供了新的方向。

CETSA技術(shù)操作簡(jiǎn)單，受其他因素干擾較小，可直接在活細(xì)胞或整體組織水平進(jìn)行研究，是目前較為常用的靶標(biāo)識(shí)別方法之一。但由于某些靶標(biāo)不會(huì)因與配體相互作用而穩(wěn)定，或者在較高溫度下相互作用丟失，從而掩蓋了結(jié)合事件，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果［74］。為了克服 CETSA 的缺點(diǎn)，增加其在靶點(diǎn)和脫靶識(shí)別以及生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)上的應(yīng)用，Savitski等［70］在 2014 年開(kāi)發(fā)了基于CETSA的 TPP技術(shù)。TPP技術(shù)將CETSA技術(shù)與多重質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，用于藥物的靶標(biāo)鑒定。利用TMT-10標(biāo)簽進(jìn)行高通量篩選及鑒定，能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)10個(gè)溫度點(diǎn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后繪制熔解曲線以發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性差異蛋白。憑借高通量質(zhì)譜分析的優(yōu)勢(shì)，TPP方法被廣泛地用于測(cè)定藥物或其他小分子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化中。Li等［75］利用TPP技術(shù)發(fā)現(xiàn)Sp1可作為咔唑生物堿Murrayafoline A（MA）的直接靶標(biāo)，并阻斷IKKβ/NF-κB和p38/JNK MAPKs信號(hào)通路，為藥物靶向Sp1用于神經(jīng)炎癥治療以及新型藥物開(kāi)發(fā)提供了新方向。雖然TPP技術(shù)具有穩(wěn)定性好、可以同時(shí)鑒別多種蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，但其具有耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)膜蛋白檢測(cè)有限等不足，仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

2.3 氧化蛋白穩(wěn)定性

SPROX與DARTS試驗(yàn)類似，是基于蛋白質(zhì)折疊熱力學(xué)變化原理的無(wú)標(biāo)記靶標(biāo)識(shí)別方法，將細(xì)胞裂解產(chǎn)物用藥物分子處理后，與未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組同時(shí)用不同濃度的氯化胍（蛋白變性劑）處理氧化，蛋白質(zhì)被消化成多肽，對(duì)多肽片段中被氧化的殘基進(jìn)行質(zhì)譜分析。Hatstat等［76］通過(guò)SPROX等技術(shù)鑒定N-芳基苯并咪唑化合物NAB2的靶標(biāo)，并鑒定到一個(gè)全新的靶標(biāo)Rab1a（一種GTP酶），這一發(fā)現(xiàn)增加了對(duì)NAB2減輕α-突觸核蛋白毒性的機(jī)制的理解。此外，SPROX技術(shù)還可以與SILAC技術(shù)和iTRAQ技術(shù)相結(jié)合，Ogburn等［77］將SPROX 技術(shù)和SILAC技術(shù)結(jié)合，共鑒定出他莫昔芬（tamoxifen, TAM）和N-去甲基他莫昔芬（N-desmethyl tamoxifen, NDT）的結(jié)合蛋白163種和200種，其中Y-box結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein 1, YBX1）可作為T(mén)AM的直接作用靶標(biāo)。Geer Wallace等［78］將SPROX技術(shù)與iTRAQ技術(shù)相結(jié)合，鑒定出抗癌藥物Manassantin A的靶點(diǎn)蛋白，為闡明其作用機(jī)制提供了新的理論支撐。雖然 SPROX 技術(shù)具有較好的應(yīng)用潛力，但也存在一些不足：首先，由于甲硫氨酸氧化是測(cè)量參數(shù)，SPROX技術(shù)只能用于分析含有甲硫氨酸的肽段；其次，不同的甲硫氨酸殘基可能表現(xiàn)出相同的氧化速率［79］。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要添加一定的氧化劑，因此SPORX并不適用于活細(xì)胞測(cè)定。

2.4 靶標(biāo)結(jié)合可及性變化譜

靶標(biāo)結(jié)合可及性變化譜（target-responsive accessibility profiling, TRAP）通過(guò)在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上監(jiān)測(cè)配體誘導(dǎo)的賴氨酸可及性變化，來(lái)識(shí)別細(xì)胞環(huán)境中藥物分子的結(jié)合蛋白。該方法通過(guò)對(duì)反應(yīng)性賴氨酸的可及性變化的全局分析，來(lái)測(cè)量由于配體結(jié)合而在蛋白質(zhì)靶標(biāo)中誘導(dǎo)的空間位阻。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在藥物分子存在時(shí)表現(xiàn)出顯著豐度變化的小分子肽段被稱為靶標(biāo)反應(yīng)肽［80］。Zhu等［81］通過(guò)TRAP技術(shù)篩選到雷公藤紅素的結(jié)合蛋白CAP1，雷公藤紅素通過(guò)CAP1抑制巨噬細(xì)胞cAMP-PKA-NF-κB信號(hào)通路，從而改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠代謝綜合征。環(huán)黃芪醇具有抗病毒、抗衰老、抗炎等功能，Deng等［82］通過(guò)TRAP技術(shù)尋找環(huán)黃芪醇的作用靶點(diǎn)，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B（cathepsin B, CTSB）為CAG直接靶點(diǎn)。

2.5 色譜共洗脫

色譜共洗脫（target identification by chromatographic co-elution, TICC）是一種在非變性條件下，利用液相色譜技術(shù)檢測(cè)小分子化合物靶蛋白的方法［83］。與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后，小分子化合物在液相色譜中的保留時(shí)間將與結(jié)合蛋白的保留時(shí)間一致。隨后，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)與小分子化合物同時(shí)洗脫的蛋白質(zhì)就可以獲取關(guān)于候選靶標(biāo)蛋白的信息。利用該策略，Emili課題組鑒定了抗真菌天然產(chǎn)物 4513-0042的靶標(biāo)蛋白 Erg6p［83］。TICC主要用于研究真核系統(tǒng)中的藥物-靶點(diǎn)相互作用。2020年，Sch?kermann等［84］用TICC技術(shù)鑒定抗生素靶點(diǎn)，證明了TICC適用于抗生素研究。通過(guò)合理的色譜保留時(shí)間，大量潛在的抗生素靶標(biāo)（臨床相關(guān)的抗生素靶標(biāo)以及必需蛋白質(zhì)）被覆蓋，蛋白質(zhì)復(fù)合物得以完整保存。該方法不需要藥物或蛋白質(zhì)的固定化或衍生化，適用于多種天然產(chǎn)物和合成化合物。同時(shí)該方法可以檢測(cè)較低豐度的蛋白，但該方法對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性要求較高，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)受其他共洗脫蛋白的影響。

3 總結(jié)與展望

我國(guó)天然產(chǎn)物資源豐富，但是由于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且可能會(huì)有“多成分、多靶點(diǎn)”的情況，通過(guò)對(duì)其靶點(diǎn)鑒定及作用機(jī)制解析，可以優(yōu)化并指導(dǎo)藥物研究［6,85］。早期農(nóng)藥靶標(biāo)與作用機(jī)制的研究往往采用生理生化的方法，從藥物對(duì)生物表型、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素分布和各類氧化還原酶的影響方面進(jìn)行研究，現(xiàn)在樣品制備方法與檢測(cè)儀器都有了很大的改善，新型藥物靶標(biāo)與作用機(jī)制的研究已經(jīng)更加深入精準(zhǔn)［86］。本文綜述了幾種靶標(biāo)鑒定的方法，化學(xué)修飾法是最早應(yīng)用于靶標(biāo)鑒定的方法，然而天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、可修飾位點(diǎn)有限，同時(shí)結(jié)合小分子標(biāo)簽后可能會(huì)改變化合物活性，因此并不一定適用于天然產(chǎn)物的靶點(diǎn)鑒定。基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的直接親和富集的方法是小分子靶點(diǎn)識(shí)別的主流方法，非標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法也為尋找小分子化學(xué)物的靶標(biāo)提供了新的選擇。此外，基于表型篩選的鑒定策略，針對(duì)基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)鑒定方法的缺陷，提供了很好的補(bǔ)充和輔助。

當(dāng)前，我國(guó)在新農(nóng)藥創(chuàng)制方面仍面臨著許多挑戰(zhàn)，如農(nóng)藥品種和劑型老化、原創(chuàng)靶標(biāo)少、對(duì)現(xiàn)有農(nóng)藥抗性加劇、新劑型短缺等［2］。開(kāi)發(fā)高效、低毒、選擇性好、安全系數(shù)高的綠色農(nóng)藥已成為農(nóng)藥研發(fā)的重要目標(biāo)。在新農(nóng)藥創(chuàng)制過(guò)程中，新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)具有十分重要的意義。新靶標(biāo)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不僅會(huì)成為一系列農(nóng)藥創(chuàng)制的突破口，還將延緩抗性問(wèn)題，為病蟲(chóng)草害的防治提供幫助。同基于表型篩選的方法進(jìn)行新農(nóng)藥創(chuàng)制相比，基于靶標(biāo)的藥物創(chuàng)制由于其靶標(biāo)已知，會(huì)耗時(shí)更短、更簡(jiǎn)便、花費(fèi)更少［87］，同時(shí)相較于基于表型篩選的藥物，對(duì)作物更加安全，在農(nóng)藥研發(fā)過(guò)程中的重要性不言而喻。但無(wú)論哪種方法，得到的靶標(biāo)蛋白都不是確切的，需要通過(guò)多種方式進(jìn)行驗(yàn)證。隨著化學(xué)蛋白質(zhì)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于鑒定化合物蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥上，對(duì)于農(nóng)藥創(chuàng)制而言，可以借鑒其中的鑒定技術(shù)，通過(guò)上述各種化學(xué)生物學(xué)研究策略和技術(shù)手段識(shí)別天然產(chǎn)物復(fù)雜體系的直接靶標(biāo)，從根本上闡明其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，這對(duì)于新農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和創(chuàng)制具有重要意義。