膳食GM1對AD小鼠神經(jīng)節(jié)苷脂代謝的調(diào)控作用

劉斌，王志高，王曉旭，馬迎旭，叢培旭，宋雨，徐杰，薛長湖

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

神經(jīng)節(jié)苷脂（gangliosides，GLS）是含有唾液酸的鞘糖脂類化合物，其中帶負(fù)電荷的親水聚糖頭基與疏水性神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）尾部相連[1]。糖鏈中糖組成和結(jié)構(gòu)的變化與脂質(zhì)部分的長度、飽和度和羥基化賦予了GLS 廣泛的多樣性，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種GLS 分子種類[2]。GLS 高度集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中，在記憶形成、神經(jīng)發(fā)生、突觸傳遞和其他神經(jīng)功能中發(fā)揮重要作用，并與細(xì)胞識別、細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及離子通道調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能密切相關(guān)[3]。研究表明GLS 的數(shù)量和種類在細(xì)胞分化過程中會發(fā)生變化[4]，鑒于內(nèi)源性GLS 在神經(jīng)方面的重要功能，對GLS 的定量分析顯得十分必要。

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（monosialotetrahexosyl ganglioside，GM1）是CNS 中最豐富的一類GLS，存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜中[1]，具有調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運、神經(jīng)元分化、神經(jīng)保護信號傳導(dǎo)的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，通過外源攝入GM1可改善氯胺酮誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知障礙和海馬細(xì)胞凋亡[6]；在體外神經(jīng)干細(xì)胞中，GM1干預(yù)減輕了丙泊酚與瑞芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[7]，表明外源GM1在神經(jīng)損傷和神經(jīng)變性的體內(nèi)外模型中展現(xiàn)出神經(jīng)保護作用。隨著GLS 在維持大腦認(rèn)知功能的重要性日益顯現(xiàn)，其膳食來源越來越被重視。GLS 存在于蛋、肉等動物源食品中[8]，其中哺乳動物的腦組織是GM1的重要來源，目前國內(nèi)外主要從豬腦、牛腦等食用腦中進行提取和分離純化[9]。

阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一類進行性神經(jīng)退行性疾病，與神經(jīng)元進行性喪失有關(guān)，主要癥狀是記憶和認(rèn)知功能下降[10]。AD 在老齡化人群中患病率高，且暫無治愈的方法。在AD 體內(nèi)外模型中，外源GM1表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護作用[11-12]。淀粉樣蛋白和人早老蛋白1（APPswe/PS1dE9，APP/PS1）雙轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶嵌合的淀粉樣蛋白前體蛋白和突變的人早老蛋白1，具有AD 的神經(jīng)行為功能障礙[13]，是探究GM1對AD 作用的良好模型。AD 患者體內(nèi)GLS 水平顯著改變[14]，推測GLS 代謝的改變可能反映AD 的發(fā)病進程，與AD 發(fā)病機制有關(guān)，然而過往因技術(shù)受限無法精確定量。三重四極桿結(jié)合多級反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式能夠靶向研究GLS 代謝，進而為預(yù)防與治療AD 提供策略[15]。液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）能夠?qū)ι飿颖局蠫LS 進行準(zhǔn)確的定量分析[16]。因此本研究采用APP/PS1 小鼠作為AD 模型，基于LC-MS 方法結(jié)合分子生物學(xué)手段，探究膳食GM1對AD 小鼠內(nèi)源GLS 代謝的影響及機制，以期為GM1在食品和藥品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF 級APP/PS1 雄性小鼠以及同窩野生型雄性小鼠（C57BL/6J，5月齡，體重20～25 g）：北京唯尚立德生物科技有限公司。

冰凍豬腦：杭州慧康食品有限公司；氯仿、甲醇（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、異丙醇（均為色譜級）：美國Thermo Fisher 公司；GM1、二唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（disialotetrahexosyl ganglioside，GD1）、三唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（trisialotetrahexosyl ganglioside，GT1）、四唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（tetrasialotetrahexosyl ganglioside，GQ1）標(biāo)準(zhǔn)品：美國Cayman Chemical 公司；氘代神經(jīng)節(jié)苷脂d3-GM3：美國Avanti Polar Lipids 公司；ACQUITY UPLC BEH 液相色譜柱（150 mm×1 mm，1.7μm）：美國Waters 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；OMEGA 總DNA/RNA/蛋白質(zhì)共提取試劑盒：廣州飛揚生物工程有限公司；5×All-In-One MasterMiX 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國Abcam 公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MED-VWM Morris 水迷宮裝置：上海贊德儀器有限公司；Ultimate 3000 RSLCnano 液相系統(tǒng)、Nanodrop 2000 超微量分光光度計：美國Thermo Scientific 公司；4000Q TRAP 三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀：美國SCIEX 公司；iCycler iQ5 系統(tǒng)實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增儀：美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 豬腦中GM1的提取

參考孫玉[17]的方法，略作修改，冷凍豬腦解凍后用氯仿∶甲醇∶水體系（4 ∶8 ∶3，體積比）提取，攪拌后離心（4 ℃，30 min，2 000×g）后收集上清液，隨后加水調(diào)整體系為氯仿∶甲醇∶水=4 ∶8 ∶5.6（體積比），離心（4 ℃，30 min，2 000×g）后取上清過Daisogel-SP120-C8 色譜柱（3.5 cm×20 cm，40～60 μm）脫鹽，回收的神經(jīng)節(jié)苷脂重新溶解在氯仿∶甲醇∶水（30 ∶60 ∶8，體積比）中，并于DEAE-Sephadex A25 色譜柱（1.7 cm×45 cm，40～120 μm）梯度洗脫，最后使用電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒定，GM1純度大于90%。

1.3.2 實驗動物分組與受試

8 只C57BL/6J 小鼠和16 只APP/PS1 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，分為3 組（n=8），正常組：C57BL/6J 小鼠，飼喂AIN-93G 標(biāo)準(zhǔn)飼料；模型組：APP/PS1 小鼠，飼喂AIN-93G 標(biāo)準(zhǔn)飼料；GM1組：APP/PS1 小鼠，飼喂AIN-93G 標(biāo)準(zhǔn)飼料+50 mg/（kg·d）GM1。所有小鼠實行雙水瓶喂養(yǎng)，保證有足夠的活動空間，持續(xù)喂養(yǎng)3 個月后進行各項指標(biāo)的檢測。所有程序在中國海洋大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)的協(xié)議基礎(chǔ)上進行。

1.3.3 Morris 水迷宮行為學(xué)分析

水迷宮中加入白色素鈦白粉，水溫設(shè)定為（22±1）℃。將水迷宮分為4 個象限，平臺放置在任一象限中點并淹沒在水面下方約1 cm 的位置。定位航行實驗中首先訓(xùn)練所有小鼠經(jīng)過4 條路徑找到平臺，每個實驗日將小鼠放置在水池中開始尋找試驗。記錄小鼠找到平臺的時間即為逃逸潛伏期，若逃逸潛伏期超過60 s則記為60 s。最后一天進行空間探索測試：移出平臺，小鼠在泳池內(nèi)自由游泳60 s，記錄小鼠在目標(biāo)象限停留的時間及穿越平臺位置的次數(shù)。

1.3.4 小鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)節(jié)苷脂的提取

基于Svennerholm 等[18]的方法進行神經(jīng)節(jié)苷脂的提取。取小鼠腦皮質(zhì)，添加9 倍體積超純水，冷凍研磨配制成10%組織勻漿液。根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，吸取等量蛋白含量對應(yīng)的組織勻漿液，利用超純水調(diào)整至相同體積。加入20 倍體積的氯仿∶甲醇（1 ∶2，體積比）和氘代內(nèi)標(biāo)渦旋振蕩，離心（4 ℃、20 min、2 000×g）取上層清液，加水調(diào)整溶劑體系至氯仿∶甲醇∶水為4 ∶8 ∶5.6（體積比），離心（4 ℃、20 min、2 000×g）收集上層水相即得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物。氮氣吹干后重新溶解在氯仿∶甲醇∶水（30 ∶60 ∶8，體積比）中，并于DEAE-Sephadex A25 色譜柱（6 mm×45 mm）梯度洗脫。

1.3.5 LC-MS 法分析小鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)節(jié)苷脂

基于Ikeda 等[19]的方法，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測皮質(zhì)中的神經(jīng)節(jié)苷脂，樣品在C18 柱（150 mm×0.3 mm）上分離。流速為7.5 μL/min，柱溫為45 ℃。流動相由流動相A：甲醇∶異丙醇∶水（55 ∶25 ∶20，體積比），200 mmol/L 乙酸銨和流動相B：甲醇∶異丙醇∶水（60 ∶40，體積比）組成。梯度洗脫程序：0～5 min，A；5～50 min，B；35 min，B。使用電噴霧離子源，在負(fù)離子模式下進行MRM 掃描，范圍為m/z200～2 300，噴霧電壓為-4 500 V。標(biāo)準(zhǔn)品GM1、GD1、GT1和GQ1的碰撞誘導(dǎo)解離（collision induced dissociation，CID）分別為-95、-55、-60、-60 eV。生物樣本中的GLS采用與GLS 標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)相近的CID 進行檢測。

1.3.6 神經(jīng)節(jié)苷脂代謝通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平檢測

采用OMEGA 總DNA/RNA/蛋白質(zhì)共提取試劑盒從小鼠皮質(zhì)中提取RNA，Nanodrop 分光光度計測定RNA 濃度后使用5×All-In-One MasterMiX 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入2×SYBR Green qPCR Master Mix 和上下游引物后對目的基因進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達(dá)水平。使用的引物序列如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

脂質(zhì)數(shù)據(jù)由Agilent MassHunter Quantitative Analysis 軟件分析，使用內(nèi)標(biāo)校正的外標(biāo)曲線對GLS 進行定量分析。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。由Graphpad prism 8.0 作圖和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GM1 對APP/PS1 小鼠行為學(xué)的影響

采用Morris 水迷宮觀測分析GM1對APP/PS1 小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的作用，結(jié)果見圖1。

圖1 GM1 對APP/PS1 小鼠行為學(xué)的影響Fig.1 Effect of GM1 on the behaviors of APP/PS1 mice

AD 小鼠存在學(xué)習(xí)與記憶障礙，顯著的行為學(xué)特征是定向失常和運動記憶缺陷，由圖1A 可知，第1 天到第5 天正常組小鼠逃逸潛伏期逐漸降低，第5 天模型組小鼠與正常組小鼠的逃避潛伏期差異高度顯著（p＜0.001），表明APP/PS1 小鼠的空間學(xué)習(xí)能力受損；GM1干預(yù)小鼠與模型組小鼠相比逃避潛伏期高度顯著降低（p＜0.001），表明GM1改善了APP/PS1 小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。由圖1B～圖1D 可知，在空間探索試驗中，模型組小鼠穿越平臺次數(shù)及在目標(biāo)象限停留時間與目標(biāo)象限停留時間百分比與正常組相比均高度顯著下降（p＜0.001），在GM1干預(yù)下，APP/PS1 小鼠的穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間及百分比高度顯著增加（p＜0.001）。表明GM1高度顯著改善了APP/PS1 小鼠的記憶能力。與Yang 等[20]的研究結(jié)果一致，表明外源GM1具有緩解AD 病癥的作用，對認(rèn)知功能產(chǎn)生了積極影響。

2.2 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)GLS 組成的影響

GLS 分類：按照Cer 中不飽和鍵數(shù)量，分為飽和脂肪酸GLS（saturated fatty acid-gangliosides，SFA-GLS）、單不飽和脂肪酸GLS（monounsaturated fatty acid-gangliosides，MUFA-GLS）和多不飽和脂肪酸GLS（polyunsaturated fatty acid-gangliosides，PUFA-GLS）；根據(jù)鏈長分類，包括長鏈脂肪酸GLS（long chain fatty acid-gangliosides，LCFA-GLS）和超長鏈脂肪酸GLS（very long chain fatty acid-gangliosides，VLCFA-GLS）；根據(jù)外部唾液酸羥基是否被乙?；?，可分為非乙酰化GLS（non-O-acetylation-gangliosides，non-OAc-GLS）和乙酰化GLS（O-acetylation-gangliosides，OAc-GLS）。LC-MS 分析小鼠腦皮質(zhì)中GLS 水平情況見表2。

表2 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)節(jié)苷脂含量的影響Table 2 Effects of GM1 on the contents of ganglioside in the cortex of APP/PS1 mice μg/mg 蛋白

GLS 水平的降低和特定GLS 相對豐度的變化可能在AD 中發(fā)生[21]。如表2所示，模型組總GLS 含量高度顯著下降（p＜0.001）。GM1組總GLS 含量高度顯著提高（p＜0.001）。

正常組小鼠以碳鏈組成為C36：1 和C38：1 的MUFA-GLS 為主，占總GLS 含量的59.6%。其次為SFA-GLS，最后為PUFA-GLS。與正常組相比，模型組中MUFA-GLS 和SFA-GLS 含量高度顯著降低（p＜0.001），GM1受試具有高度顯著回調(diào)作用（p＜0.001）。相較于正常組，模型組小鼠的PUFA-GLS 含量極顯著升高（p＜0.01），GM1干預(yù)有顯著降低作用（p＜0.05）。

由表2 可知，正常組小鼠中絕大多數(shù)以LCFA-GLS為主，占總GLS 含量的99.2%。模型組中LCFA-GLS和VLCFA-GLS 含量均高度顯著下降（p＜0.001），攝食GM1后LCFA-GLS 含量高度顯著上調(diào)（p＜0.001），VLCFAGLS 含量顯著升高（p＜0.05）。乙?；瘯?dǎo)致GLS 的生理性質(zhì)發(fā)生重大變化，正常組中non-OAc-GLS 和OAc-GLS 兩種GLS 含量水平相當(dāng)。與正常組相比，模型組中non-OAc-GLS 和OAc-GLS 含量均高度顯著降低（p＜0.001），GM1干預(yù)有高度顯著回調(diào)作用（p＜0.001）。這與Fukami 等[14]的研究結(jié)果一致，AD 模型中的多數(shù)GLS含量降低，但外源GM1能夠恢復(fù)GLS 總含量，并對不同飽和度、鏈長與乙?；腉LS 含量展現(xiàn)出顯著的調(diào)控效果。

利用LC-MS 對不同亞類的GLS 進行考察，結(jié)果見表3。

表3 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)節(jié)苷脂亞類量的影響Table 3 Effects of GM1 on the content of ganglioside subclass in the cortex of APP/PS1 mice μg/mg 蛋白

由表3 可知，共檢測到19 個亞類GLS，根據(jù)唾液酸數(shù)量可以分為5 類。單唾液酸GLS 包括GM1a和GM3，與正常組相比，模型組中GM1a和GM3含量均高度顯著上調(diào)（p＜0.001），攝入GM1能夠調(diào)控二者含量下降，回歸到正常組水平。雙唾液酸GLS 包括7 種GLS亞類。除GD1b和GD2以外，與正常組相比，APP/PS1 小鼠中雙唾液酸GLS 含量趨于減少，經(jīng)GM1干預(yù)后趨于升高，其中在GD1a、GD3和OAc-GD1b中調(diào)控效果高度顯著（p＜0.001）。三唾液酸GLS 包括4 種GLS 亞類，其中GT1b和di-OAc-GT1b含量在模型組小鼠中高度顯著下降（p＜0.001），GM1干預(yù)后GT1b 含量高度顯著上調(diào)（p＜0.001），di-OAc-GT1b含量極顯著升高（p＜0.01）。同樣在四唾液酸GLS 和五唾液酸GLS 組成中，與正常組相比，模型組小鼠GLS 含量高度顯著降低（p＜0.001），GM1干預(yù)后將其恢復(fù)至正常水平?？偟膩碚f，在APP/PS1 小鼠皮質(zhì)中，簡單GLS（GM1a和GM3）水平有所增加，復(fù)雜GLS 趨于減少，而攝食GM1逆轉(zhuǎn)了這一變化。

2.3 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)中GLS 分子種的影響

GM1對APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)中GLS 分子種的影響見圖2。

圖2 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)中GLS 分子種的影響Fig.2 Effect of GM1 on GLS molecular species in the cortex of APP/PS1 mice

分層聚類分析結(jié)果表示不同組間GLS 的變化情況，由圖2A 可知，與正常組相比，模型組的GLS 水平顯著變化，而攝食GM1能部分改善其水平。為了進一步研究正常組和模型組之間的GLS 差異，火山圖分析被用來篩選脂類生物標(biāo)志物。用≥1 或≤-1 的log2（FC）值區(qū)分兩組的GLS 種類。由圖2B 可知，模型組中4 種GLS 分子種發(fā)生了顯著上調(diào)，包括GM1（38：1）、GD1-GalNAc（36：2）、GD1a（40：2）、GD1a（42：3），它們可能是AD 潛在病理變化的重要生物標(biāo)志物。

2.4 GM1 對APP/PS1 小鼠GLS 代謝通路的影響

采用RT-qPCR 測定GLS 合成及分解基因的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果見圖3。

圖3 GM1 對APP/PS1 小鼠GLS 合成及分解基因的mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of GM1 on mRNA levels of genes involved in GLS synthesis and catabolism in APP/PS1 mice

唾液酸和糖基的組裝與轉(zhuǎn)移對GLS 合成起關(guān)鍵作用，st3gal5、st8sia1、b4galnt1、b3galnt4、st3gal2和soat是編碼糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸乙酰酯酶的基因[22-23]，如圖3A所示，與正常組相比，模型組小鼠腦皮質(zhì)中除b4galnt1外，其余GLS 合成基因mRNA 水平趨于降低，其中st3gal5、st8sia1極顯著降低（p＜0.01），GM1干預(yù)后的mRNA 水平均高度顯著回升（p＜0.001），從而促進GLS含量升高，與LC-MS 檢測結(jié)果相吻合。soat和siae分別促進與抑制OAc-GLS 的生成[22]。由圖3A 和圖3B可知，與正常組相比，模型組中soat和siae基因mRNA水平均有所下降，其中soat的mRNA 水平顯著降低（p＜0.05），經(jīng)GM1干預(yù)后，兩種基因的mRNA 水平有所回升，soat基因表達(dá)水平上調(diào)高度顯著（p＜0.001），表明GM1攝入能夠活躍OAc-GLS 代謝過程，且趨向于OAc-GLS 的合成。由圖3B 可知，在GLS 分解的基因g1b1、hexa、siae中，攝食GM1后，hexa基因的表達(dá)水平高度顯著下調(diào)（p＜0.001），與Okuda 等[24]的結(jié)果一致，hexa基因mRNA 水平的降低阻礙了復(fù)雜GLS 的降解，進一步佐證了LC-MS 分析的結(jié)果。推測APP/PS1小鼠攝食GM1經(jīng)消化吸收后，促進GLS 合成，進而穿越血腦屏障[25]，到達(dá)大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)對AD 起調(diào)控作用。

3 結(jié)論

本研究對攝食GM1的AD 小鼠內(nèi)源性GLS 的代謝調(diào)控機制進行研究，結(jié)果表明，GM1通過維持GLS代謝平衡進而緩解AD 病癥。首先行為學(xué)的結(jié)果表明攝食GM1可以改善APP/PS1 小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶障礙。其次，針對GM1的外源干預(yù)探究內(nèi)源性GLS 的變化規(guī)律，通過LC-MS 檢測分析發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腦皮質(zhì)GLS 總含量與多數(shù)復(fù)雜GLS 趨于減少，GM1回調(diào)GLS總水平與亞類水平。進一步對GLS 分子種的分析發(fā)現(xiàn)，較正常組相比模型組小鼠腦皮質(zhì)GLS 分子種發(fā)生明顯變化，GM1部分改善了這些變化，其中4 種GLS分子種被鑒定為AD 的潛在生物標(biāo)志物。LC-MS 的結(jié)果表明GLS 作為控制神經(jīng)元功能的重要角色參與了AD的病理過程，GM1具有緩解GLS 水平異常的作用。最后，借助RT-qPCR 分析GM1調(diào)控GLS 代謝機制中發(fā)現(xiàn)，GM1攝入能夠促進GLS 合成和抑制GLS 分解，從而調(diào)控APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)中GLS 代謝，并進一步印證了上述GLS 的水平變化。

綜上所述，膳食GM1能顯著提高APP/PS1 小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力，改善效果與回調(diào)腦皮質(zhì)中GLS水平密切相關(guān)，其機制可能是促進GLS 合成代謝。本研究可為GM1在功能性食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論參考。