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      蝦青素通過調(diào)節(jié)Klotho表達和Wnt/β-Catenin信號通路對多囊卵巢綜合征大鼠的改善作用

      2023-10-15 17:23:06宋玉朱爭艷黃桓李春魯晶泉劉和宇胡麗娜
      天津醫(yī)藥 2023年10期
      關鍵詞:青素卵巢劑量

      宋玉,朱爭艷,黃桓,李春,魯晶泉,劉和宇,胡麗娜

      多囊卵巢綜合征(PCOS)作為高發(fā)于育齡期女性的一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病,嚴重危害女性身體健康[1-2]。研究表明,炎癥是其發(fā)病的危險因素之一,抗炎和抗氧化治療可有效改善PCOS大鼠卵巢多囊樣改變、肥胖和激素紊亂等癥狀[3-4]。Klotho 是體內(nèi)的一種單向跨膜蛋白,可增強胰島素敏感性,起到抗凋亡、抗氧化應激、抗衰老和抗炎等作用,Klotho缺失會誘導炎癥反應和細胞凋亡,干擾細胞新陳代謝,導致小鼠早衰[5],且Klotho 在PCOS 患者血清中水平降低,與PCOS 的發(fā)生關系密切[6]。研究顯示,Wnt/β-Catenin 及MEK/ERK 是Klotho 的下游信號通路,參與介導Klotho 對炎癥的調(diào)控過程[5,7]。另外,Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 信號通路之間存在串擾,兩者相互作用并參與調(diào)控細胞凋亡和胚胎發(fā)育過程,激活Wnt/β-Catenin 信號通路和抑制MEK/ERK 信號通路可導致囊胚細胞凋亡率升高[8],且Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 參與介導PCOS 發(fā)病過程,下調(diào)Wnt/β-Catenin可改善PCOS癥狀[9],而ERK信號傳導受限可引發(fā)PCOS 患者排卵功能和代謝障礙[10],由此推測通過Klotho下調(diào)Wnt/β-Catenin及激活MEK/ERK 信號可能是PCOS 的潛在治療策略。蝦青素是一種天然酮基類胡蘿卜素,具有抗氧化、提高免疫力、抗炎等生物學功效,可有效清除活性氧及自由基,抑制炎性信號激活,改善動物精子活力及生殖激素分泌,從而提高其生殖性能[11],還可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin等信號來防治肝臟缺血再灌注損傷、非酒精性脂肪肝等肝臟疾?。?2]。本研究通過構建PCOS 大鼠模型,探究蝦青素能否通過Klotho 調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin和MEK/ERK信號改善PCOS癥狀。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 實驗動物 健康雌性SPF 級SD 大鼠95 只,6~7 周齡,體質(zhì)量190~220 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0004。在本院動物房中分籠適應飼養(yǎng),每籠大鼠不超過4 只,溫度23~25 ℃,濕度50%~60%,通風換氣10~12次/h,并且室內(nèi)維持屏障環(huán)境。

      1.1.2 試劑與儀器 來曲唑(純度98%)、蝦青素(純度≥98%)、羧甲基纖維素鈉(黏度:800~1 200 mPa·s)、氯化鋰(純度≥98.0%)以及大鼠白細胞介素(IL)-18、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α、前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;PD98059(純度98.22%)購自美國MCE 公司;Klotho siRNA 質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司;大鼠黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)ELISA 試劑盒及HE 染色試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;兔抗大鼠GAPDH抗體、BCA 蛋白檢測試劑盒、重組兔抗大鼠β-Catenin 抗體、兔抗大鼠p-MEK 抗體、兔抗大鼠ERK 抗體、兔抗大鼠Wnt1抗體、兔抗大鼠MEK 抗體、兔抗大鼠Klotho 抗體、兔抗大鼠p-ERK 抗體、HRP 偶聯(lián)羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司;二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

      酶聯(lián)免疫檢測儀(型號JD-SY96A,山東競道光電科技有限公司);加熱石蠟包埋機(型號G1150H)、病理輪轉切片機(型號RM2035)、生物光學顯微鏡(型號DM3000)、全自動脫水機(型號ASP200S)購自德國Leica公司;電泳儀基礎電源與小型蛋白電泳轉膜系統(tǒng)(型號PROTEAN)、凝膠成像系統(tǒng)(型號GelDocEZ)購自美國Bio-Rad公司;高速冷凍離心機(型號Fresco 21)購自美國Thermo Fisher公司。

      1.2 方法

      1.2.1 構建PCOS模型大鼠并分組處理后檢測其體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量 參照文獻[13],取32 只SD 大鼠,1 mg/kg 來曲唑溶液(溶于1%羧甲基纖維素鈉)灌胃,1 次/d,連續(xù)灌胃21 d。于造模第17 天開始每天上午7:00—8:00 收集陰道分泌物,制成陰道涂片后進行瑞氏染色,鏡下觀察各細胞形態(tài)及其比例,連續(xù)觀察5 d,若陰道涂片無動情周期性改變并基本維持在動情間期,且尾靜脈采血檢測血清T水平顯示較正常大鼠明顯升高,提示造模成功。將造模成功的30只大鼠以隨機數(shù)字表法分為模型組,蝦青素低、中、高劑量組,蝦青素高劑量+空載組,蝦青素高劑量+Klotho敲低組,每組5只,另取5只SD大鼠灌胃等劑量1%羧甲基纖維素鈉溶液作為對照組。

      將蝦青素和質(zhì)粒溶于生理鹽水制成溶液,蝦青素低、中、高劑量組分別以50、100、200 mg/kg 蝦青素灌胃(1 次/d)[14],同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho 敲低組相等劑量的生理鹽水(2 次/周);蝦青素高劑量+空載組、蝦青素高劑量+Klotho敲低組分別尾靜脈注射空載質(zhì)粒和Klotho siRNA質(zhì)粒溶液(2次/周),同時均以200 mg/kg蝦青素灌胃(1次/d);模型組、對照組以10 mL/kg生理鹽水灌胃(1次/d),同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho敲低組相等劑量的生理鹽水(2次/周),各組大鼠均處理3周后稱體質(zhì)量,然后以乙醚麻醉后斷頭處死,解剖取出卵巢稱質(zhì)量。

      1.2.2 再次構建PCOS 模型大鼠后分組處理 取49 只SD 大鼠,再次以同樣的方法成功構建PCOS 模型大鼠45 只,將其以隨機數(shù)字表法分為模型組、蝦青素組(200 mg/kg)、蝦青素(200 mg/kg)+Klotho 敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059組,每組9只,另取9只SD大鼠灌胃等劑量1%羧甲基纖維素鈉溶液作為對照組。對照組、模型組、蝦青素組和蝦青素+Klotho敲低組處理方法同1.2.1;蝦青素+氯化鋰組以200 mg/kg蝦青素灌胃,同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho敲低組相等劑量的生理鹽水(2 次/周)并腹腔注射15 mg/kg氯化鋰(1 次/d)[15];蝦青素+PD98059 組大鼠以200 mg/kg 蝦青素灌胃(1 次/d),同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho敲低組相等劑量的生理鹽水(2 次/周)并腹腔注射10 mg/kg的PD98059(1次/d)[16];各組大鼠均處理3周。

      1.2.3 體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積測定及標本采集 將1.2.2中各組大鼠于3周處理結束后24 h,稱其體質(zhì)量,接著以乙醚麻醉后采集尾靜脈血,離心(2 000 r/min、4 ℃、15 min)后獲得血清于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?;將大鼠斷頭處死,解剖取出卵巢并稱質(zhì)量,測長徑(L)和短徑(H),計算卵巢體積,體積=(π/6)×L×H2。然后剪取0.8 g卵巢組織于液氮中保存?zhèn)溆?,剩余卵巢組織常規(guī)固定并脫水,石蠟包埋后切片備用。

      1.2.4 卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量檢測 將1.2.3 中的卵巢組織切片浸入二甲苯中脫蠟,梯度乙醇水化,按試劑盒說明書進行HE染色,在光學顯微鏡下觀察卵巢形態(tài),隨機讀取5個視野拍照,使用Image J 軟件分析圖像,定量每組大鼠每個視野卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量,取平均值。

      1.2.5 血清FSH、LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平測定 將1.2.3 中血清提前取出后放入冰水浴中緩慢解凍,取0.4 mL 采用ELISA 試劑盒測定FSH、LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平,操作步驟嚴格依照各自說明書進行。

      1.2.6 卵巢組織Klotho 蛋白和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK 信號相關蛋白檢測 將1.2.3中凍存在液氮中的卵巢組織塊取出,剪碎,研磨,勻漿,離心(3 000 r/min、4 ℃、20 min)后獲得卵巢組織蛋白樣品液。測量其蛋白總濃度后煮沸使蛋白變性,每組取30 μg 總蛋白通過電泳分離,再通過電泳轉移到PVDF 膜上,將Klotho、GAPDH、Wnt1、β-Catenin、p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2 蛋白條帶裁下后封閉其非特異抗原,以各自兔抗大鼠一抗和山羊抗兔二抗孵育進行抗原抗體反應,化學發(fā)光法顯色后以凝膠成像系統(tǒng)采集各組蛋白條帶圖像,采用Image J軟件分析相對表達水平。

      1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析,符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結果

      2.1 蝦青素對大鼠體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量的影響 與對照組比較,模型組的體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,蝦青素低、中、高劑量組的體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量均降低,并呈劑量依賴性(P<0.05);與蝦青素高劑量組比較,蝦青素高劑量+Klotho 敲低組的體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量升高(P<0.05),蝦青素高劑量+空載組體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量無明顯變化(P>0.05),見表1。

      Tab.1 Comparison of body mass and ovary mass of rats between the seven groups表1 各組大鼠體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量比較(n=5,)

      Tab.1 Comparison of body mass and ovary mass of rats between the seven groups表1 各組大鼠體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量比較(n=5,)

      **P<0.01;a與對照組比較,b與模型組比較,c與蝦青素低劑量組比較,d與蝦青素中劑量組比較,e與蝦青素高劑量組比較,P<0.05。

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      2.2 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積比較 與對照組比較,模型組體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積明顯升高(P<0.05);與模型組比較,蝦青素組體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積降低(P<0.05);與蝦青素組比較,蝦青素+Klotho 敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059組體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積升高(P<0.05),見表2。

      Tab.2 Comparison of body mass,ovarian mass and volume of rats between the six groups表2 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積比較(n=9,)

      Tab.2 Comparison of body mass,ovarian mass and volume of rats between the six groups表2 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積比較(n=9,)

      **P<0.01;a與對照組比較,b與模型組比較,c與蝦青素組比較,P<0.05;表3—5同。

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      2.3 各組大鼠血清激素水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量比較 與對照組比較,模型組血清FSH 水平明顯降低,LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,蝦青素組血清FSH 水平升高,LH、T 水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量降低(P<0.05);與蝦青素組比較,蝦青素+Klotho 敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059組血清FSH水平均降低,LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量均升高(P<0.05),見圖1、表3。

      Fig.1 Histomorphology of ovaries of rats in each group observed by HE staining(×200)圖1 HE染色觀察各組大鼠卵巢組織形態(tài)(×200)

      Tab.3 Comparison of serum FSH,LH,T levels and number of follicles in ovarian tissue between the six groups表3 各組大鼠血清FSH、LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量比較(n=9,)

      Tab.3 Comparison of serum FSH,LH,T levels and number of follicles in ovarian tissue between the six groups表3 各組大鼠血清FSH、LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量比較(n=9,)

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      2.4 各組大鼠血清炎性因子水平比較 與對照組比較,模型組血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平升高(P<0.05);與模型組比較,蝦青素組血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平降低(P<0.05);與蝦青素組比較,蝦青素+Klotho敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059 組血清PGE2、IL-17、TNFα、IL-18水平均升高(P<0.05),見表4。

      Tab.4 Comparison of serum PGE2,IL-17,TNF-α and IL-18 levels of rats between the six groups表4 各組大鼠血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平比較(n=9,ng/L,)

      Tab.4 Comparison of serum PGE2,IL-17,TNF-α and IL-18 levels of rats between the six groups表4 各組大鼠血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平比較(n=9,ng/L,)

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      2.5 各組大鼠卵巢組織Klotho 和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白表達比較 與對照組比較,模型組卵巢組織Klotho、p-MEK、p-ERK1/2 蛋白表達降低,Wnt1、β-Catenin 蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組比較,蝦青素組卵巢組織Klotho、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達升高,Wnt1、β-Catenin蛋白表達降低(P<0.05)。與蝦青素組比較,蝦青素+Klotho敲低組卵巢組織Klotho、p-MEK和p-ERK1/2蛋白表達降低,Wnt1、β-Catenin 蛋白表達升高(P<0.05);蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059 組卵巢組織Klotho 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義,p-MEK、p-ERK1/2 表達降低,Wnt1、β-Catenin 蛋白表達升高(均P<0.05),見圖2、表5。

      Fig.2 Expression of Klotho protein and Wnt/β-Catenin,MEK/ERK signal related protein in ovarian tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖2 免疫印跡檢測各組大鼠卵巢組織Klotho蛋白表達和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白表達

      Tab.5 Comparison of the relative expression level of Klotho,Wnt/β-Catenin,MEK/ERK signal related proteins in ovaries of rats between the six groups表5 各組大鼠卵巢組織Klotho蛋白和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白相對表達水平比較(n=9,)

      Tab.5 Comparison of the relative expression level of Klotho,Wnt/β-Catenin,MEK/ERK signal related proteins in ovaries of rats between the six groups表5 各組大鼠卵巢組織Klotho蛋白和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白相對表達水平比較(n=9,)

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      3 討論

      PCOS臨床治療以激素類藥物為主,但長期應用存在較多不良反應且停藥后易復發(fā)。本研究通過對SD 大鼠灌胃來曲唑的方法構建PCOS 模型,大鼠血清FSH 水平降低,體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積、囊狀卵泡數(shù)量以及血清LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平升高,說明來曲唑可促使炎性因子表達,引發(fā)炎癥反應,誘導大鼠出現(xiàn)雄性激素升高等性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀,損傷卵巢形態(tài)功能,提示PCOS模型構建成功。蝦青素是提取自海洋生物的一種天然次生類胡蘿卜素,抗氧化、抗炎作用明顯,具有藥用價值,可明顯降低活性氧及自由基水平,阻斷炎性信號活化傳導,減輕動物機體氧化應激及炎性損害,并可改善動物生殖激素平衡及其生殖能力[11],還可通過抑制活性氧產(chǎn)生及炎癥反應而減輕碘海醇誘導的腎細胞凋亡和急性腎損傷[17]。本研究結果顯示,以不同劑量蝦青素處理PCOS 大鼠,可呈劑量依賴性降低其體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量;另外以200 mg/kg 蝦青素處理PCOS 大鼠,可升高其血清FSH 水平,降低體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積、囊狀卵泡數(shù)量以及血清LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平,表明蝦青素可降低炎性因子表達,抑制炎癥,改善性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀。

      Klotho是一種具有抗衰老、抗凋亡、抗氧化和抗炎等功效的跨膜蛋白,在PCOS患者中Klotho表達降低,且Klotho 的缺失可引發(fā)下丘腦-垂體-卵巢軸功能障礙,導致性激素分泌異常、卵巢早衰和多囊樣病變等,在包括PCOS在內(nèi)的女性生殖疾病發(fā)生和進展中起到關鍵作用[6,18]。研究顯示Klotho 可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin 及MEK/ERK 信號介導炎癥的發(fā)生,上調(diào)Klotho 可阻止Wnt/β-Catenin 激活,從而降低炎性因子表達,改善慢性腎臟疾病大鼠癥狀[7],還可激活MEK 信號,進而抑制炎癥和延緩衰老過程[5,19]。另外Wnt/β-Catenin 和ERK 信號在PCOS 患者體內(nèi)表達失調(diào),Wnt/β-Catenin 上調(diào)和ERK 失活與PCOS發(fā)病機制有關,抑制Wnt/β-Catenin信號可用于治療PCOS[9-10]。倪曉鋒等[20]研究顯示,蝦青素可通過激活ERK信號來減輕H2O2誘導的PC-3細胞氧化應激損傷。王群[12]研究顯示,蝦青素可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號發(fā)揮肝臟疾病治療作用,由此可預測蝦青素改善PCOS 大鼠癥狀的藥理機制可能是通過上調(diào)Klotho 而引發(fā)Wnt/β-Catenin 下調(diào)及MEK/ERK 信號激活。本研究結果顯示,PCOS模型大鼠卵巢組織Klotho、p-MEK 和p-ERK1/2 蛋白表達降低,Wnt1 與β-Catenin 蛋白表達明升高,而蝦青素可消除PCOS大鼠上述蛋白變化趨勢,表明Klotho 和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK 信號參與介導蝦青素對PCOS 大鼠癥狀的改善過程。以蝦青素處理PCOS 大鼠的同時敲低Klotho,可減弱蝦青素的抗炎活性,消除其對PCOS大鼠性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀的改善作用,逆轉其對PCOS 大鼠的治療功效;另外Wnt/β-Catenin 激活劑氯化鋰、MEK/ERK 信號抑制劑PD98059與敲低Klotho的作用相似;氯化鋰、PD98059 不會影響大鼠卵巢組織Klotho 蛋白表達,但氯化鋰可抑制MEK/ERK 信號通路激活,PD98059可促使Wnt/β-Catenin信號通路激活升高,說明Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 是Klotho 下游信號,而Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 之間存在串擾,可相互作用調(diào)控彼此表達,提示蝦青素改善PCOS大鼠癥狀的作用機制是通過上調(diào)Klotho 導致Wnt/β-Catenin 失活及MEK/ERK信號激活。

      綜上所述,蝦青素可通過上調(diào)Klotho 而使Wnt/β-Catenin 信號失活及MEK/ERK 信號激活,從而減少炎性因子表達釋放,阻止炎癥發(fā)生發(fā)展,最終減輕PCOS大鼠性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀,對PCOS大鼠起到治療作用。但Klotho的具體調(diào)節(jié)機制還未研究清楚,還需深入探討。

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