蝦青素通過調(diào)節(jié)Klotho表達和Wnt/β-Catenin信號通路對多囊卵巢綜合征大鼠的改善作用

宋玉，朱爭艷，黃桓，李春，魯晶泉，劉和宇，胡麗娜

多囊卵巢綜合征（PCOS）作為高發(fā)于育齡期女性的一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，嚴重危害女性身體健康［1-2］。研究表明，炎癥是其發(fā)病的危險因素之一，抗炎和抗氧化治療可有效改善PCOS大鼠卵巢多囊樣改變、肥胖和激素紊亂等癥狀［3-4］。Klotho 是體內(nèi)的一種單向跨膜蛋白，可增強胰島素敏感性，起到抗凋亡、抗氧化應激、抗衰老和抗炎等作用，Klotho缺失會誘導炎癥反應和細胞凋亡，干擾細胞新陳代謝，導致小鼠早衰［5］，且Klotho 在PCOS 患者血清中水平降低，與PCOS 的發(fā)生關系密切［6］。研究顯示，Wnt/β-Catenin 及MEK/ERK 是Klotho 的下游信號通路，參與介導Klotho 對炎癥的調(diào)控過程［5，7］。另外，Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 信號通路之間存在串擾，兩者相互作用并參與調(diào)控細胞凋亡和胚胎發(fā)育過程，激活Wnt/β-Catenin 信號通路和抑制MEK/ERK 信號通路可導致囊胚細胞凋亡率升高［8］，且Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 參與介導PCOS 發(fā)病過程，下調(diào)Wnt/β-Catenin可改善PCOS癥狀［9］，而ERK信號傳導受限可引發(fā)PCOS 患者排卵功能和代謝障礙［10］，由此推測通過Klotho下調(diào)Wnt/β-Catenin及激活MEK/ERK 信號可能是PCOS 的潛在治療策略。蝦青素是一種天然酮基類胡蘿卜素，具有抗氧化、提高免疫力、抗炎等生物學功效，可有效清除活性氧及自由基，抑制炎性信號激活，改善動物精子活力及生殖激素分泌，從而提高其生殖性能［11］，還可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin等信號來防治肝臟缺血再灌注損傷、非酒精性脂肪肝等肝臟疾?。?2］。本研究通過構建PCOS 大鼠模型，探究蝦青素能否通過Klotho 調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin和MEK/ERK信號改善PCOS癥狀。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雌性SPF 級SD 大鼠95 只，6～7 周齡，體質(zhì)量190～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。在本院動物房中分籠適應飼養(yǎng)，每籠大鼠不超過4 只，溫度23～25 ℃，濕度50%～60%，通風換氣10～12次/h，并且室內(nèi)維持屏障環(huán)境。

1.1.2 試劑與儀器 來曲唑（純度98%）、蝦青素（純度≥98%）、羧甲基纖維素鈉（黏度：800～1 200 mPa·s）、氯化鋰（純度≥98.0%）以及大鼠白細胞介素（IL）-18、IL-17、腫瘤壞死因子（TNF）-α、前列腺素E2（PGE2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PD98059（純度98.22%）購自美國MCE 公司；Klotho siRNA 質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；大鼠黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）ELISA 試劑盒及HE 染色試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔抗大鼠GAPDH抗體、BCA 蛋白檢測試劑盒、重組兔抗大鼠β-Catenin 抗體、兔抗大鼠p-MEK 抗體、兔抗大鼠ERK 抗體、兔抗大鼠Wnt1抗體、兔抗大鼠MEK 抗體、兔抗大鼠Klotho 抗體、兔抗大鼠p-ERK 抗體、HRP 偶聯(lián)羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

酶聯(lián)免疫檢測儀（型號JD-SY96A，山東競道光電科技有限公司）；加熱石蠟包埋機（型號G1150H）、病理輪轉切片機（型號RM2035）、生物光學顯微鏡（型號DM3000）、全自動脫水機（型號ASP200S）購自德國Leica公司；電泳儀基礎電源與小型蛋白電泳轉膜系統(tǒng)（型號PROTEAN）、凝膠成像系統(tǒng)（型號GelDocEZ）購自美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機（型號Fresco 21）購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 構建PCOS模型大鼠并分組處理后檢測其體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量 參照文獻［13］，取32 只SD 大鼠，1 mg/kg 來曲唑溶液（溶于1%羧甲基纖維素鈉）灌胃，1 次/d，連續(xù)灌胃21 d。于造模第17 天開始每天上午7：00—8：00 收集陰道分泌物，制成陰道涂片后進行瑞氏染色，鏡下觀察各細胞形態(tài)及其比例，連續(xù)觀察5 d，若陰道涂片無動情周期性改變并基本維持在動情間期，且尾靜脈采血檢測血清T水平顯示較正常大鼠明顯升高，提示造模成功。將造模成功的30只大鼠以隨機數(shù)字表法分為模型組，蝦青素低、中、高劑量組，蝦青素高劑量+空載組，蝦青素高劑量+Klotho敲低組，每組5只，另取5只SD大鼠灌胃等劑量1%羧甲基纖維素鈉溶液作為對照組。

將蝦青素和質(zhì)粒溶于生理鹽水制成溶液，蝦青素低、中、高劑量組分別以50、100、200 mg/kg 蝦青素灌胃（1 次/d）［14］，同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho 敲低組相等劑量的生理鹽水（2 次/周）；蝦青素高劑量+空載組、蝦青素高劑量+Klotho敲低組分別尾靜脈注射空載質(zhì)粒和Klotho siRNA質(zhì)粒溶液（2次/周），同時均以200 mg/kg蝦青素灌胃（1次/d）；模型組、對照組以10 mL/kg生理鹽水灌胃（1次/d），同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho敲低組相等劑量的生理鹽水（2次/周），各組大鼠均處理3周后稱體質(zhì)量，然后以乙醚麻醉后斷頭處死，解剖取出卵巢稱質(zhì)量。

1.2.2 再次構建PCOS 模型大鼠后分組處理 取49 只SD 大鼠，再次以同樣的方法成功構建PCOS 模型大鼠45 只，將其以隨機數(shù)字表法分為模型組、蝦青素組（200 mg/kg）、蝦青素（200 mg/kg）+Klotho 敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059組，每組9只，另取9只SD大鼠灌胃等劑量1%羧甲基纖維素鈉溶液作為對照組。對照組、模型組、蝦青素組和蝦青素+Klotho敲低組處理方法同1.2.1；蝦青素+氯化鋰組以200 mg/kg蝦青素灌胃，同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho敲低組相等劑量的生理鹽水（2 次/周）并腹腔注射15 mg/kg氯化鋰（1 次/d）［15］；蝦青素+PD98059 組大鼠以200 mg/kg 蝦青素灌胃（1 次/d），同時尾靜脈注射與蝦青素高劑量+Klotho敲低組相等劑量的生理鹽水（2 次/周）并腹腔注射10 mg/kg的PD98059（1次/d）［16］；各組大鼠均處理3周。

1.2.3 體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積測定及標本采集 將1.2.2中各組大鼠于3周處理結束后24 h，稱其體質(zhì)量，接著以乙醚麻醉后采集尾靜脈血，離心（2 000 r/min、4 ℃、15 min）后獲得血清于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；將大鼠斷頭處死，解剖取出卵巢并稱質(zhì)量，測長徑（L）和短徑（H），計算卵巢體積，體積=（π/6）×L×H2。然后剪取0.8 g卵巢組織于液氮中保存?zhèn)溆?，剩余卵巢組織常規(guī)固定并脫水，石蠟包埋后切片備用。

1.2.4 卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量檢測 將1.2.3 中的卵巢組織切片浸入二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化，按試劑盒說明書進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)，隨機讀取5個視野拍照，使用Image J 軟件分析圖像，定量每組大鼠每個視野卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量，取平均值。

1.2.5 血清FSH、LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平測定 將1.2.3 中血清提前取出后放入冰水浴中緩慢解凍，取0.4 mL 采用ELISA 試劑盒測定FSH、LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平，操作步驟嚴格依照各自說明書進行。

1.2.6 卵巢組織Klotho 蛋白和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK 信號相關蛋白檢測 將1.2.3中凍存在液氮中的卵巢組織塊取出，剪碎，研磨，勻漿，離心（3 000 r/min、4 ℃、20 min）后獲得卵巢組織蛋白樣品液。測量其蛋白總濃度后煮沸使蛋白變性，每組取30 μg 總蛋白通過電泳分離，再通過電泳轉移到PVDF 膜上，將Klotho、GAPDH、Wnt1、β-Catenin、p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2 蛋白條帶裁下后封閉其非特異抗原，以各自兔抗大鼠一抗和山羊抗兔二抗孵育進行抗原抗體反應，化學發(fā)光法顯色后以凝膠成像系統(tǒng)采集各組蛋白條帶圖像，采用Image J軟件分析相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蝦青素對大鼠體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量的影響 與對照組比較，模型組的體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，蝦青素低、中、高劑量組的體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量均降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05）；與蝦青素高劑量組比較，蝦青素高劑量+Klotho 敲低組的體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量升高（P＜0.05），蝦青素高劑量+空載組體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量無明顯變化（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of body mass and ovary mass of rats between the seven groups表1 各組大鼠體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量比較（n=5，）

Tab.1 Comparison of body mass and ovary mass of rats between the seven groups表1 各組大鼠體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與蝦青素低劑量組比較，d與蝦青素中劑量組比較，e與蝦青素高劑量組比較，P＜0.05。

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2.2 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積比較 與對照組比較，模型組體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，蝦青素組體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積降低（P＜0.05）；與蝦青素組比較，蝦青素+Klotho 敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059組體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of body mass,ovarian mass and volume of rats between the six groups表2 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積比較（n=9，）

Tab.2 Comparison of body mass,ovarian mass and volume of rats between the six groups表2 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積比較（n=9，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與蝦青素組比較，P＜0.05；表3—5同。

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2.3 各組大鼠血清激素水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量比較 與對照組比較，模型組血清FSH 水平明顯降低，LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，蝦青素組血清FSH 水平升高，LH、T 水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量降低（P＜0.05）；與蝦青素組比較，蝦青素+Klotho 敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059組血清FSH水平均降低，LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量均升高（P＜0.05），見圖1、表3。

Fig.1 Histomorphology of ovaries of rats in each group observed by HE staining(×200)圖1 HE染色觀察各組大鼠卵巢組織形態(tài)（×200）

Tab.3 Comparison of serum FSH,LH,T levels and number of follicles in ovarian tissue between the six groups表3 各組大鼠血清FSH、LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量比較（n=9，）

Tab.3 Comparison of serum FSH,LH,T levels and number of follicles in ovarian tissue between the six groups表3 各組大鼠血清FSH、LH、T水平與卵巢組織囊狀卵泡數(shù)量比較（n=9，）

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2.4 各組大鼠血清炎性因子水平比較 與對照組比較，模型組血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蝦青素組血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平降低（P＜0.05）；與蝦青素組比較，蝦青素+Klotho敲低組、蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059 組血清PGE2、IL-17、TNFα、IL-18水平均升高（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of serum PGE2,IL-17,TNF-α and IL-18 levels of rats between the six groups表4 各組大鼠血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平比較（n=9，ng/L，）

Tab.4 Comparison of serum PGE2,IL-17,TNF-α and IL-18 levels of rats between the six groups表4 各組大鼠血清PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平比較（n=9，ng/L，）

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2.5 各組大鼠卵巢組織Klotho 和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組卵巢組織Klotho、p-MEK、p-ERK1/2 蛋白表達降低，Wnt1、β-Catenin 蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組比較，蝦青素組卵巢組織Klotho、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達升高，Wnt1、β-Catenin蛋白表達降低（P＜0.05）。與蝦青素組比較，蝦青素+Klotho敲低組卵巢組織Klotho、p-MEK和p-ERK1/2蛋白表達降低，Wnt1、β-Catenin 蛋白表達升高（P＜0.05）；蝦青素+氯化鋰組、蝦青素+PD98059 組卵巢組織Klotho 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，p-MEK、p-ERK1/2 表達降低，Wnt1、β-Catenin 蛋白表達升高（均P＜0.05），見圖2、表5。

Fig.2 Expression of Klotho protein and Wnt/β-Catenin,MEK/ERK signal related protein in ovarian tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖2 免疫印跡檢測各組大鼠卵巢組織Klotho蛋白表達和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白表達

Tab.5 Comparison of the relative expression level of Klotho,Wnt/β-Catenin,MEK/ERK signal related proteins in ovaries of rats between the six groups表5 各組大鼠卵巢組織Klotho蛋白和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白相對表達水平比較（n=9，）

Tab.5 Comparison of the relative expression level of Klotho,Wnt/β-Catenin,MEK/ERK signal related proteins in ovaries of rats between the six groups表5 各組大鼠卵巢組織Klotho蛋白和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK信號相關蛋白相對表達水平比較（n=9，）

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3 討論

PCOS臨床治療以激素類藥物為主，但長期應用存在較多不良反應且停藥后易復發(fā)。本研究通過對SD 大鼠灌胃來曲唑的方法構建PCOS 模型，大鼠血清FSH 水平降低，體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積、囊狀卵泡數(shù)量以及血清LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18水平升高，說明來曲唑可促使炎性因子表達，引發(fā)炎癥反應，誘導大鼠出現(xiàn)雄性激素升高等性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀，損傷卵巢形態(tài)功能，提示PCOS模型構建成功。蝦青素是提取自海洋生物的一種天然次生類胡蘿卜素，抗氧化、抗炎作用明顯，具有藥用價值，可明顯降低活性氧及自由基水平，阻斷炎性信號活化傳導，減輕動物機體氧化應激及炎性損害，并可改善動物生殖激素平衡及其生殖能力［11］，還可通過抑制活性氧產(chǎn)生及炎癥反應而減輕碘海醇誘導的腎細胞凋亡和急性腎損傷［17］。本研究結果顯示，以不同劑量蝦青素處理PCOS 大鼠，可呈劑量依賴性降低其體質(zhì)量與卵巢質(zhì)量；另外以200 mg/kg 蝦青素處理PCOS 大鼠，可升高其血清FSH 水平，降低體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量與體積、囊狀卵泡數(shù)量以及血清LH、T、PGE2、IL-17、TNF-α、IL-18 水平，表明蝦青素可降低炎性因子表達，抑制炎癥，改善性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀。

Klotho是一種具有抗衰老、抗凋亡、抗氧化和抗炎等功效的跨膜蛋白，在PCOS患者中Klotho表達降低，且Klotho 的缺失可引發(fā)下丘腦-垂體-卵巢軸功能障礙，導致性激素分泌異常、卵巢早衰和多囊樣病變等，在包括PCOS在內(nèi)的女性生殖疾病發(fā)生和進展中起到關鍵作用［6，18］。研究顯示Klotho 可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin 及MEK/ERK 信號介導炎癥的發(fā)生，上調(diào)Klotho 可阻止Wnt/β-Catenin 激活，從而降低炎性因子表達，改善慢性腎臟疾病大鼠癥狀［7］，還可激活MEK 信號，進而抑制炎癥和延緩衰老過程［5，19］。另外Wnt/β-Catenin 和ERK 信號在PCOS 患者體內(nèi)表達失調(diào)，Wnt/β-Catenin 上調(diào)和ERK 失活與PCOS發(fā)病機制有關，抑制Wnt/β-Catenin信號可用于治療PCOS［9-10］。倪曉鋒等［20］研究顯示，蝦青素可通過激活ERK信號來減輕H2O2誘導的PC-3細胞氧化應激損傷。王群［12］研究顯示，蝦青素可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號發(fā)揮肝臟疾病治療作用，由此可預測蝦青素改善PCOS 大鼠癥狀的藥理機制可能是通過上調(diào)Klotho 而引發(fā)Wnt/β-Catenin 下調(diào)及MEK/ERK 信號激活。本研究結果顯示，PCOS模型大鼠卵巢組織Klotho、p-MEK 和p-ERK1/2 蛋白表達降低，Wnt1 與β-Catenin 蛋白表達明升高，而蝦青素可消除PCOS大鼠上述蛋白變化趨勢，表明Klotho 和Wnt/β-Catenin、MEK/ERK 信號參與介導蝦青素對PCOS 大鼠癥狀的改善過程。以蝦青素處理PCOS 大鼠的同時敲低Klotho，可減弱蝦青素的抗炎活性，消除其對PCOS大鼠性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀的改善作用，逆轉其對PCOS 大鼠的治療功效；另外Wnt/β-Catenin 激活劑氯化鋰、MEK/ERK 信號抑制劑PD98059與敲低Klotho的作用相似；氯化鋰、PD98059 不會影響大鼠卵巢組織Klotho 蛋白表達，但氯化鋰可抑制MEK/ERK 信號通路激活，PD98059可促使Wnt/β-Catenin信號通路激活升高，說明Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 是Klotho 下游信號，而Wnt/β-Catenin 和MEK/ERK 之間存在串擾，可相互作用調(diào)控彼此表達，提示蝦青素改善PCOS大鼠癥狀的作用機制是通過上調(diào)Klotho 導致Wnt/β-Catenin 失活及MEK/ERK信號激活。

綜上所述，蝦青素可通過上調(diào)Klotho 而使Wnt/β-Catenin 信號失活及MEK/ERK 信號激活，從而減少炎性因子表達釋放，阻止炎癥發(fā)生發(fā)展，最終減輕PCOS大鼠性激素分泌異常、肥胖及卵巢多囊樣病變癥狀，對PCOS大鼠起到治療作用。但Klotho的具體調(diào)節(jié)機制還未研究清楚，還需深入探討。