應(yīng)用生物信息學(xué)探索神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因

張守華,孟肖振,鄒海波,馮 丹,李科浩,李匡凡,占 敏,徐 晗

(1.江西省兒童醫(yī)院普通外科; 2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部,南昌 330006)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)起源于腎上腺髓質(zhì)及交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞,是兒童顱外最常見的惡性實體腫瘤,也是嬰幼兒期最常見的惡性腫瘤[1-2],約占兒童腫瘤的7%～10%。NB的總體患病率大約是1/7000活產(chǎn)兒,男性發(fā)病率稍高,因NB死亡的患兒占兒童癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的15%。NB具有很高的轉(zhuǎn)移潛力,多數(shù)患者在診斷時就已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,因而預(yù)后較差[3-4]。因此,闡明NB轉(zhuǎn)移的機制,鑒定新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點對NB的臨床治療有重要意義。近年來生物信息學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,其在疾病診斷、預(yù)后預(yù)測和藥物篩選等方面發(fā)揮了越來越重要的作用。依靠生物信息學(xué)技術(shù),研究者能夠了解NB細(xì)胞周期相關(guān)基因及其表達(dá)情況。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中參與調(diào)控的基因眾多,并且調(diào)控基因之間相互作用,相互影響。生物信息學(xué)從宏觀上分析大數(shù)據(jù),可在多基因水平研究腫瘤,從而有可能更好地闡釋癌癥的發(fā)病機制。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法,篩選與NB轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異性表達(dá)基因,分析這些基因在NB中的表達(dá)模式和可能發(fā)揮的作用,以期為進(jìn)一步闡明NB轉(zhuǎn)移機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

NB基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE112447(內(nèi)含20個NB轉(zhuǎn)移腫瘤組織樣本、37個NB原發(fā)腫瘤組織樣本)來自NCBI的Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[5]。該數(shù)據(jù)集的基因測序平臺為Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44KG4112F(GPL6480平臺)。

1.2 基因篩選

利用在線分析工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)[6]對數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)差異分析,篩選標(biāo)準(zhǔn):P<0.05,|logFC|>2(FC=變異倍數(shù))。將logFC>2的基因為上調(diào)的差異表達(dá)基因(up-regulated differentially expressed genes,UDEGs),logFC<-2的基因作為下調(diào)的差異表達(dá)基因(down-regulated differentially expressed genes,DDEGs)。

1.3 GO和KEGG富集分析

利用具備注釋和可視化功能的DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)[7]進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析[8-9],GO富集分析內(nèi)容主要有生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cell composition,CC)和分子功能(molecular function,MF)。以FDR<0.05為集合有意義。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的建立及篩選關(guān)鍵基因

將篩選出的差異表達(dá)基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中分析蛋白間相互作用(protein-protein interaction,PPI)[10],將“minimum required interaction score”設(shè)定為“high confidence(0.7)”進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。之后,利用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化整合[11]。分別使用Cytoscape的插件“CytoHubba”中的MCC,DMNC和Stress算法篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前15的關(guān)鍵基因[12],3種算法得到的前15個基因取交集后得到的共同基因被認(rèn)為是關(guān)鍵基因。

1.5 生存分析

使用UCSC Xena(https://xena.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)庫[13-14]對篩選出的候選關(guān)鍵基因進(jìn)行總體生存分析[15],以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 單基因差異分析

以關(guān)鍵基因的相對表達(dá)中位值為界,將數(shù)據(jù)集中的病例樣本分為高、低表達(dá)組,篩選2組之間的差異表達(dá)基因,認(rèn)定為CCNB1的衍生基因。同時使用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,分析關(guān)鍵基因及其衍生基因可能參與信號通路。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

利用GEO2R共篩選出NB轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤組織間435個差異表達(dá)基因,其中表達(dá)上調(diào)基因296個,表達(dá)下調(diào)基因139個,差異表達(dá)基因的火山圖見圖1,進(jìn)一步篩選出表達(dá)水平變化幅度排名前50的差異表達(dá)基因,差異表達(dá)基因的聚類熱圖見圖2。

log3(FoldChange)圖1 差異表達(dá)基因火山圖

圖2 差異基因熱圖

2.2 差異基因的功能富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫GO分析結(jié)果顯示:與差異基因相關(guān)的生物學(xué)過程主要富集在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附和補體激活中;差異基因主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外泌體,與蛋白結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性和受體結(jié)合功能有關(guān)(表1)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,與差異基因有關(guān)的主要細(xì)胞通路為補體激活通路、PI3K-Akt信號通路和惡性腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路(表2)。GO及KEGG通路富集分析的可視化結(jié)果見圖3。

表1 差異表達(dá)基因GO分析

表2 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

圖3 差異基因GO和KEGG富集分析可視化

2.3 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因篩選

差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖4。

圖4 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

利用STING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò),過濾可信系數(shù)<0.7的關(guān)系對和孤立蛋白,最終獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)包括281個節(jié)點及846條邊。使用MCC算法,得到PPI網(wǎng)絡(luò)中前15位差異基因為CCNB1、CCNB2、CDC45、CDCA8、BIRC5、CENPF、PTTG1、NCAPG、OIP5、MAD2L1、KIF23、KIAA0101、TYMS、CDC6、FAM64A(圖5A);使用DMNC算法,得到的前15位差異基因為MAD2L1、OIP5、KIF23、TYMS、NCAPG、BIRC5、CENPF、PTTG1、KIAA0101、FAM64A、TROAP、TK1、CDC6、CCNB1、CCNB2(圖5B);使用Stress算法,得到的前15位差異基因為CD34、BCL2、CCNB1、ITGAM、TNF、FCGR3A、MPO、TLR2、TYROBP、MMP9、HIST1H2BJ、HIST1H2BO、PTPRC、HIST1H2BL、HIST1H2BB(圖5C)。對上述3種算法得到的基因集合取交集,得到唯一關(guān)鍵基因CCNB1(圖5D)。

A:MCC算法得到的關(guān)鍵基因;B:DMNC算法得到的關(guān)鍵基因;C:Stress算法得到的關(guān)鍵基因;D:3種算法獲得的關(guān)鍵基因韋恩圖。

2.4 關(guān)鍵基因CCNB1的預(yù)后分析

利用UCSC Xena數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵基因CCNB1對NB的預(yù)后價值,繪制生存分析曲線(圖6A)。結(jié)果顯示CCNB1的表達(dá)水平與NB患者總體生存率顯著相關(guān)(P=0.000 534 6),即CCNB1低表達(dá)的患者與生存率更高;CCNB1在腫瘤未分化或分化程度低的NB患者中的表達(dá)水平高于在腫瘤分化NB患者中的表達(dá)水平(圖6B,P=0.030 08);CCNB1在MYCN拷貝數(shù)擴(kuò)增的NB患者中的表達(dá)水平顯著高于MYCN拷貝數(shù)未擴(kuò)增的NB患者(圖6C,P=0.000 246 5)。以上結(jié)果都說明CCNB1和NB患者的預(yù)后密切相關(guān)。

A:CCNB1基因表達(dá)水平高、低的NB患者生存曲線;B:不同分化程度的NB腫瘤間CCNB1基因表達(dá)水平比較;C:MYCN擴(kuò)增程度不同的NB腫瘤間CCNB1表達(dá)水平比較。

2.5 CCNB1相關(guān)基因的鑒定與其生物學(xué)意義

以關(guān)鍵基因CCNB1數(shù)據(jù)集中的中位相對表達(dá)值(10.60,n=57)為界值,將患者分為CCNB1高表達(dá)組(29例)和低表達(dá)組(28例),對2組進(jìn)行基因差異表達(dá)分析,篩選標(biāo)準(zhǔn):P<0.05,|logFC|>2。隨后對將篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果表明CCNB1及其衍生基因與細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、p53信號通路等有顯著的相互作用。見表3。

表3 CCNB1高、低表達(dá)組差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

3 討論

NB是兒童顱外最常見的惡性實體腫瘤,起源于腎上腺髓質(zhì)及交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞,具有很強的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移潛力。NB患者經(jīng)常在確診時即發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,NB晚期和轉(zhuǎn)移患者的生存率較低。因此,尋找與NB遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)的關(guān)鍵基因?qū)B的診斷和預(yù)后評估有重要意義。

GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE112447數(shù)據(jù)集中收錄了20個NB轉(zhuǎn)移腫瘤組織樣本、37個NB原發(fā)腫瘤組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。通過生物信息學(xué)手段,本研究篩選出在NB轉(zhuǎn)移腫瘤組織和原發(fā)腫瘤組織間差異性表達(dá)的基因共435個,其中表達(dá)上調(diào)的基因296個,表達(dá)下調(diào)基因139個。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果顯示差異基因主要參與了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附和補體激活等生物過程,主要分布于胞外基質(zhì)、吞噬溶酶體和細(xì)胞外泌體[16-17]等細(xì)胞成分,并與蛋白結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性和受體結(jié)合等與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的分子功能有關(guān)[18-19]。同時,KGEE通路分析表明,差異基因主要富集于補體信號通路、中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(Nets)形成途徑、ECM受體相互作用信號通路[20]、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、惡性腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路和造血細(xì)胞調(diào)控信號通路。上述信號通路與腫瘤的增殖、侵襲和遷移以及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[21-22],可能在NB轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。UBELLACKER等[23]研究顯示,可以通過調(diào)節(jié)骨髓造血干細(xì)胞的功能和分化潛能影響造血微環(huán)境,從而抑制和預(yù)防骨髓轉(zhuǎn)移性疾病,改善患者預(yù)后。結(jié)合KEGG富集分析結(jié)果,差異基因可能通過影響造血細(xì)胞調(diào)控信號通路在NB骨髓轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和Cytoscape軟件算法,從差異表達(dá)基因中篩選出了唯一的關(guān)鍵基因——CCNB1。有研究[24]表明CCNB1在NB組織中高表達(dá),且其表達(dá)水平與NB患者的預(yù)后密切相關(guān),提示CCNB1的表達(dá)量越低的患者的預(yù)后越好。由此可推測CCNB1可能在NB遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用,且與患者預(yù)后密切相關(guān)。

以TARGET數(shù)據(jù)集中151例NB樣本的CCNB1基因的中位表達(dá)值為界值,將患者樣本分為CCNB1高表達(dá)和低表達(dá)組。篩選CCNB1高、低表達(dá)組間差異表達(dá)的基因,并對其進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果表明CCNB1及其衍生基因與細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、p53信號通路等有顯著富集。SONG等[25]的研究表明CCNB1在細(xì)胞周期調(diào)控和p53信號通路中起著重要作用,與NB密切相關(guān)。另外有研究[26]表明CCNB1通過促進(jìn)P3泛素化促進(jìn)HCC中的PI53K和AKT磷酸化并降低P53蛋白表達(dá)。參與細(xì)胞周期控制的基因表達(dá)失調(diào)會使細(xì)胞命運走向異常,有可能造成不受控制的細(xì)胞增殖,進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展[27]。與筆者富集到的CCNB1及其衍生基因的生物學(xué)功能一致,說明CCNB1很可能通過細(xì)胞周期,p53信號通路影響NB的惡性程度,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遠(yuǎn)處浸潤轉(zhuǎn)移。

CCNB1過表達(dá)造成的免疫相關(guān)信號通路失調(diào)可能直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)移。此方向上的進(jìn)一步深入研究可能揭示新的NB致病機制,靶向該通路的治療方案可能成為未來NB治療的新方向。有研究[28-29]表明,其他腫瘤中CCNB1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平高于正常組織。此外,與非侵襲性腫瘤相比,侵襲性腫瘤中的CCNB1表達(dá)水平也更高。CCNB1的敲低導(dǎo)致細(xì)胞活力和增殖能力顯著降低,這與本研究分析結(jié)果一致。

本研究的局限性在于:1)關(guān)鍵基因CCNB1的重要性還需生物學(xué)實驗驗證;2)只對一個數(shù)據(jù)集進(jìn)行了分析,樣本數(shù)量較少;3)NB的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是多因素共同作用的結(jié)果,本研究只從基因表達(dá)水平對其進(jìn)行了單維度分析。

綜上所述,CCNB1基因可能在NB轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,其高表達(dá)與患者生存率低相關(guān),可能是評估NB預(yù)后的可靠生物學(xué)標(biāo)志物。未來可能作為新的靶點,為NB診斷、治療和預(yù)后評估提供新的可能。