正交實驗優(yōu)化甘草多糖膠囊中總多糖含量測定

高嘉雯 朱旭江 姚世霞 牛鈺婷

【摘 要】目的：建立甘草多糖膠囊中甘草多糖含量測定的方法。方法：以苯酚和硫酸的加入量、反應(yīng)時間等為考察因素，采用正交實驗設(shè)計優(yōu)化苯酚-硫酸法測定甘草多糖含量的顯色條件。并采用紫外分光光度法，以葡萄糖為對照品，于波長490 nm處測定甘草多糖吸光度，計算總多糖的含量。結(jié)果：甘草總多糖含量測定的最佳顯色條件為苯酚用量1 mL，硫酸用量5 mL，放置時間30 min。甘草多糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.0048x+0.0252，r=0.9995；精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好；平均加樣回收率為99.5%，RSD＝3.0％（n=9）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于甘草多糖膠囊中總多糖的含量測定。

【關(guān)鍵詞】甘草多糖膠囊；分光光度法；含量測定

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）16-0033-03

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.16.zgmzmjyyzz202316007

Orthogonal Experiment was Used to Optimize the Determination Method of Total

Polysaccharide in Glycyrrhiza Polysaccharide Capsules

GAO Jiawen1 ZHU Xujiang1，2* YAO Shixia2 NIU Yuting2

1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730070，China

Abstract： Objective To establish a method for the determination of total polysaccharides in Glycyrrhiza polysaccharide capsules.Methods Taking the amount of phenol and sulfuric acid，reaction time and so on as the investigation factors，the orthogonal experimental design was adopted to optimize the color development conditions for the determination of Glycyrrhiza polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method.The absorbance of Glycyrrhiza polysaccharide was measured at 490nm by ultraviolet spectrophotometry，and the content of total polysaccharide was calculated.Results The best chromogenic conditions for the determination of total polysaccharide content in Glycyrrhiza uralensis Fisch were as follows： the dosage of phenol was 1 mL，the dosage of sulfuric acid was 5 mL，and the storage time was 30 min.The linear relationship of Glycyrrhiza polysaccharide is good in the concentration range of 0.0621～0.1656 mg·mL-1，and the regression equation is y=0.0048x+0.0252，r=0.9995;Good precision，stability and reproducibility; The average recovery rate is 99.5%，RSD=3.0%（n=9）.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the determination of total polysaccharides in Glycyrrhiza polysaccharide capsules.

Key words：Glycyrrhiza Polysaccharide Capsules; Spectrophotometry; Content Determination

甘草多糖膠囊系經(jīng)水提醇沉法提取甘草中的多糖，加輔料制成的膠囊劑，為甘肅省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，臨床用于提高免疫力［1-2］。該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS），單點外標(biāo)法測定甘草多糖的含量，試驗時發(fā)現(xiàn)操作過程復(fù)雜，試劑配制耗時，且輔料存在干擾，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性較差。常用的多糖測定方法有：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法等［3-5］。其中，苯酚-硫酸法操作簡便，測定快速，較為常用［6-7］。許多研究［8-10］發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法在測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。有研究［11-12］發(fā)現(xiàn)，在同質(zhì)量濃度下，對比葡萄糖對照品溶液吸光度，苯酚-硫酸法的吸光度大于蒽酮-硫酸法和DNS法，表明苯酚硫酸法的測定結(jié)果更靈敏。因此，通過研究，建立了苯酚-硫酸比色法測定甘草多糖膠囊的含量，并通過正交實驗設(shè)計優(yōu)化顯色條件，方法簡便準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Lambda365紫外可見分光光度計（PerkinElmer公司）；MS205DU十萬分之一天平（瑞士梅特勒公司）；ME204電子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；漩渦混合器（IKA VORTEX2）。

1.2 試藥 甘草多糖膠囊（批號分別為：200402、200403、200301，甘肅省中醫(yī)院提供）；D-無水葡萄糖（批號：110833-201707，含量99.9%，中國食品藥品檢定研究院）蒽酮、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取D-無水葡萄糖對照品103.49 mg，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取儲備液5 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取甘草多糖膠囊內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，精密稱取0.1 g，置250 mL量瓶中，加水200 mL，旋渦振蕩器混合5 min，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻，取適量，過濾，精密量取濾液5 mL，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 最大吸收波長的測定 精密吸取0.4 mL“2.1.1”項下對照品溶液，置刻度試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，振蕩搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，立即搖勻，冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑為空白，在400～700 nm掃描光譜。由圖1結(jié)果可知對照品溶液在490 nm處有最大吸收，故選擇490 nm為測定波長。

2.3 正交實驗設(shè)計優(yōu)化顯色條件 通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，苯酚和硫酸的加入量、反應(yīng)時間均對結(jié)果有較大影響，因此，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，以吸收度為考察指標(biāo)優(yōu)選最佳顯色條件，并運用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析。正交試驗因素與水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表2直觀分析可知，各因素對綜合評分影響的順序為B＞A＞C；由表3的方差分析可知，濃硫酸用量對顯色具有顯著意義。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定總多糖含量測定條件的最佳工藝條件為A2B1C3，即苯酚用量為1 mL，硫酸用量為5 mL，放置時間為30 min。經(jīng)對同一批樣品制備3批供試品溶液進(jìn)行驗證，結(jié)果RSD為3.0%（n=3），顯色條件方法可行。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖對照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，分別置具塞刻度試管中，加水至1 mL，搖勻，加入5 %苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻，放置30 min，加水至10 mL，冰浴冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（2020版中國藥典通則0101），在490 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為方程為：y=0.0048x+0.0252，r=0.9995，表明葡萄糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 專屬性考察 按處方比例及制備工藝，制成不含甘草多糖的陰性樣品，按“2.1.2”制成供試品溶液，測定吸收度。結(jié)果吸收度小于0.001，表明輔料不干擾實驗，有較好的專屬性。

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下葡萄糖對照品溶液0.4 mL，按“2.4”項下方法，重復(fù)測定吸光度6次，結(jié)果6次吸光度的RSD=0.06%（n=6），表明精密度較好。

2.7 重復(fù)性試驗 取甘草多糖膠囊（批號：200402）粉末約0.1 g，精密稱定，平行6份，按“2.1.2”制成供試品溶液，按照“2.4”項下方法測定其吸光度A，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液中葡萄糖的含量（mg/g）。結(jié)果平均含量為345.98 mg/g，RSD=1.88 %（n=6）。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品（批號：200402），精密稱取0.1 g，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按照“2.4”項下方法測定其吸光度，每間隔 5 min測定1次，共測定6次。結(jié)果平均吸光光度為0.3864，RSD值為1.93 %（n=6）。表明樣品甘草多糖測定在30 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗 取已知含量的甘草多糖膠囊（批號：200402）9份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入其樣品多糖含量的50 %、100 %、150 %的對照品溶液，每個比例加3份，按“2.1.2”制成供試品溶液。分別精密移取 1 mL，按照測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定其吸光度，測定平均加樣回收率為99.5%，RSD = 3.0%（n=9），表明回收率良好。結(jié)果見表4。

2.10 樣品的含量 測定取3批甘草多糖膠囊各0.1 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下方法測定吸光度，計算其中多糖含量。結(jié)果見表5。

3 討論

苯酚-硫酸法是利用多糖在濃硫酸作用脫水生成糠醛衍生物，糠醛與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定［13］。本試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，建立正交試驗設(shè)計，考察了苯酚、濃硫酸用量和反應(yīng)時間3個因素對甘草多糖含量測定的影響。最終確顯色條件為即加入苯酚1 mL，硫酸5 mL，放置時間為30 min。該方法操作簡便，試劑易得，能快速準(zhǔn)確測定甘草多糖的含量。

此外，分別選用超聲法、回流法、水浴保溫法以及直接溶解法等4種方式作為樣品中多糖的提取方法制備供試品溶液，在490 nm處測定吸光度值，結(jié)果顯示，超聲法測定結(jié)果較高，且操作簡便，故選用其作為樣品的制備方法。

通過方法學(xué)考察，驗證了本方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均較好。采用苯酚-硫酸法測定甘草多糖膠囊中多糖的含量，方法可行，操作簡單，可用于甘草多糖膠囊的質(zhì)量控制，對指導(dǎo)臨床用藥及制訂制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有一定參考價值。

參考文獻(xiàn)

［1］張銘儒，黃嘉歡，羅露香，等.甘草多糖結(jié)構(gòu)特征、生物活性、化學(xué)修飾、產(chǎn)品開發(fā)的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2022，44（2）：519-524.

［2］朱韻辰，林星.甘草多糖藥理學(xué)作用研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2021，38（21）：2763-2768.

［3］王彥平，婁芳慧，陳月英，等.苯酚-硫酸法測定紫山藥多糖含量的條件優(yōu)化［J］.食品研究與開發(fā)，2021，42（4）：170-174.

［4］申希峰，黃杰濤，張蓮姬.蒽酮-硫酸法測定榛花多糖含量條件的優(yōu)化［J］.食品研究與開發(fā)，2017，38（18）：150-154.

［5］孫躍寧，李懷平，羅明英，等.DNS法測定手參腎寶膠囊中多糖含量［J］.食品與藥品，2020，22（1）：33-35.

［6］陳鳳，趙萬嶺，王星儀，等.苯酚-硫酸法測定明日葉根中多糖含量［J］.化工管理，2019（26）：11-13.

［7］張松柏，陳磊，許文，等.優(yōu)化苯酚硫酸法測定金線蓮中多糖含量［J］.福建中醫(yī)藥，2019，50（4）：58-60.

［8］楊勤，谷文超，周濃，等.苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定地參多糖的比較研究［J］.食品科技，2020，45（1）：343-350.

［9］溫文娟，劉珊，黃遠(yuǎn)麗.苯酚硫酸法與蒽酮硫酸法測定香菇多糖含量比較［J］.現(xiàn)代食品，2020（21）：177-179.

［10］張妍，劉太林.苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定麥冬中麥冬多糖含量的比較研究［J］.現(xiàn)代食品，2018（18）：95-102.

［11］文喜艷，邵晶，王蘭霞，等.正交設(shè)計結(jié)合3種比色法優(yōu)選黃芪多糖提取工藝［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（4）：1562-1566.

［12］王法琴，陸兔林，毛春芹，等.3種比色法測定五味子中多糖［J］.中成藥，2015，37（4）：814-818.

［13］關(guān)開，袁媛，于艷.正交試驗結(jié)合苯酚-硫酸法優(yōu)選茅蒼術(shù)中多糖的提取工藝［J］.西部中醫(yī)藥，2017，30（7）：38-41.