甲狀腺激素T3抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護大鼠II型肺泡上皮細胞和減輕大鼠低氧性肺損傷*

王雅軒， 林雪， 戴重陽， 蒲小燕

甲狀腺激素T3抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護大鼠II型肺泡上皮細胞和減輕大鼠低氧性肺損傷*

王雅軒， 林雪， 戴重陽， 蒲小燕△

（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016）

探討甲狀腺激素能否減輕高原低氧環(huán)境中大鼠II型肺泡上皮細胞與肺組織損傷，并探尋其作用機制。將20只SPF級別、8周周齡的雄性SD大鼠分為正常對照組與高原模型組，每組10只。高原模型大鼠置于模擬海拔6 000 m低氧環(huán)境的模擬艙內(nèi)構(gòu)建高原低氧模型，正常對照組大鼠生活海拔與當?shù)匾恢?。造模結(jié)束后在正常海拔下收集兩組動物血清與肺組織。電鏡和TUNEL染色法觀察大鼠肺組織細胞凋亡情況，使用RT-qPCR與Western blot檢測大鼠肺組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、肌醇需求酶1α（IRE1α）、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）mRNA與蛋白表達。甲狀腺濾泡上皮細胞分為常氧組與低氧組。常氧組正常條件培養(yǎng)，低氧組缺氧培養(yǎng)24 h，用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖率，用ELISA法檢測細胞乳酸脫氫酶（LDH）、甲狀腺激素T3和T4含量。大鼠II型肺泡上皮細胞分為常氧組、常氧+甲狀腺激素（T3）組、低氧組和低氧+T3組，按組別加入T3后進行缺氧處理，CCK-8法檢測細胞增殖率，細胞染色觀察活死細胞比例，ELISA檢測細胞LDH含量，TUNEL染色觀察細胞凋亡，RT-qPCR與Western blot法檢測II型肺泡上皮細胞中GRP78、IRE1α、PERK和ATF6的mRNA與蛋白表達，免疫熒光法對細胞GRP78、ATF6和Bax進行共定位檢測。高原組大鼠肺組織凋亡細胞增加，GRP78、IRE1α、PERK和ATF6的mRNA與蛋白表達水平顯著升高（<0.01）；甲狀腺細胞缺氧培養(yǎng)后細胞增殖率與T3、T4含量降低，LDH含量顯著升高（<0.01）；與低氧組相比，低氧+T3組II型肺泡上皮細胞增殖率顯著升高，凋亡率與LDH含量顯著降低，GRP78、IRE1α、PERK和ATF6的mRNA與蛋白表達水平顯著降低（<0.01）。外源性甲狀腺激素可以減輕大鼠II型肺泡上皮細胞低氧性損傷，其機制可能與抑制肺泡上皮細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因表達有關(guān)。

低氧性肺損傷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；甲狀腺激素；II型肺泡上皮細胞

高原低氧環(huán)境會對機體產(chǎn)生廣泛的影響，如氧化應(yīng)激損傷、臟器功能障礙等。近年來，急性、間歇性或永久暴露在高海拔地區(qū)人群已大幅增加，隨著海拔的升高，氧分壓下降，生物體內(nèi)氧的生物利用度降低，肺血管結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑、收縮［1-2］，肺動脈壓力與肺泡毛細血管通透性升高，進一步誘發(fā)缺氧性肺血管收縮（hypoxic pulmonary vasoconstriction， HPV）和低氧血癥，造成肺損傷并誘發(fā)一系列高原肺部相關(guān)疾?。?-4］，嚴重影響人們的日常生活。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激源于未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response， UPR）的級聯(lián)反應(yīng)，因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白的積累而被激活［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘發(fā)呼吸道疾病如肺癌、肺纖維化、肺部感染、哮喘等［6-7］。有學(xué)者通過動物實驗證實氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激大鼠肺組織損傷［8］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid， 4-PBA）在脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導(dǎo)的肺部炎癥中緩解展開蛋白聚集和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)［9］。這些結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和環(huán)境中氧氣含量可能是造成肺內(nèi)皮細胞損傷的關(guān)鍵，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有可能緩解因缺氧導(dǎo)致的肺損傷。

下丘腦-垂體-甲狀腺（hypothalamic-pituitary-thyroid， HPT）軸是人體主要的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，也是分泌包括T3和T4甲狀腺激素的重要系統(tǒng)。有研究證明在高海拔（>5 000 m）地區(qū)環(huán)境中大鼠甲狀腺激素釋放激素分泌受到抑制，導(dǎo)致T3和T4甲狀腺激素含量降低［10］；還有研究證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑影響大鼠甲狀腺球蛋白分子的表達［11］，這些研究提示在高海拔低氧環(huán)境下，甲狀腺激素分泌水平是引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵。因此，本研究主要探討在高原低氧環(huán)境下，大鼠甲狀腺激素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，以及外源性甲狀腺激素能否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解大鼠低氧性肺損傷，保護肺泡上皮細胞，為研發(fā)相關(guān)藥物提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1　實驗動物與細胞

健康SPF級別SD雄性大鼠20只，周齡為8周，體質(zhì)量200～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2021-0011。大鼠飼養(yǎng)于青海大學(xué)實驗動物房，飼養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃，濕度50%～60%，自由飲食、飲水，定期更換墊料、清理消毒鼠籠。本研究經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準，所有實驗操作均嚴格按照還原、細化、替代的3R原則進行。

本實驗所用細胞為大鼠II型肺泡上皮細胞（CP-R003）與大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞（CP-R022），均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2　主要試劑與儀器

2.1實驗試劑T3甲狀腺激素購自中國食品藥品檢定研究院；CCK-8試劑盒購自北京蘭杰柯科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）、T3、T4 ELISA檢測試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V（annexin V）-APC/碘化丙啶（propidium iodide， PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6， ATF6）抗體和β-actin抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78， GRP78）抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α， IRE1α）抗體和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase， PERK）抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；總RNA分離提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司；PrimeScript RT reagent Kit和TB GreenTMPremix Ex TaqTMII （Tli RNaseH Plus）為TaKaRa產(chǎn)品。

2.2實驗儀器徠卡-2016轉(zhuǎn)輪式切片機、DMI1光學(xué)顯微鏡（Leica）；SpectraMAX Plus384酶標儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；PIKO Red 96實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)儀（Thermo Fisher）；IX73熒光顯微鏡（Olympus）；全功能成像儀、蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-Rad）；Image-Pro 6.0軟件分析系統(tǒng)（MEDIA CYBERNETICS）；Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀（3DHISTECH）。

3　主要方法

3.1動物分組與造模將大鼠分為正常對照組與高原模型組，每組10只。高原模型大鼠置于模擬海拔6 000 m低氧環(huán)境的模擬艙內(nèi)（大鼠進艙后以10 m/s速度減壓上升，濕度維持在49%～55%之間，室內(nèi)溫度由中央空調(diào)統(tǒng)一控制，白天保持22～24 ℃，夜晚保持16～18 ℃）飼養(yǎng)72 h；正常對照組模擬艙內(nèi)與當?shù)睾０我恢拢?0］。飼養(yǎng)結(jié)束后，將模擬艙內(nèi)的海拔降至與當?shù)睾０我恢拢⒃趯嶒炁撨M行大鼠樣本取材，收集肺組織供后續(xù)檢測。

3.2細胞培養(yǎng)將完全復(fù)蘇的大鼠II型肺泡上皮細胞與大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞置于配置好的完全培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，條件為37 ℃、5% CO2，待細胞生長占至培養(yǎng)瓶底部約85%時進行消化傳代，吸棄舊培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，吸棄液體，加入孵溫的胰酶消化細胞。將消化后的細胞以710×離心5 min，吸棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液，以1∶3傳代培養(yǎng)備用。

3.3細胞分組與造模將大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞分為2組：常氧組與低氧組；大鼠II型肺泡上皮細胞分為4組：常氧組、常氧+T3（甲狀腺激素）組、低氧組、低氧+T3組［11］。每組設(shè)置3個復(fù)孔。本實驗常氧組培養(yǎng)條件為5% CO2，37 ℃。低氧組細胞置于密閉小室中，填充94% N2，5% CO2與1% O2，37 ℃。所有細胞培養(yǎng)周期均為24 h。甲狀腺激素T3的加入濃度為1 nmol/L［12］，提前加入培養(yǎng)液后再進行缺氧培養(yǎng)。

3.4細胞活性檢測

3.4.1CCK-8收集各組處理完畢的大鼠II型肺泡上皮細胞和大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞制備單細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度1×107/L，以每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。待細胞貼壁后，按分組進行相應(yīng)處理。處理完成24 h后，吸棄上清。無血清培養(yǎng)基1∶10稀釋CCK-8試劑，每孔加入已稀釋CCK-8工作液10 μL；并輕輕晃動培養(yǎng)板數(shù)次，37 ℃、5% CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度（）值。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

3.4.2細胞染色收集各組處理完畢的大鼠II型肺泡上皮細胞和大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞制備單細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度1×107/L，以每孔100 μL接種于96孔板中，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。待細胞貼壁后，按分組進行相應(yīng)處理。處理完畢后吸除上清液，PBS輕輕洗滌2次，在培養(yǎng)液中均勻滴加適量的Hoechst 33342細胞染色液（終濃度為1×）和PI（1∶100），在適宜于細胞培養(yǎng)的溫度孵育10 min。吸除含染料的培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液或PBS洗滌2～3次即可在熒光顯微鏡下拍照觀察。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

3.5細胞凋亡檢測

3.5.1流式細胞術(shù)收集各組處理完畢的大鼠II型肺泡上皮細胞和大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞制備單細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度2×108/L，以每孔2 mL接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。待細胞貼壁后，按分組進行相應(yīng)處理。處理完畢后吸取上層清液于對應(yīng)編號的離心管中備用，PBS洗滌細胞1次，吸棄上清液。加入胰蛋白酶消化，710 ×離心5 min，吸棄上清液，加入適量PBS洗滌并將懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL尖底離心管中，710 ×離心5 min，吸棄上清液。用500 μL的試劑盒緩沖液重懸細胞后，加入5 μL Annexin V輕輕吹勻，再加入5 μL的PI混勻；室溫避光反應(yīng)15 min，上機檢測分析。

3.5.2TUNEL染色將大鼠肺組織按TUNEL標準化流程制備組織切片。采用3DHISTECH （Hungary）生產(chǎn)的Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀進行掃描，然后進行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再根據(jù)組織大小采集3個區(qū)域9張400倍圖像，進行凋亡細胞分析。

3.6ELISA檢測收集各組處理完畢的細胞上清液，按ELISA檢測試劑盒說明書操作，在450 nm波長處測定甲狀腺細胞上清中LDH、T3、T4含量和大鼠II型肺泡上皮細胞上清中LDH含量。

3.7RT-qPCR檢測收集各組處理完畢的細胞與肺組織，按照RNA提取試劑盒的說明操作檢測并提取肺組織與細胞的RNA，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用核酸蛋白檢測儀檢測其純度，目的基因為、、和。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析PCR過程各檢測樣本的CT值。通過2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。所有序列與引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司進行合成提供。GRP78上游引物序列為5'-CGG AGG AGG AGG ACA AGA AGG AG-3'，下游引物序列為5'-ATA CGA CGG TGT GAT GCG GTT G-3'；IRE1Α上游引物序列為5'-GGA GAC CCT ACG CTA TTT GAC CT-3'，下游引物序列為5'-CTT CGA GCA AAG GAA GAG TGC T-3'；PERK上游引物序列為5'-TGG GAT GTC GCC GAT GGG ATA G-3'，下游引物序列為5'-AAT TCC ACT TCT CAC TGC CGC TTC-3'；ATF6上游引物序列為5'-GGA AGA GAA GCC TGT CAC TGG TC-3'，下游引物序列為5'-TCT TGG GTG CTG CTG GAA GTA AC-3'；β-actin上游引物序列為5'-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TT-3'，下游引物序列為5'-GCG GCA GTG GCC ATC TC-3'。

3.8Western blot檢測收集各組處理完畢的細胞與肺組織，在冰浴條件下進行裂解與蛋白提取，4 ℃、1 150×離心15 min后收集上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白質(zhì)相對定量后進行凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，放置于用TBST溶液室溫搖床震動封閉2 h，然后轉(zhuǎn)移至稀釋好的Ⅰ抗中，4 ℃冰箱內(nèi)過夜，稀釋倍數(shù)為：ATF6（1∶1 000）、IRE1α（1∶1 000）、PERK（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）及β-actin（1∶5 000），轉(zhuǎn)移至Ⅱ抗中室溫搖床孵育2 h，使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色處理，最后使用全功能成像儀拍照分析。

3.9免疫熒光檢測將各組處理好的細胞制備細胞爬片，使用PBS洗3次，每次5 min；接著浸入5% 破膜劑，室溫浸泡10 min，PBS洗3次，每次5 min；然后滴加山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，往爬片上滴加Ⅰ抗，4 ℃過夜，Ⅰ抗稀釋倍數(shù)為Bax（1：100）、ATF6（1∶50）、GRP78（1∶100），PBS洗3次，每次5 min；滴加Ⅱ抗，稀釋倍數(shù)為1∶100，37 ℃ 孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；然后滴加DAPI，室溫孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min；最后使用抗熒光衰減封片劑封片。使用顯微攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再采集400倍顯微圖像，共采集2個視野。采用Image-J圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的熒光強度（integrated density，IntDen）和面積（Area），并計算每張圖像的平均熒光強度。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行統(tǒng)計，使用單因素方差分析進行比較分析。事后多重比較選擇LSD-檢驗。所有計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　高原低氧對大鼠肺組織及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

RT-qPCR與Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高原模型組大鼠肺組織中GPR78的mRNA與蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），IRE1α、PERK和ATF6的mRNA與蛋白表達水平顯著升高（<0.01）；TUNEL染色結(jié)果顯示，高原模型組大鼠肺組織中細胞凋亡數(shù)量顯著增加（<0.01），見圖1。

Figure 1.　Effects of high-altitude hypoxia on expression of endoplasmic reticulum stress related factors in lung tissue of rats. A： GRP78mRNAexpression in rat lung tissue； B： GRP78 protein expression in rat lung tissue； C： mRNA expression of IRE1α， PERK， ATF6 in rat lung tissue； D： expression of IRE1α， PERK， ATF6 protein in rat lung tissue； E： apoptotic cells in rat lung tissue， green is apoptotic cells. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs normoxia.

2　低氧環(huán)境對甲狀腺細胞甲狀腺激素分泌的影響

檢測甲狀腺細胞在低氧環(huán)境中的活性，與常氧組細胞相比，低氧組細胞活性顯著下降，細胞上清中LDH含量顯著增加，甲狀腺激素T3和T4含量均顯著減少（<0.01），見圖2。

Figure 2.　Effects of hypoxic environment on thyroid cells. A： cell proliferation rates in the two groups； B： LDH content in two groups of cells； C： the contents of T3 and T4 in the two groups of cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs normoxia.

3　低氧環(huán)境下甲狀腺激素對大鼠II型肺泡上皮細胞活性及損傷的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組細胞增殖率顯著降低，死亡率和LDH含量顯著升高（<0.01）。外源性甲狀腺激素T3在常氧環(huán)境下不會影響細胞正?；钚裕?0.05），但在低氧環(huán)境下會提高細胞增殖率，減少細胞死亡率與LDH含量，提高細胞與凋亡細胞的比例（<0.01），見圖3。

Figure 3.　Effects of thyroid hormone on alveolar epithelial cells in hypoxic. A： cell proliferation rate in each group； B： cell mortality in each group； C： LDH content in cells of each group； D： cell death in each group （red is dead cells）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs normoxia；##P<0.01 vs hypoxia.

4　低氧環(huán)境下甲狀腺激素對大鼠II型肺泡上皮細胞GRP78表達及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

流式細胞術(shù)（圖4A）和RT-qPCR（圖4B）結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組細胞凋亡率顯著升高，IRE1α、PERK和ATF6 mRNA表達顯著升高；外源性甲狀腺激素T3在常氧條件下對肺泡上皮細胞凋亡率、PERK mRNA和GRP78蛋白表達均沒有影響，但顯著增加ATF6和IRE1α mRNA表達水平。在低氧環(huán)境下，與低氧組相比，外源性T3顯著降低細胞凋亡率（<0.01），并顯著降低通路上IRE1α、PERK和ATF6 mRNA表達和GRP78蛋白表達（<0.05）。

Figure 4.　Effect of thyroid hormone on rat type II alveolar epithelial cells in hypoxic. A： cell apoptosis rate in each group； B： the expression of IRE1α， PERK and ATF6 mRNA in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs normoxia；#P<0.05，##P<0.01 vs hypoxia.

熒光共定位結(jié)果顯示，在低氧環(huán)境下，無論是單光或者混合光，細胞中Bax、ATF6和GRP78蛋白陽性顯著表達，在甲狀腺激素T3的干預(yù)下，這三種蛋白陽性表達均顯著降低（<0.01），見圖5。

Figure 5.　Effect of thyroid hormone on endoplasmic network pathway in rat type II alveolar epithelial cells under hypoxia. A： GRP78 protein expression in cells of each group； B： GRP78 protein expression location in each group， green is positive expression protein； C： GRP78-ATF6 protein expression was colocalized in each group， with GRP78 in green and ATF6 in red； D： colocalization of Bax-ATF6 protein expression in cells of each group， Bax in green and ATF6 in red. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs normoxia；#P<0.05，##P<0.01 vs hypoxia.

討論

缺氧環(huán)境則是誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的經(jīng)典條件［13］，在急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下，促凋亡程序的激活導(dǎo)致細胞死亡［14］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，ATF6會與GRP78進入細胞核，產(chǎn)生前饋循環(huán)，促進子結(jié)合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein， CHOP）的表達，進一步激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［15-16］。我們結(jié)果均表明在高原缺氧的環(huán)境下，大鼠和肺泡上皮細胞均出現(xiàn)了由ATF6和GRP78表達增加而激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，與上述研究結(jié)果是一致的，說明高原低氧環(huán)境會刺激大鼠肺組織激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，造成肺泡上皮細胞凋亡，為誘發(fā)低氧性肺損傷的發(fā)生提供了條件。但是ATF6和GRP78涉及的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，不利于針對性開發(fā)藥物靶點。通過進一步查閱文獻發(fā)現(xiàn)，ATF6能激活I(lǐng)RE1α/XBP-1軸，促進胚胎發(fā)展過程中錯誤折疊蛋白的形成［17］，IRE1α/XBP-1和ATF6均可以在缺氧環(huán)境下被誘導(dǎo)激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器之一的PERK蛋白也通過促進ATF6合成并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體［18］，因此我們進一步檢測大鼠肺組織與肺泡細胞中IRE1α和PERK mRNA及蛋白的表達水平，與目前的研究結(jié)果基本一致，ATF6通過激活I(lǐng)RE1α/XBP-1軸增加蛋白質(zhì)折疊和促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中PERK mRNA表達，上調(diào)了凋亡相關(guān)基因與蛋白如Bax的表達。由此，我們初步得出結(jié)論，ATF6介導(dǎo)的IRE1α/XBP-1軸是大鼠與肺泡細胞在低氧環(huán)境下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的靶點通路，為接下來研究甲狀腺激素能否通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響低氧性肺損傷打下了基礎(chǔ)。

高海拔低氧環(huán)境可激活HPT軸和下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal axis， HPA）軸，促進如甲狀腺激素、腎上腺激素等“應(yīng)激激素”分泌［19］。甲狀腺相關(guān)激素的分泌是由腺垂體釋放促甲狀腺激素調(diào)控的，體內(nèi)研究報道，雖然高海拔缺氧初期不會立即引起甲狀腺激素水平的變化，但血清T3和T4水平會升高，這是一種代償性保護現(xiàn)象［20］。我們通過體外細胞實驗也證實了低氧條件會導(dǎo)致甲狀腺細胞損傷甚至死亡，從而減少甲狀腺激素T3和T4的分泌，導(dǎo)致肺泡細胞無法通過代償性的甲狀腺激素抵御低氧環(huán)境造成的損傷，而補充外源性甲狀腺激素能幫助肺泡上皮細胞在低氧環(huán)境下存活，由此說明維持甲狀腺激素的正常分泌與水平是細胞在低氧環(huán)境下生存的關(guān)鍵。在前面的實驗我們初步證明了低氧環(huán)境是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)因素，在此基礎(chǔ)上主動添加外源性甲狀腺激素T3后，肺泡上皮細胞高度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得到緩解。有研究表明，甲狀腺細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激高度敏感，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時分泌功能受損［21］，因此甲狀腺功能減退相關(guān)的不同甲狀腺疾病中都觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)。我們的結(jié)果也表明這一點，肺泡細胞低氧刺激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，外源性補充甲狀腺激素T3后，細胞內(nèi)GRP78與ATF6蛋白表達減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)緩解，凋亡蛋白Bax也隨之降低表達（圖6）。

Figure 6.　Pathway diagram of thyroid hormone T3 alleviating hypoxic lung injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress. GRP78： glucose-regulated protein 78； PERK： protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase； ATF6： activating transcription factor 6； eIF2α： eukaryotic initiation factor 2α； IRE1α： inositol-requiring enzyme 1α； XBP： X-Box binding protein； CHOP： C/EBP homologous protein； Bcl2： B-cell lymphoma 2.

綜上所述，甲狀腺激素在低氧環(huán)境下對大鼠II型肺泡上皮細胞是起保護作用的，能通過緩解細胞內(nèi)高度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，減少凋亡，從而減少與低氧性肺損傷相關(guān)的高原疾病發(fā)生。

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Thyroid hormone T3 protects type II alveolar epithelial cells and alleviates hypoxia-induced lung injury in rats by inhibiting endoplasmic reticulum stress

WANG Yaxuan， LIN Xue， DAI Chongyang， PU Xiaoyan△

（，，810016，）

To investigate whether thyroid hormone can reduce the damage of type II alveolar epithelial cells and lung tissue in rats under high-altitude hypoxic environment， and to explore its mechanism.Eight-week-old male SPF SD rats were divided into a normal control group and a plateau model group， with 10 rats in each group. The former group lived at an altitude consistent with local area，while the latter group was placed in a cabin that simulated the hypoxic environment at an altitude of 6 000 m to establish a plateau hypoxia model. After modeling， the serum and lung tissue samples of two-group animals were collected at normal altitudes. Apoptosis of rat lung tissue cells was observed with electron microscopy and TUNEL staining method. The expression levels of glucose-regulated protein 78 （GRP78）， inositol-requiring enzyme 1α （IRE1α）， protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase （PERK） and activating transcription factor 6 （ATF6） in rat lung tissues were detected by RT-qPCR and Western blot. The thyroid follicular epithelial cells were divided into a normoxic group and a hypoxic group， and cultured in normoxic or hypoxia condition for 24 h， respectively. The cell proliferation rate was detected using the CCK-8 method. The content of lactate dehydrogenase （LDH）， T3 and T4 were detected using ELISA. Rat type II alveolar epithelial cells were divided into normoxic group， normoxia+thyroid hormone （T3） group， hypoxic group， and hypoxia+T3 group， before hypoxia treatment was carried out. The cell proliferation rate was detected using CCK-8 method. The proportion of living and dead cells was observed using cell staining. The LDH content of the cells was detected using ELISA. Apoptosis was observed using TUNEL staining. The expression ofGRP78， IRE1α， PERK and ATF6mRNA and proteins in rat lung tissues were detected by RT-qPCR and Western blot. GRP78， ATF6 and Bax were detected using immunofluorescence.The number of apoptotic cells in lung tissue of rats in the plateau model group increased， and their expression of GRP78， IRE1α， PERK and ATF6 mRNA and proteins was significantly increased （<0.01）. After hypoxic culture， the proliferation rate and the contents of T3 and T4 decreased， while the LDH content significantly increased （<0.01）. Compared with the hypoxic group， the cell proliferation rate of hypoxia+T3 group was significantly increased， while the apoptosis rate and LDH content significantly decreased， and the expression of GRP78， IRE1α， PERK and ATF6 mRNA and proteins was significantly decreased （<0.01）.Exogenous thyroid hormones can alleviate hypoxia-induced type II alveolar epithelial cells injury in rats， possibly by inhibiting the mRNA and proteins of the endoplasmic reticulum stress pathway in alveolar epithelial cells.

hypoxic lung injury； endoplasmic reticulum stress； thyroid hormone； alveolar epithelial cells

R329.21； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.008

1000-4718（2023）09-1596-09

2023-04-23

2023-07-11

國家自然科學(xué)基金資助項目（No. 82160322）；青海省科學(xué)技術(shù)廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（No. 2023-ZJ-746）

Tel： 13897189261； E-mail： puxiaoyan1975@163.com

（責任編輯：余小慧，李淑媛）