苦參堿通過上調(diào)KLF4/Nrf2通路減輕H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷*

王杏， 喬莉， 馬歡， 王超， 張會(huì)欣△

苦參堿通過上調(diào)KLF4/Nrf2通路減輕H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷*

王杏1， 喬莉2， 馬歡1， 王超1， 張會(huì)欣2△

（1河北省人民醫(yī)院代謝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050051；2石家莊學(xué)院化工學(xué)院，石家莊 050035）

基于KLF4/Nrf2途徑探討苦參堿對(duì)過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）氧化損傷的作用及機(jī)制。培養(yǎng)HUVECs，采用CCK-8方法篩選苦參堿實(shí)驗(yàn)濃度。將HUVECs分為對(duì)照組、模型組和低、中、高濃度（0.5、1和2 mmol/L）苦參堿組，以H2O2（0.5 mmol/L）誘導(dǎo)建立HUVECs氧化損傷模型，檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GPX）活性；RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4， KLF4）、核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamyl cysteine synthetase， γ-GCS）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步采用siRNA技術(shù)敲減基因表達(dá)，與苦參堿共同作用，觀察上述指標(biāo)的變化。與模型組比較，苦參堿組細(xì)胞活力上升（<0.05），ROS水平和MDA含量降低（<0.05），SOD和GPX活性上升（<0.05），KLF4、Nrf2、HO-1、NOQ1及γ-GCS表達(dá)水平升高（<0.05）。抑制KLF4的表達(dá)后，苦參堿逆轉(zhuǎn)H2O2引起的細(xì)胞活力降低、ROS升高及抗氧化應(yīng)激分子表達(dá)的作用均顯著減弱（<0.05）?？鄥A能夠通過激活KLF4/Nrf2通路、抑制氧化應(yīng)激來減輕H2O2誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷。

苦參堿；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；KLF4/Nrf2信號(hào)通路

心血管疾?。╟ardiovascular diseases， CVD），是一類涉及心臟或血管的疾病，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)［1］。心血管疾病的產(chǎn)生過程與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)，維持血管內(nèi)皮功能已成為血管相關(guān)疾病治療方法之一［2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的內(nèi)層細(xì)胞，在保持血管功能和結(jié)構(gòu)完整性方面起著關(guān)鍵作用，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，誘發(fā)黏附分子和炎癥因子的表達(dá)及炎癥細(xì)胞浸潤，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷，促進(jìn)病理性血管重塑和動(dòng)脈粥樣硬化形成［3］。因此，開發(fā)具有抗氧化活性的藥物已成為心血管疾病研究的目標(biāo)和有效策略。

苦參堿（matrine， MT）又名母菊堿、苦甘草、苦豆根，是一種天然植物堿，同時(shí)苦參堿作為一種單體，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的優(yōu)點(diǎn)，具備開發(fā)成新藥的天然優(yōu)勢(shì)，在我國已被批準(zhǔn)用于慢性乙型病毒性肝炎的治療。苦參堿可抑制病毒活性、抗氧化、提高免疫力和抑制腫瘤等［4-5］，近期研究表明苦參堿對(duì)心血管系統(tǒng)疾病有著廣泛的藥理作用，可減輕冠脈結(jié)扎缺血、缺血再灌注、異丙腎上腺素、高血脂、糖尿病和阿霉素引起的心肌損傷［6］，能夠?qū)辜?xì)菌內(nèi)毒素、缺血再灌注和纖維蛋白原降解產(chǎn)物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［7］，提示苦參堿有潛力應(yīng)用于心血管疾病的治療［8］。Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4， KLF4）屬于KLF家族，研究認(rèn)為KLF4是參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，大量研究已經(jīng)表明KLF4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，與調(diào)節(jié)血管舒張、抑制炎癥和氧化應(yīng)激等有關(guān)［9］，KLF4水平降低會(huì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生，因此KLF4研究為心血管防治提供了新靶標(biāo)［10-11］。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)一條重要的抗氧化通路。然而苦參堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷是否有作用，以及KLF4/Nrf2在其中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）氧化損傷，觀察苦參堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷的作用，并進(jìn)一步通過沉默觀察苦參堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷作用的分子機(jī)制，為心血管疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1　材料

1.1細(xì)胞株HUVECs來源于ATCC。

1.2藥品與試劑苦參堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號(hào)519-02-8）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； H2O2購自山東利爾康醫(yī)療科技有限公司；CCK-8細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（批號(hào)E606335）購自上海生工生物技術(shù)有限公司；活性氧（reactive oxygen species， ROS）測(cè)定試劑盒（批號(hào)E004-1-1）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A003-1-2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A001-3-2）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GPX）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A005-1-2）購自南京建成生物工程研究所。兔源KLF4多克隆抗體（批號(hào)ab129473）、兔源Nrf2多克隆抗體（批號(hào)ab92946）、兔源血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）多克隆抗體（批號(hào)ab13243）、兔源醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）多克隆抗體（批號(hào)ab34173）和兔源γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamyl cysteine synthetase， γ-GCS）多克隆抗體（批號(hào)ab254663）均購自Abcam。小干擾RNA（KLF4-siRNA）及陰性對(duì)照siRNA（negative control siRNA， NC-siRNA）均由上海吉?jiǎng)P基因公司合成，序列見表1。RT-qPCR引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，序列見表2。

表1　KLF4小干擾RNA序列

表2　RT-qPCR引物序列

F： forward； R： reverse.

2　方法

2.1HUVECs培養(yǎng)HUVECs接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置在5% CO2、37 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱，按照細(xì)胞生長密度對(duì)HUVECs換液和傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2苦參堿對(duì)HUVECs活力的影響培養(yǎng)HUVECs，根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］選擇濃度為0、0.5、1、2、4和8 mmol/L的苦參堿（以DMEM培養(yǎng)液溶解）處理24 h，加入CCK-8試劑，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處的吸光度（），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以培養(yǎng)液調(diào)零為陰性對(duì)照組。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（給藥組-陰性對(duì)照組）/（對(duì)照組-陰性對(duì)照組）×100%。

2.3苦參堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響

2.3.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥培養(yǎng)HUVECs，分為對(duì)照（control）組、模型組（H2O2組）、低濃度苦參堿（L-MT+H2O2）組、中濃度苦參堿（M-MT+H2O2）組和高濃度苦參堿（H-MT+H2O2）組。模型組加入0.5 mmol/L H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷；低、中、高濃度苦參堿組分別加入0.5、1和2 mmol/L苦參堿和0.5 mmol/L H2O2共同培養(yǎng)；對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

2.3.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力收集細(xì)胞，加入CCK-8試劑，按試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.3.3化學(xué)熒光法檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按照說明書的步驟，測(cè)定500 nm處的熒光光度（）值，熒光光度值可反映細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，ROS含量（%）=（給藥組/對(duì)照組）×100%。

2.3.4檢測(cè)細(xì)胞中MDA、SOD和GPX水平收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，離心后取上清。按照說明書的步驟，TBA法檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量；WST-1法檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性；比色法檢測(cè)細(xì)胞中GPX活性。

2.3.5RT-qPCR法檢測(cè)KLF4、Nrf2、HO-1、NOQ1和γ-GCS的mRNA表達(dá)［12］收集細(xì)胞，加入TRIzol試劑，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，采用熒光定量PCR儀連續(xù)檢測(cè)熒光并進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后60 ℃ 5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。采用擴(kuò)展儀器自帶軟件樣點(diǎn)擬合法分析結(jié)果，以相對(duì)定量值反映mRNA表達(dá)水平。

2.3.6Western blot法檢測(cè)KLF4、Nrf2、HO-1、NOQ1和γ-GCS的蛋白表達(dá)［12］收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液吹打裂解細(xì)胞，冰浴下充分裂解10 min，重復(fù)3次，獲得細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。然后加入封閉液室溫封閉2 h，分別加入Ⅰ抗及內(nèi)參照β-actin抗體溶液，4 ℃孵育過夜。次日經(jīng)3次洗膜后加入相應(yīng)的Ⅱ抗溶液進(jìn)行反應(yīng)，洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色。采用成像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶，以目的蛋白和內(nèi)參照蛋白的灰度比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

2.4KLF4-siRNA轉(zhuǎn)染驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)［12］培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，分為對(duì)照（control）組、NC-siRNA組、KLF4-siRNA1組、KLF4-siRNA2組和KLF4-siRNA3組。NC-siRNA組利用Lipo2000轉(zhuǎn)染NC-siRNA，KLF4-siRNA各組利用Lipo2000轉(zhuǎn)染KLF4-siRNA1、KLF4-siRNA2或KLF4-siRNA3，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)KLF4 mRNA和KLF4蛋白表達(dá)。

2.5苦參堿和KLF4-siRNA聯(lián)合處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用培養(yǎng)HUVECs，分為control組、H2O2組、MT+H2O2組、MT+NC-siRNA+H2O2組和MT+KLF4-siRNA+H2O2組。MT+H2O2組加入2 mmol/L苦參堿和0.5 mmol/L H2O2；MT+NC-siRNA+H2O2組為2 mmol/L苦參堿0.5 mmol/L H2O2加入到轉(zhuǎn)染NC-siRNA的細(xì)胞；MT+KLF4-siRNA+H2O2組為2 mmol/L苦參堿0.5 mmol/L H2O2加入到轉(zhuǎn)染KLF4-siRNA2的細(xì)胞；control組常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，按照2.3.2～2.3.6進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)，以<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　苦參堿對(duì)HUVECs活力的影響

不同濃度苦參堿作用于HUVECs 24 h，結(jié)果顯示0.5、1和2 mmol/L的苦參堿作用后HUVECs活力高于90%；4和8 mmol/L苦參堿組比對(duì)照組細(xì)胞活力顯著降低（<0.05），因此選擇0.5、1和2 mmol/L的苦參堿作用24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

Figure 1.　Effect of matrine （MT） on the viability of HUVECs. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group.

2　苦參堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs活力的影響

與對(duì)照組比較，模型組HUVECs活力顯著降低（<0.05）；與模型組比較，苦參堿各劑量組HUVECs活力顯著升高（<0.05），見圖2。

Figure 2.　Effect of matrine （MT） on the viability of HUVECs induced by H2O2. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H2O2 group.

3　苦參堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS、MDA、SOD和GPX水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組ROS和MDA含量顯著升高（<0.05），SOD和GPX活性顯著降低（<0.05）；與模型組比較，苦參堿各劑量組ROS和MDA含量顯著降低（<0.05），SOD和GPX活性顯著升高（<0.05），見圖3。

Figure 3.　Effect of matrine （MT） on ROS， MDA， SOD and GPX levels in HUVECs induced by H2O2. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H2O2 group.

4　苦參堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs中KLF4、Nrf2、HO-1、NOQ1和γ-GCS mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（<0.05），Nrf2、HO-1、NOQ1、γ-GCS mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降（<0.05）；與模型組比較，苦參堿低、中、高劑量組KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（<0.05），Nrf2、HO-1、NOQ1、γ-GCS mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（<0.05），見圖4。

Figure 4.　Effect of matrine （MT） on KLF4， Nrf2， HO-1， NOQ1 and γ-GCSmRNA and proteinexpression in HUVECs induced by H2O2.A： the mRNA expression was determined by RT-qPCR； B： the protein expression was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H2O2 group.

5　KLF4-siRNA轉(zhuǎn)染驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與NC-siRNA組比較，KLF4-siRNA轉(zhuǎn)染組KLF4 mRNA和KLF4蛋白表達(dá)顯著降低（<0.05），KLF4-siRNA2組降低最為顯著，敲減效率為90%，表明基因沉默成功，因此選擇KLF4-siRNA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖5。

Figure 5.　KLF4 expression in HUVECs after transfection with KLF4-siRNA.A： the mRNA expression of KLF4 was determined by RT-qPCR； B： the protein expression of KLF4 was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC-siRNA group.

6　KLF4-siRNA轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)苦參堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs的作用

與MT+NC-siRNA+H2O2組比較，MT+KLF4-siRNA+H2O2組細(xì)胞活力顯著降低（<0.05），ROS和MDA含量顯著上升（<0.05），SOD和GPX活性顯著降低（<0.05），MT+NC-siRNA+H2O2組與MT+H2O2比較，上述指標(biāo)均無顯著差異（>0.05），見圖6。

Figure 6.　Effect of matrine （MT） combined with KLF4-siRNA on the viability and the oxidative stress-related indicators of HUVECs.A： the viability of HUVECs； B to E： the levels of ROS， MDA， SOD and GPX in HUVECs. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H2O2 group；△P<0.05 vs MT+NC-siRNA+H2O2 group.

與MT+NC-siRNA+H2O2組比較，MT+KLF4-siRNA+H2O2組Nrf2、HO-1、NOQ1和γ-GCS mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降（<0.05），MT+NC-siRNA+H2O2組與MT+H2O2比較，上述指標(biāo)均無顯著差異（>0.05），見圖7。

Figure 7.　Effect of matrine （MT） combined with KLF4-siRNA on the expression of oxidative stress-related factors in HUVECs. A： the mRNA expression was determined by RT-qPCR； B： the protein expression was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs H2O2 group；△P<0.05 vs MT+NC-siRNA+H2O2 group.

討論

本研究通過血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型證實(shí)了苦參堿可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)KLF4的表達(dá)，激活Nrf2，并進(jìn)一步啟動(dòng)下游HO-1、NOQ1、γ-GCS等抗氧化應(yīng)激分子的增加，從而減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)的重要作用。我們的研究為苦參堿應(yīng)用于血管損傷性疾病的干預(yù)提供了重要的數(shù)據(jù)積累。

苦參堿是從中藥苦參中分離的一種喹嗪類生物堿，具有傳統(tǒng)中草藥和單體化合物的雙重優(yōu)勢(shì)?？鄥A及其衍生物具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、血管保護(hù)等廣泛的生物活性，且安全性良好［13-14］。苦參堿在預(yù)防和改善動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、缺血再灌注損傷、心律失常和糖尿病心血管并發(fā)癥等心血管疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［15］，如Guo等［16］報(bào)道了苦參堿通過激活JAK2/STAT3通路調(diào)節(jié)Hsp70表達(dá)保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血/再灌注損傷，Hu等［17］報(bào)道了苦參堿通過維持AMPKα/UCP2通路減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。上述研究結(jié)論與本研究結(jié)果基本一致，證實(shí)了苦參堿對(duì)心血管的保護(hù)作用。所不同的是，我們的研究結(jié)果側(cè)重于闡明苦參堿對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制。

活性氧物質(zhì)ROS具有細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和維持體內(nèi)平衡的作用，ROS可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，使細(xì)胞功能被破壞，引起內(nèi)皮功能障礙［18］。H2O2因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)一步使內(nèi)皮細(xì)胞中氧化與抗氧化之間的平衡被打破，從而導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［19-20］。KLF4是血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，可以通過調(diào)節(jié)血管舒張、抑制炎癥、凝血和氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，越來越多的研究表明KLF4在心血管疾病中發(fā)揮重要作用［21-22］。然而KLF4在內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用尚不清楚。本研究以H2O2成功誘導(dǎo)了HUVECs氧化應(yīng)激損傷，并進(jìn)一步證實(shí)了H2O2可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞KLF4表達(dá)，同時(shí)引起了細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為ROS和MDA含量升高，SOD和GPX活性下降。這提示H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能與KLF4表達(dá)抑制有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)了HUVECs中ROS的產(chǎn)生，后者驅(qū)動(dòng)“ROS信號(hào)傳導(dǎo)”的氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。Nrf2是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，可調(diào)控其下游抗氧化因子HO-1、NOQ1和γ-GCS的表達(dá)，在機(jī)體中發(fā)揮維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的作用［23］。有研究表明，苦參堿能夠通過激活p38 MAPK/Nrf2/ARE的活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)抗晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的ROS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［24］。本研究結(jié)果認(rèn)為苦參堿能夠降低氧自由基生成，提高細(xì)胞內(nèi)部抗氧化功能，減輕大量氧物質(zhì)引起的損傷，升高Nrf2及其下游抗氧化因子HO-1、NOQ1和γ-GCS的表達(dá)，能夠抑制HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。

H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞損傷后，KLF4表達(dá)下降，而苦參堿能夠促進(jìn)KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)，因此推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子KLF4與苦參堿抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。已有研究表明KLF4能夠直接結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)Nrf2的表達(dá)，從而影響氧化應(yīng)激反應(yīng)［25］。我們進(jìn)一步采用siRNA技術(shù)沉默基因表達(dá)，結(jié)果顯示沉默逆轉(zhuǎn)了苦參堿對(duì)HUVECs活力的升高和對(duì)ROS生成的抑制，并逆轉(zhuǎn)了苦參堿上調(diào)的Nrf2、HO-1、NOQ1和γ-GCS表達(dá)水平，表明基因沉默能夠逆轉(zhuǎn)苦參堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs的一系列作用，進(jìn)一步表明苦參堿能夠通過上調(diào)KLF4信號(hào)，降低H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，本研究證實(shí)了苦參堿可以有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能。其作用機(jī)制為上調(diào)KLF4表達(dá)，激活Nrf2，并進(jìn)一步啟動(dòng)下游HO-1、NOQ1、γ-GCS等抗氧化應(yīng)激分子的表達(dá)，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)的重要作用。

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Matrine alleviates H2O2-induced oxidative damage in human umbilical vein endothelial cells by up-regulating KLF4/NRF2 pathway

WANG Xing1， QIAO Li2， MA Huan1， WANG Chao1， ZHANG Huixin2△

（1，，050051，；2，，050035，）

To investigate the mechanism and the protective effect of matrine against hydrogen peroxide （H2O2）-induced oxidative injury in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） based on the KLF4/Nrf2 pathway.The HUVECs were cultured and screened to determine the experimental concentration of matrine using CCK-8 method. The HUVECs were divided into control group， model group， and low-， medium- and high-concentration （0.5， 1 and 2 mmol/L） matrine groups. An oxidative injury model of HUVECs was induced by H2O2（0.5 mmol/L）， and cell viabilty and intracellular reactive oxygen species （ROS）， malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GPX） levels were detected. The mRNA and protein levels of Krüppel-like factor 4 （KLF4）， nuclear factor E2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， quinone oxidoreductase 1 （NQO1） and γ-glutamyl cysteine synthetase （γ-GCS） were detected using RT-qPCR and Western blot. Changes in these indicators were observed after siRNA-mediated knockdown ofgene expression and cotreatment with matrine.Compared with model group， the cell viability was increased （<0.05）， ROS and MDA levels were decreased （<0.05）， SOD and GPX activity was increased （<0.05）， and the expression levels of KLF4， NRF2， HO-1， NOQ1 and γ-GCS were increased in matrine groups （<0.05）. Inhibiting KLF4 expression significantly weakened the protective effect of matrine against H2O2-induced decrease in cell viability， increase in ROS， and expression of oxidative stress-related molecules （<0.05）.Matrine can alleviate H2O2-induced oxidative injury in HUVECs by activating KLF4/Nrf2 pathway and inhibiting oxidative stress.

matrine； human umbilical vein endothelial cells； oxidative stress； KLF4/Nrf2 pathway

R363； R543

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.005

1000-4718（2023）09-1570-08

2023-05-22

2023-08-12

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No. 81370900）；河北省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2023005）；石家莊學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金（No. 22BS002）

Tel： 0311-66617323； E-mail： hxzhang76@163.com

（責(zé)任編輯：李淑媛，余小慧）