大腸桿菌必需基因的CRISPR-Cas9敲除策略及高效質(zhì)粒置換方法

劉錦輝,黃建峰,尤曉顏*,張燕飛*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng),471023)2(中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,國(guó)家合成生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)新中心,天津,300308)

必需基因通常被定義為無法從基因組刪除的基因[1-2]。在原核生物如大腸桿菌中,必需基因?qū)?xì)胞基本功能的維持有著極為重要的作用,其對(duì)細(xì)胞存活是絕對(duì)必要的[3]。目前,盡管使用單基因刪除、基于CRISPR/dCas系統(tǒng)的多基因抑制以及轉(zhuǎn)座子誘變等方法可有效確定基因組必需基因,但是針對(duì)必需基因功能研究方法較少[3]。如何保證必需基因被敲除后細(xì)胞可保持正常生長(zhǎng),并探究必需基因突變體的正常功能表征是必需基因功能研究面臨的難題,缺乏有效的遺傳操作工具是造成這一困難的主要原因。

LIANG等[4]利用Flp/FRT系統(tǒng)并使用基因tet和sacB作為正反篩標(biāo)記構(gòu)建了一種可刪除大腸桿菌基因組必需基因的方法。但是當(dāng)目標(biāo)必需基因發(fā)生突變或被改造而嚴(yán)重影響細(xì)胞正常生理功能時(shí),可能引發(fā)逃逸現(xiàn)象而導(dǎo)致編輯效率顯著下降。FAN等[5]報(bào)道了一種質(zhì)粒改組的酵母必需基因編輯方法。將待編輯的必需基因yfeg克隆至回補(bǔ)質(zhì)粒并使用URA3作為選擇標(biāo)記。在含有5-氟乳清酸的平板培養(yǎng)時(shí),可篩選出無回補(bǔ)質(zhì)粒的基因編輯菌株。該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)必需基因的功能表征,但是選擇標(biāo)記篩選方法也可能使細(xì)胞發(fā)生突變進(jìn)行逃逸。CRISPR/Cas9作為第三代基因編輯技術(shù),自問世以來就廣泛用于細(xì)胞基因組的編輯[6-7]。Cas9可在向?qū)NA(sgRNA)的靶向作用下被引導(dǎo)至目標(biāo)基因靶點(diǎn)位置進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源修復(fù)如非同源末端拼接或同源重組,即可實(shí)現(xiàn)基因組基因精準(zhǔn)、高效且快速的刪除、插入及替換操作[8-9]。目前,針對(duì)于大腸桿菌的CRISPR/Cas9基因編輯使用最多的是由JIANG等[10]開發(fā)的pCas/pTarget雙質(zhì)粒系統(tǒng),該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)大腸桿菌高效單基因編輯(效率高達(dá)100%)或多基因連續(xù)編輯,但是無法實(shí)現(xiàn)必需基因編輯。

為實(shí)現(xiàn)大腸桿菌基因組必需基因的高效、無痕編輯,我們以必需基因metK[11-13](編碼的S-腺苷甲硫氨酸合酶催化L-甲硫氨酸與ATP反應(yīng)生成生長(zhǎng)必需因子S-腺苷甲硫氨酸)作為對(duì)象,構(gòu)建了一種基于CRISPR/Cas9的基因組必需基因編輯方法。首先,構(gòu)建攜帶有野生型metK基因但PAM位點(diǎn)被突變的編輯質(zhì)粒pHL3。另外構(gòu)建含有完整metK(PAM位點(diǎn)突變)表達(dá)盒的回補(bǔ)質(zhì)粒。在消去pCas和pHL3之前轉(zhuǎn)化回補(bǔ)質(zhì)粒形成三質(zhì)粒菌株,最終消去編輯質(zhì)?？色@取含有回補(bǔ)質(zhì)粒的基因組必需基因metK敲除菌株(圖1)。探索了基于質(zhì)粒不相容及Flp/FRT系統(tǒng)兩種回補(bǔ)質(zhì)粒置換方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)回補(bǔ)質(zhì)粒的高效置換,有助于MetK突變體的功能表征。通過生長(zhǎng)表征,metK表達(dá)盒(野生型)克隆至質(zhì)粒時(shí)對(duì)菌株生長(zhǎng)無明顯影響,而MetKK265A(對(duì)L-甲硫氨酸親和力降低)突變體可使菌株生長(zhǎng)與L-甲硫氨酸濃度相偶聯(lián)?；贑RISPR/Cas9的必需基因編輯及質(zhì)粒置換方法可實(shí)現(xiàn)高效基因組必需基因的無痕編輯,并對(duì)必需基因進(jìn)行功能表征。所選取的MetKK265A突變體有望被開發(fā)作響應(yīng)L-甲硫氨酸的生物傳感器,實(shí)現(xiàn)L-甲硫氨酸高產(chǎn)菌的篩選。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒,Omega公司;基因組DNA提取試劑盒,Promega公司;一步克隆試劑盒(One step clony Kit)、高保真DNA聚合酶,南京諾維贊有限公司;PCR清潔試劑盒,AxyGEN公司;DpnⅠ限制性內(nèi)切酶,New England Biology公司;常規(guī)化學(xué)試劑,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;卡那霉素(Kanamycin,Kan)、大觀霉素(spectinomycin,SD)、氯霉素(chloramphenicol,Cm),生工生物工程(上海)股份有限公司。

Eppendorf Eporator型電轉(zhuǎn)化儀,德國(guó)Eppendorf公司;RePure-A型PCR儀,杭州柏恒科技有限公司;0.2 cm電擊杯、ChemiDoc MP型凝膠成像儀,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;MicroScreen HT型高通量微生物生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng),杰靈儀器制造(天津)有限公司。

1.2 菌株、質(zhì)粒及相關(guān)引物

本研究中所使用或構(gòu)建的菌株及質(zhì)粒見表1。所使用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成,序列詳見表2。

表1 研究所使用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids were used in this study

表2 研究所使用引物Table 2 Primers were used in this study

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1 基因編輯質(zhì)粒構(gòu)建

以pTargetF質(zhì)粒為模板,引物pT-metK-F/R突變N20序列,PCR結(jié)束后使用DpnⅠ消化模板,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,SD平板篩選轉(zhuǎn)化子,pTarget-VF測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建質(zhì)粒pHL1。以MG1655基因組為模板,引物metK-LA-F/R擴(kuò)增500 bp左同源臂片段,引物metK-RA-F/R擴(kuò)增500 bp右同源臂片段;以pHL1為模板,引物pT-donor(metK)-F/R擴(kuò)增連接載體,三片段連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,SD平板篩選及pTarget-VF/VR測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建質(zhì)粒pHL2。以質(zhì)粒pHL2為模板,引物PND-metK*-F/R擴(kuò)增載體片段;以MG1655基因組為模板,引物RBS-metK*-F/R擴(kuò)增metK基因ATG到TAA部分的片段,大小約為1 155 bp。兩片段消化、純化后經(jīng)One step clony Kit連接,轉(zhuǎn)化后SD平板篩選,pTarget-VF2/VR2測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建編輯質(zhì)粒pHL3。

1.3.2 回補(bǔ)質(zhì)粒構(gòu)建

以質(zhì)粒pET28a(+)為模板,引物Kan-F/ R擴(kuò)增Kan抗性篩選標(biāo)記片段;以質(zhì)粒pHL4為模板,引物ORI-F/ORI-R擴(kuò)增復(fù)制子CloDF13片段,引物MetK-F/MetK-R擴(kuò)增野生型metK表達(dá)盒片段,3個(gè)片段經(jīng)消化純化后連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,Kan抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行鑒定及測(cè)序,測(cè)序引物為K-VF/VR,獲取回補(bǔ)質(zhì)粒pHL8。

1.3.3 置換質(zhì)粒構(gòu)建

以E.coliMG1655基因組為模板,引物CmetK-F/CmetK-R擴(kuò)增帶有野生型啟動(dòng)子的metK基因表達(dá)盒,質(zhì)粒pJH1為模板,引物CDFD-F/CDFD-R擴(kuò)增質(zhì)粒骨架,兩片段經(jīng)消化純化后連接得置換質(zhì)粒pHL9。以質(zhì)粒pJH2為模板,引物FLP-F/FLP-R擴(kuò)增flp片段,以pHL9為模板,引物CDFD1-F/CDFD1-R擴(kuò)增連接的質(zhì)粒骨架片段,兩片段經(jīng)消化純化后連接得置換質(zhì)粒pHL10。

1.4 必需基因metK編輯過程

參考JIANG等[10]報(bào)道,構(gòu)建E.coliMG1655/pCas并制備為電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,將編輯質(zhì)粒pHL3(約500 ng)與E.coliMG1655/pCas電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞混勻,轉(zhuǎn)移至0.2 cm電擊杯中,調(diào)節(jié)電壓至2.5 kV進(jìn)行電擊,電擊完成后加900 μL LB培養(yǎng)基,220 r/min,30 ℃孵育2.5 h。孵育完成后4 500 r/min離心濃縮菌體,涂布至含有SD及Kan的雙抗性平板,30 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h。用引物Delt-metK-VF/VR進(jìn)行菌落PCR,篩選基因組metK敲除的轉(zhuǎn)化子。挑取metK敲除菌株,接種至含有SD和Kan抗性的LB培養(yǎng)基中,隨后將其制備為化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化回補(bǔ)質(zhì)粒pHL7,于含有Kan、SD和Cm抗性的LB平板篩選含有三質(zhì)粒的metK敲除菌株。隨后參考JIANG等[10]的方法依次消去pCas和pHL3,最終獲得基因組metK敲除菌株。測(cè)序驗(yàn)證引物為Delt-metK-VF/VR。

1.5 必需基因metK敲除菌株生長(zhǎng)測(cè)試

將野生型MG1655及metK敲除菌株接種至 10 mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12～16 h作種子液。2個(gè)菌株生長(zhǎng)測(cè)試使用使用杰靈快速生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)MicroScreen HT進(jìn)行。對(duì)于LB培養(yǎng)基,直接按1%接種量接種至含有50 mL LB的搖瓶中,37 ℃,220 r/min培養(yǎng),間隔1 h取樣測(cè)定OD600值,繪制生長(zhǎng)曲線。對(duì)于M9培養(yǎng)基(6.8 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.0 g/L NH4Cl, 0.24 g/L MgSO4, 11.1 mg/L CaCl2, 4 g/L菌落糖),取1 mL種子液,4 500 r/min離心2 min后棄上清液,加1 mL M9培養(yǎng)基重懸菌體,按1%接種量接種至裝有1 mL M9培養(yǎng)基的48孔板中。隨后調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件為800 r/min,37 ℃,觀察菌株生長(zhǎng)曲線,當(dāng)菌株進(jìn)入平臺(tái)期后停止儀器運(yùn)行。繪制菌株生長(zhǎng)曲線。LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基生長(zhǎng)測(cè)試分別設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。

1.6 質(zhì)粒置換方法

將菌株E.coliMG1655 ΔmetK/pHL8制備為化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化置換質(zhì)粒pHL9或pHL10,復(fù)蘇完成后4 500 r/min離心3 min,棄上清液,用M9培養(yǎng)基重懸菌體,接種至10 mL含有Sm抗性的M9培養(yǎng)基中,220 r/min,37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)。將培養(yǎng)物稀釋105倍,分別取100 μL涂布于Sm單抗性平板和Sm+Kan雙抗性平板,37 ℃倒置過夜培養(yǎng)12～16 h后統(tǒng)計(jì)平板菌落數(shù)。從Sm抗性平板中任意挑取20個(gè)單克隆,于Kan抗性平板劃線,驗(yàn)證Kan抗性。根據(jù)Kan抗性驗(yàn)證情況,計(jì)算回補(bǔ)質(zhì)粒的未置換效率。回補(bǔ)質(zhì)粒的置換效率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 E.coli MG1655基因組必需基因metK的高效無痕敲除

為實(shí)現(xiàn)基因組metK必需基因的編輯,在metK基因內(nèi)部距離起始密碼子<30 bp的范圍內(nèi)選取PAM位點(diǎn),取其上游20 bp的序列作為N20,各取ATG前及TAA后500 bp作為同源臂,并克隆基因組metK構(gòu)建編輯質(zhì)粒pHL3(圖1-a),使基因metK編輯成功后細(xì)胞可正常生長(zhǎng)。為防止Cas9對(duì)編輯質(zhì)粒pHL3上metK的切割,將pHL3中metK的PAM位點(diǎn)突變?yōu)镻AMCCT→PAMTCT。同時(shí),為保證編輯工具質(zhì)粒消除后,被編輯菌株可正常生長(zhǎng),將E.coliMG1655基因組完整metK基因表達(dá)盒克隆至質(zhì)粒,并將PAM位點(diǎn)進(jìn)行突變(PAMCCT→PAMTCT,表示為PAMLess)構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒pHL7及pHL8。參考JIANG等[10]報(bào)道對(duì)基因組metK進(jìn)行編輯,篩選出metK敲除菌株后將其制備為化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化回補(bǔ)質(zhì)粒pHL7或pHL8,構(gòu)建三質(zhì)粒菌株E.coliMG1655 ΔmetK/pCas-pHL3-pHL7(或pHL8),隨后分別消去編輯質(zhì)粒pCas和pHL3,最終獲得攜帶有metK表達(dá)盒回補(bǔ)質(zhì)粒的基因組必需基因metK敲除菌株E.coliMG1655 ΔmetK/pHL7及E.coliMG1655 ΔmetK/pHL8,命名為JHb1和JHb2(圖1-c)。

根據(jù)驗(yàn)證引物在基因組位置,若metK未編輯成功則PCR擴(kuò)增目的條帶約為3.0 kbp,若編輯成功則目的條帶大小為1.5 kbp。經(jīng)PCR和核酸電泳驗(yàn)證,所挑取平板單菌落均為metK敲除(圖2-a),成功獲得metK敲除菌株E.coliMG1655 ΔmetK/pCas-pHL3。為驗(yàn)證基因組必需基因metK成功敲除,通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明基因組metK被敲除,符合PCR驗(yàn)證結(jié)果(圖2-b)。

2.2 基于質(zhì)粒不相容的質(zhì)粒置換方法

為實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒置換,方便研究具有不同酶學(xué)性質(zhì)的MetK突變體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生理影響,探索了高效質(zhì)粒置換方法。首先采取質(zhì)粒不相容原理策略,置換質(zhì)粒與回補(bǔ)質(zhì)粒含有相同的復(fù)制子[14]。當(dāng)置換質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后,在Sm抗性選擇壓力下,回補(bǔ)質(zhì)粒可被置換(圖3)。為驗(yàn)證MetK為野生型或?yàn)橥蛔凅w時(shí)質(zhì)粒置換效率,除了選擇野生型MetK,還有MetKK265A及MetKK269M[對(duì)L-甲硫氨酸的Km值分別為0.54 mmol/L和7.1 mmol/L,高于MetKWT(0.08 mmol/L),可能影響SAM的正常合成而影響細(xì)胞生長(zhǎng)][15]2種突變體進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表3,在質(zhì)粒不相容的選擇壓力下,當(dāng)MetK為野生型時(shí)質(zhì)粒置換效率可達(dá)(74.83±0.12)%,但是含有MetKK265A及MetKK269M的置換效率為(0±0)%。以上結(jié)果表明,對(duì)于Km值(對(duì)底物L(fēng)-甲硫氨酸)變大的MetK突變體,僅依靠質(zhì)粒不相容無法實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒置換,從而影響對(duì)該突變體的功能表征。

圖3 基于質(zhì)粒不相容的質(zhì)粒置換方法Fig.3 Method of plasmid replacement based on plasmid incompatibility

表3 不同置換方法中回補(bǔ)質(zhì)粒的置換效率Table 3 Replacement efficiency of the complement plasmid in different methods

2.3 基于Flp/FRT系統(tǒng)的質(zhì)粒置換方法

為提高質(zhì)粒置換效率,在質(zhì)粒不相容的方法基礎(chǔ)上,我們探索了第二種基于Flp/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的質(zhì)粒置換方法。在回補(bǔ)質(zhì)粒復(fù)制子兩端加入同向FRT位點(diǎn)構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒pHL8,并在置換質(zhì)粒中加入flp基因構(gòu)建pHL10。當(dāng)pHL10進(jìn)入細(xì)胞后,flp表達(dá)重組酶Flp識(shí)別FRT位點(diǎn),使回補(bǔ)質(zhì)粒分裂為兩部分,一部分含有復(fù)制子但無metK及篩選標(biāo)記,一部分有metK及篩選標(biāo)記但無法復(fù)制(圖4),此時(shí)宿主細(xì)胞無法保留野生型MetK,應(yīng)該有助于提高質(zhì)粒置換效率?；诖?我們重新驗(yàn)證該系統(tǒng)中,攜帶MetKWT、MetKK265A及MetKK269M置換質(zhì)粒的置換效率。將pHL10轉(zhuǎn)化至E.coliMG1655 ΔmetK/pHL8,在Sm抗性的選擇壓力下于M9培養(yǎng)基中培養(yǎng),將培養(yǎng)物稀釋涂布分離單菌落并驗(yàn)證Kan抗性,若存在Kan抗性則說明回補(bǔ)質(zhì)粒pHL8置換失敗;若無Kan抗性則說明回補(bǔ)質(zhì)粒置換成功。隨后挑取無Kan抗性菌株提取質(zhì)粒驗(yàn)證突變有無回復(fù)突變。如表3所示,攜帶MetKWT、MetKK265A及MetKK269M置換質(zhì)粒的置換效率可分別提升至(100±0)%、(100±0)%及(84.10±5.16)%。以上結(jié)果表明利用Flp/FRT系統(tǒng)可有效提高回補(bǔ)質(zhì)粒的置換效率,促進(jìn)對(duì)必需基因功能的研究。

2.4 基因組metK敲除菌株生長(zhǎng)測(cè)試

為探索metK克隆至質(zhì)粒后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是否有影響,以野生型E.coliMG1655菌株作為對(duì)照,以編輯菌株JHb1(帶有回補(bǔ)質(zhì)粒pHL7)、JHb2(帶有回補(bǔ)質(zhì)粒pHL8)和JHb3(帶有置換質(zhì)粒pHL10,野生型metK表達(dá)盒)作為研究對(duì)象,選用LB培養(yǎng)基和以葡萄糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)測(cè)試。結(jié)果表明,在LB培養(yǎng)基中,編輯菌株與對(duì)照菌株保持相同生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖5-a)。但在M9培養(yǎng)基中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相對(duì)平緩,到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間延長(zhǎng),這可能是由于M9培養(yǎng)基僅含有葡萄糖作為碳源,缺乏其他生長(zhǎng)因子所導(dǎo)致(圖5-b)。說明帶有野生型metK或PAM位點(diǎn)突變的metK克隆至質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)也可維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)。

本文還對(duì)攜帶MetKK265A的菌株在M9培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。當(dāng)培養(yǎng)基中僅以葡萄糖作為唯一碳源時(shí),菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制,培養(yǎng)30 h后OD600值僅為0.51,這可能是由于MetKK265A對(duì)L-甲硫氨酸的親和力嚴(yán)重下降導(dǎo)致了SAM合成受限,進(jìn)而影響了細(xì)胞正常生理功能。當(dāng)培養(yǎng)基中添加有0.8 g/LL-甲硫氨酸時(shí)生長(zhǎng)恢復(fù),OD600值為1.98,略低于野生型(圖5-c)。

3 討論

必需基因作為細(xì)胞生命活動(dòng)保守的基本功能單位,其功能研究可有助于理解生命的起源和進(jìn)化[1]。但是由于早期缺乏有效的編輯工具,難以實(shí)現(xiàn)對(duì)必需基因的功能表征。本研究中,我們開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9的大腸桿菌基因組必需基因敲除方法,可實(shí)現(xiàn)基因組必需基因的高效無痕刪除。在pCas/pTarget系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,將必需基因metK克隆至質(zhì)粒pTarget構(gòu)建編輯質(zhì)粒pHL3以保證基因組metK成功編輯后細(xì)胞存活(圖1-a),構(gòu)建帶有PAM位點(diǎn)突變的metK的回補(bǔ)質(zhì)粒保證編輯質(zhì)粒消去后細(xì)胞生長(zhǎng),經(jīng)過兩步電轉(zhuǎn)及一步化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式可實(shí)現(xiàn)必需基因metK的高效刪除(圖1-c)。在前期構(gòu)建時(shí),PAM位點(diǎn)選取自metK基因中部,構(gòu)建的基因編輯質(zhì)粒pHL3經(jīng)電轉(zhuǎn)化篩選時(shí),挑取大量單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證難以獲取陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn),一部分基因組中PAM位點(diǎn)與編輯質(zhì)粒中的PAM突變位點(diǎn)發(fā)生了重組,即基因組中PAMCCT→PAMTCT,一部分發(fā)生逃逸未實(shí)現(xiàn)編輯(圖1-a)。根據(jù)λ-Red重組系統(tǒng)原理,當(dāng)上下游修復(fù)模板長(zhǎng)度>35 bp時(shí)即可實(shí)現(xiàn)高效的重組[16]。當(dāng)PAM位點(diǎn)在基因中部時(shí),Cas9切割后,pHL3中PAMTCT兩端的序列可作為同源修復(fù)模板,導(dǎo)致metK編輯效率低下。為提高編輯效率,我們?cè)趽?jù)metK內(nèi)部距ATG或TAA<30 bp的位置選取PAM位點(diǎn),重新構(gòu)建編輯質(zhì)粒pHL3。經(jīng)驗(yàn)證,所挑取的平板單克隆均為metK敲除菌株, 實(shí)現(xiàn)metK的100%編輯(圖1-b)。

為實(shí)現(xiàn)對(duì)MetK突變體的功能表征,我們探索了質(zhì)粒不相容和基于Flp/FRT系統(tǒng)的兩種回補(bǔ)質(zhì)粒置換方式。依賴于質(zhì)粒不相容原理,當(dāng)MetK為野生型時(shí)可實(shí)現(xiàn)(74.83±0.12)%的置換效率,但是對(duì)L-甲硫氨酸親和力下降的突變體MetKK265A及MetKK269M無法實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒置換,這可能是因?yàn)橥蛔凅w對(duì)L-甲硫氨酸親和力下降,影響SAM合成效率,使底盤細(xì)胞通過自適應(yīng)調(diào)節(jié)保留了回補(bǔ)質(zhì)粒以維持細(xì)胞生長(zhǎng)。在質(zhì)粒不相容基礎(chǔ)上加入Flp/FRT系統(tǒng)后,攜帶MetKWT、MetKK265A及MetKK269M的置換質(zhì)粒對(duì)回補(bǔ)質(zhì)粒的置換效率可達(dá)100%、100%及84.10%,說明基于此方式可有效實(shí)現(xiàn)回補(bǔ)質(zhì)粒的高效置換。值得注意的是,MetKK269M雖然成功置換回補(bǔ)質(zhì)粒,但是所獲得菌株中MetKK269M均發(fā)生回復(fù)突變MetKM269K,說明當(dāng)MetK突變體活力嚴(yán)重下降時(shí),即使能夠成功置換回補(bǔ)質(zhì)粒細(xì)胞也會(huì)發(fā)生逃逸。這一現(xiàn)象說明基于Flp/FRT的質(zhì)粒置換系統(tǒng)在解決回復(fù)突變問題上有待進(jìn)一步改進(jìn)。

經(jīng)過LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基培養(yǎng)生長(zhǎng)監(jiān)測(cè),質(zhì)粒表達(dá)metK(野生型和含有PAM突變)的編輯菌株與野生型菌株E.coliMG1655無明顯生長(zhǎng)差異,說明基于質(zhì)粒表達(dá)的metK可正常維持細(xì)胞生長(zhǎng)。通過對(duì)突變體MetKK265A的生長(zhǎng)表征,使用僅含有無機(jī)鹽和葡萄糖的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到嚴(yán)重限制,但是這一限制可以通過外源L-甲硫氨酸的添加恢復(fù),這一表征結(jié)果說明基于Flp/FRT的質(zhì)粒置換系統(tǒng)對(duì)必需基因功能表征的可行性。另外,突變體MetKK265A的生長(zhǎng)表征結(jié)果使得其有望被開發(fā)作為可響應(yīng)L-甲硫氨酸的生物傳感器,用作L-甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選。