新疆地區(qū)母乳中乳酸菌的分離鑒定及潛在益生菌的篩選

國笑情,武岳,李瑜,羅瑞,劉文俊*

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010018)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010018)3(內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010018)

母乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),不僅可以滿足嬰兒生長需求,其中含有的各種有益菌還可以促進(jìn)嬰兒腸道營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、增強(qiáng)免疫,減少疾病發(fā)生,被公認(rèn)為是嬰兒最佳的營養(yǎng)來源[1]。這些營養(yǎng)成分可以促進(jìn)嬰幼兒生長[2],更會(huì)直接或間接地增強(qiáng)嬰兒腸道黏膜的屏障功能和免疫功能,提高嬰兒對(duì)疾病的抵抗能力[3]。KORDY等[4]研究發(fā)現(xiàn)母乳中的細(xì)菌主要由Staphylococcus,Streptococcus,Acinetobacter和Enterobacter組成。UBIECH等[5]研究發(fā)現(xiàn)母乳含有乳酸桿菌屬細(xì)菌中最常見的是:Lactobacillusgasseri和Lacticaseibacillusparacasei。DING等[6]研究發(fā)現(xiàn)母乳中的細(xì)菌組成受泌乳時(shí)間的影響,人類母乳在建立嬰兒腸道健康和免疫方面發(fā)揮重要作用。因此可以證明母乳中存在微生物,并且微生物通過特定的內(nèi)源性路線源源不斷地提供共生細(xì)菌來促進(jìn)嬰兒腸道健康[7],保護(hù)嬰兒遠(yuǎn)離外源病菌,并且提高嬰兒的免疫系統(tǒng)。

益生菌被定義為當(dāng)攝入足夠的量時(shí),對(duì)宿主具有健康作用的活的微生物,而對(duì)胃腸液的耐受性是益生菌篩選的關(guān)鍵環(huán)節(jié),只有能耐受人體消化液的菌株才能到達(dá)相應(yīng)部位發(fā)揮其功效成為益生菌[8]。研究表明,益生菌產(chǎn)品中活菌的數(shù)量應(yīng)至少為106～107CFU/g,才能產(chǎn)生有益作用[9]。益生菌的益生功效被不斷證實(shí)和挖掘,益生菌與人體健康的研究正受到前所未有的關(guān)注,例如:益生菌可以調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡[10]、對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)[11]、可通過調(diào)控機(jī)體代謝從而緩解代謝綜合征的發(fā)生與發(fā)展等。益生乳酸菌被廣泛應(yīng)用于乳制品、活菌藥物,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和動(dòng)物養(yǎng)殖,具有廣泛的應(yīng)用前景和研究價(jià)值。然而,我國具有優(yōu)良特性的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)乳酸菌資源相對(duì)缺乏。因此,分離、保藏乳酸菌對(duì)于優(yōu)良益生特性菌種的篩選和利用具有重要意義。

本文采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對(duì)6份新疆地區(qū)母乳中的乳酸菌進(jìn)行分離純化,將益生菌株BifidobacteriumlactisBB12作為對(duì)照組,通過發(fā)酵特性、體外胃腸液耐受性及膽鹽耐受性試驗(yàn)對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行篩選,得到2株具有潛在益生特性的雙歧桿菌,研究其生理生化特征及生物學(xué)特性,為研究新疆地區(qū)母乳樣品中的乳酸菌多樣性提供原始數(shù)據(jù),豐富我國菌種資源,為母乳中益生菌的研究和開發(fā)提供雙歧桿菌菌株。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與采集

母乳樣品來源于新疆維吾爾自治區(qū)婦幼保健醫(yī)院6名哺乳期身體狀況良好的漢族和維吾爾族志愿者婦女分娩后4～5 d內(nèi)分泌的初乳汁。

母乳樣品采集時(shí)需戴好一次性無菌手套,用潔凈布擦拭乳頭以及周圍,手動(dòng)收集母乳,丟棄最初的3～5 滴母乳后收集10滴母乳于15 mL無酶無菌離心管內(nèi)。6份母乳樣品分別做好標(biāo)記(HM1～HM6),標(biāo)記后用封口膜封好管口,迅速置于冰盒或加入保護(hù)劑液氮速凍。轉(zhuǎn)移至車載冰箱-4 ℃保存后,低溫運(yùn)輸,盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化及保存

將6份母乳樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋后,選取10-3、10-4、10-5梯度涂布在RCM固體培養(yǎng)基上,在37 ℃、厭氧條件下,平板倒置,培養(yǎng)48 h;隨機(jī)挑取形態(tài)、大小、顏色不同的菌落于RCM液體培養(yǎng)基上,在37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)24 h;之后在RCM固體培養(yǎng)基上劃線純化2次,在37 ℃、厭氧條件下,平板倒置,培養(yǎng)48 h;挑取單個(gè)菌落于RCM液體培養(yǎng)基上,并在37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)24 h,記錄菌落形態(tài);連續(xù)培養(yǎng)至第3代,將二代菌液離心,收集菌泥,利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌DNA,并用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測,若A260/A280值范圍保持在1.8～2.0即視為純DNA樣品。按照表1的擴(kuò)增程序,利用擴(kuò)增儀進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增,擴(kuò)增完成后,將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行16S rRNA基因測序及同源性比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用于菌種鑒定[12];將培養(yǎng)3代菌液8 000 r/min離心,用PBS緩沖液洗滌2次,革蘭氏染色后鏡檢并觀察記錄,對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行拍照保存;將革蘭氏染色陽性進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的純培養(yǎng)物確定為疑似乳酸菌[13],加入菌種保護(hù)劑,均勻分置于安瓿管進(jìn)行抽真空冷凍干燥保藏。

表1 PCR 50 μL反應(yīng)體系(30個(gè)循環(huán))及擴(kuò)增程序Table 1 PCR 50 μL reaction system (30 cycles) and amplification program

1.2.2 具有潛在益生特性菌株的篩選

a)供試菌液的制備

將獲得的雙歧桿菌株接種于RCM液體培養(yǎng)基中于37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h,進(jìn)行3次傳代后,離心收集菌體細(xì)胞加入40 mL PBS制備供試菌液。

b)耐受pH 2.5試驗(yàn)

綜上所述，本研究觀察的是2種手術(shù)后早期各參數(shù)的變化，2種手術(shù)方式均會(huì)引起不同程度的干眼，但術(shù)后1個(gè)月各指標(biāo)均已無顯著性差異。同F(xiàn)LEx相比，SMILE的眼表損傷和炎癥反應(yīng)較小，是一種微創(chuàng)安全的治療近視和散光的角膜屈光手術(shù)方式。

將供試菌液按2%接種于pH 2.5的RCM液體培養(yǎng)基,在37 ℃、厭氧條件下,培養(yǎng)3 h,用一次性接種環(huán)蘸取上述培養(yǎng)3 h后的RCM液體培養(yǎng)基并于RCM固體培養(yǎng)基上劃線,在37 ℃、厭氧條件下,平板倒置,培養(yǎng)72 h后,觀察是否生成菌落。

c)對(duì)人工胃腸液耐受性試驗(yàn)

人工胃腸液的配制及其耐受性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]所用方法進(jìn)行。對(duì)具有潛在耐酸特性的供試菌液進(jìn)行10倍稀釋計(jì)數(shù),即為0 h原菌液活菌數(shù)[15]。取制備菌液與pH 2.5人工胃液混合,37 ℃下厭氧培養(yǎng)3 h后,用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù),轉(zhuǎn)接入人工腸液(pH 8.0)中,置37 ℃、厭氧培養(yǎng),記錄3、4、7、8、11 h的活菌數(shù),隨后計(jì)算存活率,如公式(1)所示:

(1)

d)對(duì)膽鹽耐受性試驗(yàn)

以MRS液體培養(yǎng)基(含0.2%巰基乙酸鈉)為空白對(duì)照,配制含牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基(含0.2%巰基乙酸鈉,0.3%的Oxgall),將培養(yǎng)末期的菌株按1%接種量接種于這兩種培養(yǎng)基并置于37 ℃厭氧培養(yǎng),每小時(shí)取樣測定600 nm吸光度下的OD值,當(dāng)菌株OD600值增加0.3個(gè)單位以上時(shí)停止培養(yǎng)。以延滯期長短作為菌株耐受膽鹽能力的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),延滯期是指實(shí)驗(yàn)組和空白組菌株吸光度增加0.3個(gè)單位所需時(shí)間的差值[16]。

1.2.3 生理生化試驗(yàn)鑒定

表2 生理生化試驗(yàn)條件Table 2 Physiological and biochemical test conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離鑒定結(jié)果

由新疆地區(qū)6份母乳樣品中乳酸菌的分離鑒定結(jié)果(表3)和相對(duì)含量(圖1)可知,6份母乳樣品中共分離出的69株乳酸菌,經(jīng)16S rRNA序列測定,歸類于7個(gè)屬11個(gè)種,其中Streptococcussalivarius共分離到27株,占總分離株的39.1%,為優(yōu)勢(shì)菌種;Enterococcusfaecalis共分離到19株,占總分離株的27.5%;其余菌種占33.4%。選取其中4株雙歧桿菌進(jìn)行后續(xù)潛在益生菌篩選試驗(yàn)。

圖1 乳酸菌分離株的相對(duì)含量Fig.1 Relative content of lactic acid bacteria isolates

表3 母乳分離株的分離鑒定匯總結(jié)果 單位:株Table 3 Summary results of isolation and identification of breast milk isolates

由圖2可知,菌株IMAU99747與模式株StaphylococcusaureusDSM20231(MN652637)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為S.aureus。菌株IMAU99761與模式株StaphylococcusepidermidisATCC14990(Z26894)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為S.epidermidis。菌株IMAU99681與模式株EnterococcusfaecalisNBRC 100481(AB681179)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為E.faecalis。菌株IMAU99675與模式株EnterococcusfaeciumDSMZ20477(MH544640)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為E.faecium。菌株IMAU99715與模式株StreptococcussalivariusATCC7073(AY188352)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為S.salivarius。菌株IMAU99745與模式株StreptococcusparasanguinisATCC15912(AF003933)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為S.parasanguinis。菌株IMAU99733與模式株LacticaseibacilluscaseiDSMZ20011(KP326371)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為L.casei。菌株IMAU99729與模式株LimosilactobacillusfermentumATCC14931(M58819)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為L.fermentum。菌株IMAU99737、IMAU99732與模式株LactiplantibacillusplantarumJCM1149(HM162417)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為L.plantarum。菌株IMAU99728與模式株Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisDSM10140(AB050136)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為B.animalissubsp.lactis。菌株IMAU99725、IMAU99726、IMAU99727與模式株BifidobacteriumlongumKCTC3128(GU361823)聚為一類,同源相似性為100%,故鑒定為B.longum。

圖2 母乳中部分乳酸菌分離株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of lactic acid bacteria isolated from breast milk

2.2 具有潛在益生特性菌株的初步篩選結(jié)果

2.2.1 雙歧桿菌耐受pH 2.5生長情況及凝乳情況

由表4可知,B.longumIMAU99727在pH 2.5生長情況最好,OD600值最高,且具有凝乳情況,B.animalissubsp.lactisIMAU99728和B.longumIMAU99726在pH 2.5生長情況較好,OD600值較高,且具有凝乳情況,而B.longumIMAU99725在pH 2.5生長情況較差,OD600值最低,并且無凝乳情況。

表4 雙歧桿菌耐受pH 2.5生長情況及凝乳情況Table 4 Growth and coagulation of Bifidobacterium tolerance to pH 2.5

2.2.2 菌株對(duì)人工胃腸液耐受性試驗(yàn)

由表5可知,B.longumIMAU99725和B.longumIMAU99726對(duì)人工胃液耐受性表現(xiàn)出的耐受力(pH 2.5)較弱,人工胃液中3 h后存活率不足50%;而B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728均對(duì)人工胃液耐受性表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受力(pH 2.5),其中B.longumIMAU99727對(duì)人工胃液耐受性的耐受力更好,與來源于人體腸道中的對(duì)照菌B.lactisBB12相比無顯著差異;4株菌對(duì)人工腸液(pH 8.0)表現(xiàn)的耐受力不同,其中B.longumIMAU99727對(duì)人工腸液的耐受性更好,最終存活率高于對(duì)照菌B.lactisBB12。

表5 菌株對(duì)人工胃腸液耐受性試驗(yàn)Table 5 Tolerance test of strains to artificial gastrointestinal fluid

2.2.3 菌株對(duì)膽鹽耐受性試驗(yàn)

由表6可知,B.longumIMAU99725和B.longumIMAU99726對(duì)膽鹽的耐受能力較差;B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728對(duì)膽鹽表現(xiàn)出較高水平的耐受性,與對(duì)照組菌株B.lactisBB12無顯著差異。

表6 試驗(yàn)菌株對(duì)肉湯培養(yǎng)基中0.3%牛膽鹽的耐受性Table 6 Tolerance of test strains to 0.3% bile salt in broth medium

通過發(fā)酵特性、體外胃腸液耐受性及膽鹽耐受性試驗(yàn)對(duì)菌株的初步篩選,結(jié)果表明,B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728與對(duì)照組菌株B.lactisBB12無明顯差異,具有益生能力,故選擇這2株菌進(jìn)行后續(xù)生理生化特性試驗(yàn)。

2.3 生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 最適溫度的確定

由圖3可知,當(dāng)溫度低于37 ℃時(shí),隨溫度的升高,B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728的OD600值呈逐漸增大的趨勢(shì),當(dāng)溫度為37 ℃,B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728生長較快,OD600值最大,菌懸液濃度較高。當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí),隨著溫度的升高,B.longumIMAU99727和菌株IMAU99728的OD600值呈降低的趨勢(shì),菌懸液濃度較低。在不同溫度下,B.longumIMAU99727的OD600值始終高于B.animalissubsp.lactisIMAU99728 OD600值,B.longumIMAU99727的活性較好。

圖3 菌株IMAU99727和IMAU99728最適溫度的確定Fig.3 Determination of optimum temperature of IMAU99727 and MAU99728注:Linear為線性趨勢(shì)線,表示OD600值以恒定的比率增加或減少(下同)。

2.3.2 菌株對(duì)pH的耐受性

由圖4可知,當(dāng)pH值低于7時(shí),OD600值呈逐漸上升趨勢(shì),此時(shí)B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728隨pH的升高,生長越快,菌懸液濃度越高,當(dāng)pH值為7時(shí),OD600值最高,此時(shí)B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728生長最好;當(dāng)pH值超過7時(shí),OD600值呈平緩下降趨勢(shì),當(dāng)pH值為3以下時(shí),OD600值較低,此時(shí)B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728幾乎不生長;因此B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728的適宜pH范圍為5.5～7.5。

圖4 菌株IMAU99727和MAU99728對(duì)pH的耐受性Fig.4 The tolerance of IMAU99727 and IMAU99728 to pH

2.3.3 菌株IMAU99727和IMAU99728對(duì)NaCl的耐受性

由圖5可知,B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728具有一定的耐鹽性,當(dāng)液體培養(yǎng)基NaCl添加量低于2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),OD600值迅速上升,說明在此范圍內(nèi)其對(duì)B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728的生長無明顯影響;當(dāng)NaCl添加量高于2%時(shí),OD600值呈下降趨勢(shì),此時(shí)B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728生長受到一定程度的抑制,且NaCl濃度越高,抑制越明顯。

圖5 菌株IMAU99727和IMAU99728對(duì)NaCl的耐受性Fig.5 The tolerance of IMAU99727 and MAU99728 to NaCl

2.3.4 生長曲線的繪制和菌株的產(chǎn)酸能力測定

從圖6中,B.longumIMAU99727的生長曲線可以看出,0～2 h是菌株的生長延滯期,OD600值保持緩慢上升;2～12 h為菌株的對(duì)數(shù)生長期,OD600值迅速增加;在12 h后菌株開始進(jìn)入穩(wěn)定期,18 h時(shí),OD600值達(dá)到最高,24 h后,OD600值開始下降,菌株進(jìn)入衰亡期。由B.animalissubsp.lactisIMAU99728的生長曲線可知,0～2 h時(shí),為菌株的生長延滯期,OD600值保持緩慢上升;2～14 h為菌株的對(duì)數(shù)生長期;16 h后OD600值開始緩慢增加,進(jìn)入菌株的穩(wěn)定期,18 h時(shí)OD600值達(dá)到最高;24 h后,OD600值顯示出下降趨勢(shì),菌株進(jìn)入衰亡期。由菌株的產(chǎn)酸曲線可知,20 h時(shí),B.longumIMAU99727的pH最低達(dá)到4.28;24 h時(shí),B.animalissubsp.lactisIMAU99728的pH達(dá)到最低4.28。菌株產(chǎn)生乳酸速度與pH下降速度、抑制其他細(xì)菌的能力成正比,綜上,0～18 h,B.longumIMAU99727比B.animalissubsp.lactisIMAU99728的pH低、OD600值高,因此B.longumIMAU99727比B.animalissubsp.lactisIMAU99728乳酸菌產(chǎn)酸速度快、生長速度快。

圖6 菌株IMAU99727和IMAU99728的生長曲線及產(chǎn)酸能力的測定Fig.6 Determination of growth curve and acid production capacity of strain IMAU99727 and IMAU99728

3 討論

母乳喂養(yǎng)是一個(gè)永恒的主題,隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展,世界早已公認(rèn)母嬰喂養(yǎng)對(duì)嬰兒健康的有利影響及其重要意義[17]。母乳具有極高的研究價(jià)值,大量研究證明母乳中以乳桿菌和雙歧桿菌為代表的益生菌有助于嬰兒消化系統(tǒng)和免疫功能的成熟,對(duì)其成長發(fā)育有不可替代的促進(jìn)作用[18]。特別是在嬰兒自身防御不成熟的脆弱時(shí)期,雙歧桿菌可以通過黏附腸道上皮細(xì)胞,參與防御病原體[19]。通過研究表明,從母乳中分離出的部分菌株具有明顯抑菌效果。雙歧桿菌(1.7%)和乳桿菌(0.4%)占比小,僅代表母乳細(xì)菌的一小部分,但至關(guān)重要[20]。尹春媚[21]從10份母乳樣品中篩選出22株乳酸菌,其中L.planturumR9具有較好的耐酸、耐膽鹽以及黏附特性。GUAN等[22]從人母乳中分離到1株新型S.thermophilusFUA329,并且證明S.thermophilusFUA329是1株新型尿石素A產(chǎn)生菌,有望用于尿石素A的工業(yè)化生產(chǎn)。因此從母乳中分離出乳酸菌具有抗感染作用、益生作用。

眾所周知,益生菌的攝入對(duì)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物均具有免疫調(diào)節(jié)作用,其中雙歧桿菌在免疫系統(tǒng)的成熟、結(jié)腸炎和腫瘤的預(yù)防中起著至關(guān)重要的作用。DEKKER等[23]研究發(fā)現(xiàn),益生菌B.animalissubsp.lactisHN019具有明顯的抗病毒效果,可以降低中國嬰兒上呼吸道感染。SABATé等[24]研究發(fā)現(xiàn),腸易激綜合征患者通過30 d的B.longum35624治療,可降低其疾病的嚴(yán)重程度并改善生活質(zhì)量,其中患有最嚴(yán)重腸易激綜合征的患者效果明顯。雙歧桿菌是人體微生物群的重要組成部分,在消化、腸道免疫和癌癥預(yù)防等方面發(fā)揮著重要作用,尤其對(duì)嬰兒腸道菌群的發(fā)育與健康狀況至關(guān)重要[25]。故而,本研究對(duì)新疆地區(qū)母乳中的雙歧桿菌優(yōu)良特性進(jìn)行篩選,為益生菌菌種資源庫提供廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本文利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對(duì)采新疆地區(qū)的6份母乳樣品進(jìn)行乳酸菌分離鑒定,共分離出69株乳酸菌,經(jīng)16S rRNA基因序列測定,這69株菌被鑒定為乳酸菌于7個(gè)屬11個(gè)種及亞種,其中S.salivarius為本次研究中該地區(qū)母乳的優(yōu)勢(shì)菌種。此外,本文從母乳來源的分離株篩選獲得B.longumIMAU99727和B.animalissubsp.lactisIMAU99728兩株潛在益生菌,具有良好的發(fā)酵特性、體外胃腸液耐受性及膽鹽耐受性,有望作為新的母乳源益生菌進(jìn)行其他益生特性研究和開發(fā)利用。