復(fù)配精油抑菌劑的制備及其對(duì)鮮切豬肉的抑菌作用

李娜,喬宏萍,王宇欣,安金花,杜曉雅,李曉君

1(太原師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山西 晉中,030619)2(中北大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,山西 太原,030000)

植物精油[1]是從芳香植物中的器官通過壓榨、蒸餾等方法制備而得,最常用的方法為水蒸氣蒸餾法[2],該方法適用于水溶性較差精油的提取。植物精油用途廣泛,常因?yàn)槠淝呷诵钠⒌南阄都皬V泛的抑菌性而用于化妝品中,桂宇豪等[3]對(duì)6種精油的研究表明,精油具有溫和性與適當(dāng)?shù)谋ｕr作用,從而使化妝品中防腐劑用量及刺激性均有所降低。天然植物中提取出來的有效殺菌成分,其所具有的優(yōu)點(diǎn)是其他殺菌劑所無法比擬的,即容易分解、毒性較低、安全環(huán)保[4]、抗藥性產(chǎn)生率低[5]等,其相比于毒性較強(qiáng)、殘留量較高的化學(xué)合成殺菌劑[6],天然的植物精油更受歡迎,更安全且環(huán)保性能更高[7],并且具有能讓水果保鮮的特性[8],契合當(dāng)今人們的需求,具備良好的應(yīng)用前景和發(fā)展優(yōu)勢(shì),是一種極有潛力的生物資源[9]。

肉桂屬于樟科植物,其主要成分肉桂醛具有良好的抑菌作用[10];紫蘇是唇形科植物,在我國(guó)資源豐富,苑佳佳[11]研究表明不同品種的紫蘇葉精油對(duì)于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均具有抑菌作用;牛至常作為調(diào)味品使用,由于酚類及萜烯類的存在使其具有較強(qiáng)的抗菌性[12]。消毒劑是指具有消毒作用的藥物,主要作用于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及核酸[13]。復(fù)配精油可緩解單一植物精油的弊端,推動(dòng)新型消毒劑的研發(fā),進(jìn)一步優(yōu)化配比,實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展[14]。王帆等[15]研究表明,不同精油間的復(fù)配有抑菌增效的作用,在保證抑菌作用的前提下可有效降低所需生產(chǎn)成本。

各種肉及肉制品是人類獲取蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分的重要來源,肉制品品質(zhì)的好壞直接關(guān)系到人類健康,隨著人們生活水平的提高,人們對(duì)肉制品的質(zhì)量要求也愈來愈高。肉制品品質(zhì)的評(píng)定指標(biāo)主要包括感官特征、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、理化性質(zhì)等,因此,通過測(cè)定肉制品水分含量、pH值、蛋白質(zhì)含量、感官指標(biāo)以及菌落總數(shù)等可以更好地反應(yīng)肉制品的好壞程度。目前,對(duì)鮮切豬肉防腐保鮮的主要方法是使用化學(xué)合成防腐保鮮劑,雖然化學(xué)合成防腐保鮮劑的防腐保鮮效果較好,但很多市售化學(xué)合成保鮮劑通常含有對(duì)人體健康存在潛在危害的化學(xué)合成類物質(zhì),不利于保障食品安全與人類健康。因此,本試驗(yàn)通過研究肉桂精油、紫蘇精油和牛至精油復(fù)配時(shí)的抑菌作用,制備一種以植物精油為主要成分的天然防腐保鮮劑,并對(duì)鮮切豬肉的抑菌作用進(jìn)行研究,以期為新型植物精油抑菌保鮮劑的制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肉桂精油、紫蘇精油、牛至精油均由水蒸氣蒸餾法提取所得;新鮮豬肉若干,山西省太原市連鎖超市;其他試劑均為分析純?cè)噭?上海麥克林生化科技有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)CGMCC 44568、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC 26085,中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Tween-80濃度確定

植物精油消毒劑制備過程中“油水互溶”是關(guān)鍵技術(shù)之一,Tween-80作為一種增溶劑[16],極易吸附到油水界面處[17],從而增加精油在水中的溶解性,進(jìn)一步促進(jìn)油水體系的均一性與穩(wěn)定性,因而,本實(shí)驗(yàn)采用Tween-80為增溶劑,設(shè)置添加量梯度為5、10、15、20 μL/mL,固定精油含量為10 μL/mL,利用超聲波振蕩儀振蕩2～3 min,使其充分混合均勻。通過觀察油水體系的透明度來判斷Tween-80的最佳濃度。

1.2.2 三種精油的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)

取無菌96孔板,以無菌水作對(duì)照,采用微量二倍稀釋法[18],獲得精油質(zhì)量濃度為0～20 mg/L的菌懸液,37 ℃培養(yǎng)24 h。同一菌種同一精油操作重復(fù)3次。在小孔內(nèi)或試管內(nèi)可完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MIC[17]。

1.2.3 復(fù)配精油分級(jí)抑菌濃度(graded bacteriostatic concentration,FIC)指數(shù)

根據(jù)單一植物精油MIC,采用棋盤稀釋法[18],將肉桂精油、紫蘇精油及牛至精油進(jìn)行兩兩復(fù)配。取無菌96孔板,在1～6列依次加入2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC一種精油50 μL,在A～F行依次加入2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC的另一種精油50 μL,最后加入菌液50 μL,37 ℃培養(yǎng)24 h。每一種復(fù)配重復(fù)做3次。FIC指數(shù)[19]是對(duì)兩種抗菌藥的聯(lián)合藥敏情況的描述,包括協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗4種情況,其計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0為A組分聯(lián)合使用時(shí)的MIC值;A為A組分單獨(dú)使用時(shí)的MIC值;B0為B組分聯(lián)合使用時(shí)的MIC值;B為B組分單獨(dú)使用時(shí)的MIC值。當(dāng)FIC≤0.5時(shí)為協(xié)同作用,當(dāng)0.052時(shí)為拮抗作用[20]。

1.2.4 復(fù)配精油抑菌保鮮劑對(duì)鮮切豬肉的保鮮作用

將新鮮豬肉平均分成空白對(duì)照組(CK:直接放入密封性良好的保鮮)和實(shí)驗(yàn)組(放入密封性良好的保鮮盒后,將最優(yōu)比例復(fù)配精油抑菌保鮮劑浸泡過的活性炭置于培養(yǎng)皿中,并放入保鮮盒),每天取樣測(cè)定鮮切豬肉的生化指標(biāo)。參考GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》,采用直接干燥法測(cè)定水分含量;參考GB/T 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》測(cè)定豬肉pH值;采用高鹽法提取蛋白質(zhì)[20],考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定豬肉中蛋白質(zhì)含量[16];參考GB/T 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》及平板計(jì)數(shù)法測(cè)定豬肉中微生物總量;用色差儀對(duì)豬肉糜的L*值、c*值、h*值進(jìn)行測(cè)定并記錄,每個(gè)試樣取3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值,采用Origin 2019軟件進(jìn)行作圖,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異性分析,P<0.05表示具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01表示具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tween-80濃度

通過比對(duì),當(dāng)Tween-80含量為15 μL/mL時(shí),總體系開始清澈透明,且靜置一段時(shí)間后仍呈現(xiàn)為透明均一的單相液體,因此,本次實(shí)驗(yàn)操作所用Tween-80含量為15 μL/mL。

2.2 三種精油對(duì)兩種供試菌的MIC

通過微量二倍稀釋法測(cè)定3種精油對(duì)兩種供試菌的MIC,結(jié)果如圖1所示,肉桂精油、紫蘇精油、牛至精油對(duì)于E.coli和S.aureus均具有抑菌作用,3種精油對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌效果均表現(xiàn)為肉桂精油>紫蘇精油>牛至精油。

圖1 植物精油的MICFig.1 MIC of essential oils

2.3 復(fù)配精油FIC指數(shù)

2.3.1 肉桂精油-紫蘇精油的聯(lián)合抗菌效果

表1為肉桂精油與紫蘇精油復(fù)配物對(duì)E.coli和S.aureus的抑制效果。在體積比為1：1時(shí),肉桂精油與紫蘇精油的聯(lián)合作用對(duì)E.coli的MIC為1/2 MICCEO～1/8 MICPEO,對(duì)S.aureus的MIC為1/2 MICCEO～1/4 MICPEO。其FIC值如表2所示,結(jié)合FIC指數(shù)的判定標(biāo)準(zhǔn)可知,肉桂-紫蘇精油復(fù)配物對(duì)E.coli和S.aureus的FIC值均>0.5且≤1,2種精油的聯(lián)合作用比單一作用均表現(xiàn)為相加作用,復(fù)配精油的MIC值較一種精油單獨(dú)使用時(shí)的MIC值都有顯著的降低,復(fù)配精油對(duì)E.coli的MIC值為2種精油單獨(dú)使用的1/2和1/8倍;對(duì)S.aureus的MIC值為2種精油單獨(dú)使用的1/2和1/4倍。

表1 肉桂-紫蘇精油復(fù)配物對(duì)E.coli和S.aureus的抑制效果Table 1 Antibacterial effect of cinnamon-perilla essential oil complex on E.coli and S.aureus

表2 肉桂-紫蘇精油復(fù)配FIC指數(shù)Table 2 FIC index of cinnamon-perilla essential oil complex

2.3.2 肉桂精油與牛至精油的聯(lián)合抗菌效果

表3為肉桂精油與牛至精油復(fù)配物對(duì)E.coli和S.aureus的抑制效果。在體積比為1：1的前提下,肉桂精油與牛至精油的聯(lián)合作用對(duì)E.coil的MIC為1/8 MICCEO～1/2 MICOEO,對(duì)S.aureus的MIC為1/4 MICCEO～1/4 MICOEO。其FIC值如表4所示,肉桂精油與牛至精油復(fù)配后對(duì)于E.coli的FIC值>0.5且≤1,2種精油的聯(lián)合作用效果表現(xiàn)為相加作用,對(duì)E.coli的抑制作用顯著增強(qiáng),其MIC值為2種精油單獨(dú)使用的1/8和1/2倍;肉桂精油與牛至精油復(fù)配后對(duì)于S.aureus的FIC值為0.5,2種精油的聯(lián)合作用比單一作用表現(xiàn)為協(xié)同作用,其MIC值為兩種精油單獨(dú)使用的1/4倍。

表3 肉桂-牛至精油的復(fù)配物對(duì)E.coli和S.aureus的抑制效果Table 3 Antibacterial effect of cinnamon-oregano essential oil complex on E.coli and S.aureus

表4 肉桂-牛至精油復(fù)配FIC指數(shù)Table 4 FIC index of cinnamon-oregano essential oil complex

2.3.3 紫蘇精油與牛至精油的聯(lián)合抗菌效果

表5為紫蘇精油與牛至精油復(fù)配物對(duì)E.coli和S.aureus的抑制效果。在體積比為1：1的前提下,紫蘇精油與牛至精油的聯(lián)合作用對(duì)E.coli的MIC為1/2 MICPEO～1/2 MICOEO,對(duì)S.aureus的MIC為1/8 MICPEO～1/2 MICOEO。其FIC值如表6所示,紫蘇-牛至精油復(fù)配物對(duì)于E.coli和S.aureus的FIC值均>0.5且≤1,2種精油的聯(lián)合抑菌作用均表現(xiàn)為相加作用,聯(lián)合抑菌作用顯著高于單一精油的單獨(dú)抑菌作用。

表5 紫蘇-牛至精油的復(fù)配物對(duì)E.coli和S.aureus的抑制效果Table 5 Antibacterial effect of perilla-oregano essential oil complex on E.coli and S.aureus

表6 紫蘇-牛至精油復(fù)配FIC指數(shù)Table 6 FIC index of perilla-oregano essential oil complex

2.3.4 復(fù)配精油FIC值對(duì)應(yīng)濃度的抑菌效果

LB固體培養(yǎng)基表面對(duì)照組菌落致密,甚至多數(shù)呈菌苔狀;實(shí)驗(yàn)組中菌落稀疏,其菌落數(shù)如圖2所示,3種復(fù)配組合中肉桂-紫蘇精油復(fù)配物的抑菌效果顯著優(yōu)于其他2種復(fù)配精油。

圖2 復(fù)配精油的菌落數(shù)Fig.2 Colony number of essential oils complex注:**表示P<0.01。

2.4 肉桂-紫蘇精油復(fù)配抑菌保鮮劑對(duì)鮮切豬肉的保鮮效果

2.4.1 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)鮮切豬肉水分含量的影響

鮮切豬肉中占比最大的是水分,鮮切豬肉在貯藏期間,由于外界環(huán)境的變化等因素,鮮肉中的水分會(huì)發(fā)生蒸騰作用,導(dǎo)致水分迅速流失,表面松弛,彈性喪失,質(zhì)地下降。由圖3可知,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),鮮豬肉的含水量不斷下降,呈現(xiàn)出持續(xù)的失重現(xiàn)象。但在貯藏1～4 d,空白對(duì)照組含水量從23%下降到5%,而實(shí)驗(yàn)組含水量從23%上升到18%,實(shí)驗(yàn)組水分含量在貯藏期間顯著高于對(duì)照組。因此肉桂-紫蘇精油復(fù)配抑菌保鮮劑處理可以一定程度的防止鮮切豬肉水分過快的損失,從而延緩豬肉的萎縮與品質(zhì)的下降。

圖3 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)鮮切豬肉水分含量的影響Fig.3 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on water content of freshly cut pork in storage

2.4.2 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)貯藏中鮮切豬肉pH值的影響

由圖4可知,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),鮮切豬肉pH值呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì),且空白對(duì)照組pH值增幅較實(shí)驗(yàn)組大。在貯藏1 d后,空白對(duì)照組豬肉pH值已經(jīng)超過7.00,而實(shí)驗(yàn)組對(duì)pH值的平衡作用在1～3 d較為顯著,且實(shí)驗(yàn)組pH值始終低于空白組。這可能是由于蛋白質(zhì)的降解所致,蛋白質(zhì)是一種高分子的兩性化合物,是影響肌肉pH的重要因素,隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),在微生物及其分泌的酶的作用下,肌肉蛋白被降解為多肽和氨基酸,并釋放堿性基團(tuán),從而使肉的pH值逐漸升高,同時(shí)加熱處理對(duì)pH值也有影響[21-22]。

圖4 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)貯藏中鮮切豬肉pH的影響Fig.4 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on pH of freshly cut pork in storage

2.4.3 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)貯藏中鮮切豬肉蛋白質(zhì)含量的影響

豬肉中除水分以外的主要組分是蛋白質(zhì)和脂質(zhì),肌肉中蛋白質(zhì)大致分為四類,其中,肌原纖維蛋白也稱為鹽溶性蛋白,約占總蛋白含量的50%[23],在鮮肉貯藏過程中,微生物會(huì)對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行分解,導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量下降。由圖5可知,雖然蛋白質(zhì)含量都在下降,但空白對(duì)照組蛋白質(zhì)含量都在實(shí)驗(yàn)組之下,證明肉桂-紫蘇精油復(fù)配抑菌保鮮劑可有效抑制蛋白質(zhì)的分解。

圖5 復(fù)配精油抑菌劑處理對(duì)貯藏中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on protein content of freshly cut pork in storage

2.4.4 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)貯藏中鮮切豬肉微生物數(shù)的影響

肉類食品中腐敗微生物的來源十分廣泛,污染的主要微生物有腸桿菌屬、莫拉氏菌屬、假單胞菌、氣單胞菌等[24]。菌落總數(shù)是評(píng)價(jià)食品安全時(shí)的重要指標(biāo),可以用來預(yù)測(cè)食品的保質(zhì)期,同時(shí)可以作為食品細(xì)菌污染指標(biāo),是判定肉類被污染指數(shù)的主要依據(jù)之一[25]。由圖6可知,空白對(duì)照組豬肉在貯藏5 d后,其細(xì)菌數(shù)已超過5.0×106CFU/g,成為變質(zhì)肉,而實(shí)驗(yàn)組第8天仍未變質(zhì),且空白對(duì)照組菌落增長(zhǎng)速度比實(shí)驗(yàn)組快,證明肉桂-紫蘇精油復(fù)配抑菌保鮮劑對(duì)細(xì)菌有抑制作用。

圖6 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)貯藏中鮮切豬肉微生物菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on number of bacterial of freshly cut pork in storage

2.4.5 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)貯藏中鮮切豬肉色澤的影響

肉桂-紫蘇精油復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)豬肉L*(亮度)、C*(色度值)、H*(色調(diào)值)的影響如圖7所示。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組牛肉亮度與色度均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),但實(shí)驗(yàn)組牛肉亮度顯著高于空白對(duì)照組,說明肉桂-紫蘇精油復(fù)配抑菌保鮮劑處理可有效保持牛肉的亮度;隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),豬肉色調(diào)值變化呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì),且空白對(duì)照組均高于實(shí)驗(yàn)組。色澤是消費(fèi)者購(gòu)買肉類時(shí)最直觀的指標(biāo),決定牛肉顏色的主要是肌紅蛋白和血紅蛋白。因此,肉桂-紫蘇精油復(fù)配抑菌保鮮劑可能是通過影響牛肉中肌紅蛋白和血紅蛋白的含量從而達(dá)到保鮮豬肉的作用。

A-亮度;B-色度;C-色調(diào)圖7 復(fù)配抑菌保鮮劑處理對(duì)貯藏中豬肉亮度、色度和色調(diào)的影響Fig.7 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on L*, C*, H* value of freshly cut pork in storage

3 結(jié)論與討論

本研究所選取的肉桂精油、紫蘇精油、牛至精油均是天然可食用植物的代謝產(chǎn)物,與化學(xué)合成物相比,都是綠色、安全、廣譜且可食用原料,均具有較好的抑菌作用。對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌而言,肉桂精油的抑菌作用最強(qiáng),紫蘇精油次之,牛至精油的抑菌作用最差;將3種精油兩兩復(fù)配,除肉桂-紫蘇精油復(fù)配物對(duì)金黃色葡萄球菌的聯(lián)合抗菌作用表現(xiàn)為協(xié)同作用外,其余精油間的復(fù)配組合對(duì)于2種不同供試菌的聯(lián)合抗菌效果均表現(xiàn)為相加作用,其中,肉桂-紫蘇精油復(fù)配物對(duì)兩種供試菌種的抗菌效果最佳,且復(fù)配植物精油相比單一精油具有更加芳香、愉悅的香氣,作為天然抗菌劑在食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著人們生活水平的提高及對(duì)肉類食品的青睞,色澤均勻、鮮嫩多汁且營(yíng)養(yǎng)豐富的鮮肉成為貨架上的寵兒,然而,鮮肉在生產(chǎn)及銷售的過程中極易受到微生物的污染,從而使鮮肉的品質(zhì)下降,貨架期縮短,目前,對(duì)鮮肉微生物的控制措施主要集中在化學(xué)抑菌劑的應(yīng)用,如添加一定濃度的山梨酸鉀或者檸檬酸可抑制微生物的生長(zhǎng),防止鮮肉變質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分的損失[26];雖然化學(xué)抑菌劑抑菌效果良好,但是植物源抑菌劑,尤其是辛香料植物精油由于具有廣譜的抗氧化和抑菌作用,往往更受人們青睞,常被優(yōu)先選作天然的抑菌原料。根據(jù)柵欄技術(shù)原理[27],將不同的植物精油進(jìn)行復(fù)配,既可以發(fā)揮其協(xié)同或相加作用,增強(qiáng)抑菌效應(yīng),又可以減少單一精油的使用量,使每種精油的使用量保持在較低的濃度范圍內(nèi),節(jié)約成本。因此,使用復(fù)配精油對(duì)鮮切肉進(jìn)行保鮮抑菌已成為肉類保鮮的必然趨勢(shì),本研究中肉桂-紫蘇精油復(fù)配物在一定程度上可以抑制鮮切豬肉水份和蛋白質(zhì)含量的損失、有效抑制大腸桿菌等微生物的生長(zhǎng)和pH值的升高,保持鮮切豬肉的色澤和亮度,從而延長(zhǎng)鮮切豬肉的貨架壽命。植物精油在防腐保鮮劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中,有著巨大的潛力,安全高效的防腐保鮮劑已經(jīng)逐漸融入到我們所現(xiàn)有的生產(chǎn)中,同時(shí)還被嵌入形成腐爛后進(jìn)行精準(zhǔn)控制的技術(shù)中,這些都可以取代或減少有害的傳統(tǒng)化學(xué)防腐保鮮劑的使用,本次實(shí)驗(yàn)可為植物精油抑菌保鮮劑的制備以及鮮切肉的抑菌保鮮提供一定理論參考。