基于網(wǎng)絡(luò)藥理學及體外實驗探討黃芪甲苷治療胃癌的機制

陳鳳琴，樊濤，寧月，王蒙，王宏偉，李海龍，（.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院內(nèi)科學教研室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室/甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000）

1 材料

1.1 細胞胃癌細胞MKN-45、HGC-27，購自中科院上海細胞庫。

1.2 藥品及主要試劑黃芪甲苷（HPLC法檢測純度＞98%），批號：20200410，寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；高糖DMED 培養(yǎng)基，批號：AH30012019，美國Hyclone 公司；胎牛血清，批號：22030701，浙江天杭生物科技有限公司；青鏈霉素雙抗，批號：CR2106481，武漢賽維爾生物科技有限公司；一抗GAPDH（批號：B2304）、PIK3R1（批號：B2307）、PIK3CA（批號：B2214）、HSP90AA1（批號：B2334）、MAPK1（批號：B2311）、HRAS（批號：B2324）抗體及二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（批號：B2319），均購自美國Immunoway 生物科技公司；BCA 試劑（批號：20220205）、配膠試劑（批號：20220302），均購自北京索萊寶科技有限公司；增強型ECL發(fā)光試劑，批號：M32110070，上海翌圣生物科技有限公司。

1.3 主要儀器DYCZ-24D型電泳儀，北京六一儀器廠；SpectraMax i3X 酶標儀，美國Molecular Devices公司；GelView 6300Plus 凝膠成像儀，廣州博鷺騰生物科技有限公司。

2 方法

2.1 黃芪甲苷作用靶點篩選通過SwissTarget 數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch）、TargetNet 數(shù)據(jù)庫（http：//targetnet.scbdd.com/calcnet/index/）、Super-PRED數(shù)據(jù)庫（https：//prediction.charite.de/index.php） 和pharmMapper 數(shù)據(jù)庫（www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）檢索黃芪甲苷作用靶點，去除重復(fù)基因，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）進行靶點信息確認和校正。

2.2 胃癌疾病相關(guān)靶點篩選以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞，分別從OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）和TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）中篩選出相關(guān)度得分＞20 的胃癌疾病相關(guān)靶點，去除重復(fù)基因，通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行靶點信息確認和校正。

2.3 潛在作用靶點的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選得到的黃芪甲苷作用靶點與胃癌疾病相關(guān)靶點在線導入Venny 2.1.0 可視化平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），繪制韋恩圖，取二者的交集靶點（共同靶點），即為黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點。將交集靶點在線導入STRING 平臺（https：//string-db.org），選擇“Multiple Proteins”模式，蛋白種屬設(shè)為“Home Sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值，隱藏游離節(jié)點，建立潛在作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.8軟件分析潛在作用靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，通過度值（Degree）篩選出黃芪甲苷治療胃癌的核心靶點，并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 潛在作用靶點的GO 功能及KEGG 通路富集分析利用R 語言包org.Hs.eg.db 軟件對交集靶點進行注釋，將靶點轉(zhuǎn)化為entrez ID；利用R 語言包clusterProfiler 軟件進行GO 功能及KEGG 通路富集分析，并對分析結(jié)果進行可視化處理。GO 功能富集分析包括生物學過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細胞組分（Cellular component，CC）。最后，利用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制“疾病-藥物-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖并分析。

2.5 分子對接驗證選擇“2.3”項下PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的黃芪甲苷治療胃癌的核心靶點分別與黃芪甲苷進行分子對接驗證。通過PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）下載核心靶點3D 結(jié)構(gòu)的pdb 格式文件；通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載黃芪甲苷2D結(jié)構(gòu)的sdf格式文件；使用ChemOffice軟件繪制黃芪甲苷的3D 結(jié)構(gòu)，輸出為pdb 格式文件；經(jīng)Pymol 軟件處理后，使用AutoDock 1.5.6 軟件進行核心靶點與黃芪甲苷的分子對接。

文獻報道神經(jīng)出入征是周圍神經(jīng)鞘瘤的特征性表現(xiàn)，多發(fā)生于神經(jīng)主干，好發(fā)部位據(jù)報道依次為頭、頸部、肢體、縱隔腹膜后及其他部位[3]，但發(fā)生在椎管內(nèi)的表現(xiàn)為神經(jīng)出入征的神經(jīng)源性腫瘤目前文獻報道較少。對于椎管內(nèi)形態(tài)為橢圓形的神經(jīng)源性腫瘤，影像學診斷除了形態(tài)學以外，通常還要結(jié)合MRI信號特點、對比劑增強特點等進行綜合分析。但是，對于同時合并神經(jīng)出入征的病變，結(jié)合本例報道，診斷神經(jīng)源性腫瘤的證據(jù)更為充分。但是，鑒于目前尚無關(guān)于椎管內(nèi)表現(xiàn)為神經(jīng)出入征的神經(jīng)鞘瘤的影像學報道，因此，對于此征象診斷椎管內(nèi)神經(jīng)鞘瘤的敏感性及特異性有待于進一步觀察。

2.6 細胞培養(yǎng)將MKN-45、HGC-27 胃癌細胞用含10%胎牛血清、100 μg·mL-1青/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d 更換完全培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

2.7 黃芪甲苷溶液配制將黃芪甲苷溶于DMSO配制20 mg·mL-1黃芪甲苷母液并用培養(yǎng)基稀釋，使其終濃度為20、40、80、120、160、200 μg·mL-1，DMSO濃度低于1%。

2.8 MTT 法檢測細胞增殖情況取對數(shù)生長期的MKN-45、HGC-27 胃癌細胞，制成單細胞懸液，按照1×104個·mL-1的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL。37 ℃孵育過夜后，對照組加入DMEM 完全培養(yǎng)基100 μL；黃芪甲苷組加入80 μL DMEM 完全培養(yǎng)基及20 μL 不同濃度（20、40、80、120、160、200 μg·mL-1）黃芪甲苷，使終體積為200 μL；另設(shè)只加PBS 的空白調(diào)零孔，每組設(shè)8 個復(fù)孔。分別干預(yù)24、48、72、96 h后，各孔加入20 μL MTT；繼續(xù)孵育4 h后，吸去上清液，各孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min；采用酶標儀在570 nm 波長下檢測各孔光密度（OD）值，計算：細胞相對活力（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

2.9 Western Blot 法檢測細胞PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS 蛋白表達取對數(shù)生長期MKN-45、HGC-27胃癌細胞，按照2×105個·mL-1的密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL；置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜；設(shè)置對照組及黃芪甲苷不同濃度組（80、120、160 μg·mL-1），每組設(shè)3 個復(fù)孔；干預(yù)48 h 后，分別收集各組MKN-45、HGC-27 胃癌細胞。加入蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取各組細胞總蛋白，采用BCA 法測定總蛋白濃度；將蛋白煮沸變性后，每組取15 μg蛋白樣品上樣；以12% SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入一抗PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS（均為1∶500）以及GAPDH（1∶1 000）孵育過夜；TBST洗膜3 次后，加入二抗（1∶5 000）孵育2 h；TBST 洗膜3 次后，ECL 顯影并掃描；以GAPDH 為內(nèi)參，采用ImageJ2x 軟件對蛋白條灰度值帶進行半定量分析。

2.10 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點通過SwissTarget、TargetNet、Super-PRED 和pharmMapper數(shù)據(jù)庫共篩選獲得黃芪甲苷作用靶點498 個；通過OMIM、GeneCards、TTD數(shù)據(jù)庫共篩選獲得胃癌疾病相關(guān)靶點958個；將篩選得到的黃芪甲苷作用靶點與胃癌疾病相關(guān)靶點導入Venny 2.1.0 可視化平臺，繪制韋恩圖（見圖1），得到87個交集靶點（共同靶點），即為黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點。

圖1 黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點Figure 1 Potential targets of astragaloside IV in the treatment of gastric cancer

3.2 黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)通過STRING數(shù)據(jù)庫進行黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點的PPI 分析，并將結(jié)果導入Cytoscape 3.8.2 軟件中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖2），該網(wǎng)絡(luò)包含86 個節(jié)點，1 451條邊，節(jié)點顏色越深表示該靶點在網(wǎng)絡(luò)中越重要；REG1A 與其他靶點沒有相互作用關(guān)系，故予以剔除。利用Cytoscape 3.8.2 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行參數(shù)特征計算，得到度值排前20 位的核心靶點，見表1。

表1 黃芪甲苷治療胃癌的核心靶點Table 1 Core targets of astragaloside IV in the treatment of gastric cancer

圖2 黃芪甲苷治療胃癌潛在作用靶點的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of potential targets of astragaloside IV in the treatment of gastric cancer

3.3 GO 功能及KEGG 通路富集分析將黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點GO功能富集分析結(jié)果分別根據(jù)P值選取排前10 位的BP、CC、MF 條目繪制柱狀圖，見圖3。BP 條目主要涉及蛋白激酶信號通路、氧化、化學應(yīng)激等；MF 條目主要涉及結(jié)合生長因子、蛋白磷酸酶、磷酸酶、胰島素受體底物、激素受體和激活轉(zhuǎn)錄因子、核受體、橫跨膜受體蛋白酪氨酸激酶、橫跨膜受體蛋白激酶、酪氨酸激酶等；CC 條目主要涉及ficolin-1、周期依賴蛋白激酶、蛋白激酶、細胞質(zhì)囊、細胞基質(zhì)等。KEGG通路富集分析共篩選出20 條與黃芪甲苷治療胃癌相關(guān)的通路（見圖4），并利用Cytoscape 3.8.2軟件繪制“疾病-藥物-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖5。結(jié)果表明，黃芪甲苷可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、Rap1 信號通路等多條通路發(fā)揮抗胃癌的作用。

圖3 黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點GO 功能富集分析（前10 位）Figure 4 GO enrichment analysis of the potential targets of astragaloside IV in the treatment of gastric cancer（Top 10）

圖4 黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點KEGG 通路富集分析Figure 4 KEGG pathway enrichment analysis of the potential targets of astragaloside IV in the treatment of gastric cancer

圖5 黃芪甲苷治療胃癌的“疾病-藥物-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)Figure 5 “Diseases-drugs-pathways-targets” network of astragaloside IV in the treatment of gastric cancer

3.4 分子對接驗證選擇“2.3”項下PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的黃芪甲苷治療胃癌的20 個核心靶點分別與黃芪甲苷進行分子對接驗證，通過結(jié)合能（Affinity）來評價受體與配體的親和力，通常認為結(jié)合能小于-5.0 kcal·mol-1有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能越低，親和力越強。結(jié)果表明，黃芪甲苷與PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS 的結(jié)合能均＜-5.0 kcal·mol-1，有較好的結(jié)合活性，其中黃芪甲苷與PIK3CA的親和力最強，見表2。

表2 黃芪甲苷與其治療胃癌的核心靶點分子對接結(jié)果Figure 2 Molecule docking results of components and core targets of astragaloside IV in the treatment of gastric cancer

3.5 黃芪甲苷對MKN-45、HGC-27 胃癌細胞增殖的影響結(jié)果見圖6。與對照組比較，黃芪甲苷在20～200 μg·mL-1濃度范圍，分別干預(yù)24、48、72、96 h 后，MKN-45、HGC-27 細胞相對活力均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈現(xiàn)明顯的時間、濃度依賴性。因此，選擇80、120、160 μg·mL-1黃芪甲苷作用48 h作為“2.9”項驗證實驗的干預(yù)條件。

圖6 黃芪甲苷對胃癌細胞MKN-45、HGC-27 增殖的影響（±s，n=8）Figure 6 Effects of astragaloside IV on proliferation of gastric cancer cells MKN-45 and HGC-27（±s，n=8）

3.6 黃芪甲苷對胃癌細胞關(guān)鍵靶點蛋白表達的影響結(jié)果見圖7。與對照組比較，120、160 μg·mL-1黃芪甲苷分別干預(yù)MKN-45、HGC-27 胃癌細胞48 h 后，PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

圖7 黃芪甲苷對MKN-45、HGC-27 胃癌細胞中PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS 蛋白表達水平的影響（±s，n=3）Figure 7 Effects of astragaloside IV on the protein expression levels of PIK3R1，PIK3CA，HSP90AA1，MAPK1 and HRAS in gastric cancer cells MKN-45 and HGC-27（±s，n=3）

4 討論

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制復(fù)雜，細胞死亡、免疫微環(huán)境、慢性炎癥及氧化應(yīng)激等均參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展[13-19]。黃芪甲苷是黃芪中的主要活性成分之一[20]，能夠通過Raf-MEK-ERK[21]、EGFR- Nrf2[22]、Akt/PDE3B[23]、PI3K/Akt/mTOR[10，24]、PKCα-ERK1/2-NF-κB[25]、Akt/GSK-3β/β-Catenin[26]、JNK/c-Jun/AP-1[27]和JAK2/STAT3[28]等多通路發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡、增強免疫、抑制腫瘤細胞遷移以及化療增敏等多方面藥理作用。研究表明，黃芪甲苷能夠通過抑制AKT和NF-κB通路，降低BCL-2/BAX 比值，增加Caspase-3 的活化，促進胃癌MGC-803 細胞凋亡[29]；通過上調(diào)miR-195-5p 抑制胃癌的EMT和血管生成[30]。黃芪甲苷具有治療胃癌的潛在價值，其具體機制值得深入探討。

本研究通過對黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點進行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及分子對接發(fā)現(xiàn)，PIK3R1、PIK3CA、MAPK1、HSP90AA1、HRAS可能是黃芪甲苷治療胃癌的核心靶點。同時通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可下調(diào)MKN-45、HGC-27 胃癌細胞中PIK3CA、PIK3R1、HSP90AA1、MAPK1、HRAS 蛋白表達水平。PIK3R1是PI3K（磷酸肌醇苷3-激酶）的主要調(diào)控亞型，編碼I 類PI3K，主要調(diào)控亞基P85a，抑制P110a 激酶的催化活性，增強脂質(zhì)磷酸酶活性[31]。PIK3CA 是突變頻率最高的致癌基因之一，突變的PIK3CA 可以激活PI3K/AKT 信號通路，在腫瘤發(fā)生和耐藥過程中發(fā)揮重要作用[32]。HSP90AA1 是真核生物中一種高度保守且非常重要的伴侶蛋白，基因位于染色體14q32.2上，是由一種柔性同型二聚體組成，其分子結(jié)構(gòu)由三個區(qū)域（n 端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和c 端結(jié)構(gòu)域）組成，幫助蛋白質(zhì)折疊，調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移和信號轉(zhuǎn)導等多種生物過程[33]。有研究[34-35]報道，HSP90與Akt激酶結(jié)合，防止Akt蛋白降解，幫助PI3K/Akt 信號通路功能穩(wěn)定，且發(fā)現(xiàn)Akt激酶和HSP90以伴侶復(fù)合物的形式存在于大量癌細胞系中。還有研究[36]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HSP90 可抑制HER2/PI3K/AKT 通路和PD-L1 的表達，從而抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移。HRAS是RAS家族的致癌基因，HRAS 在腸化生和胃癌中的突變率較高[37]。HRAS 是PI3K/AKT 信號通路的上游調(diào)控基因，可調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、代謝和血管生成。也有研究[38]發(fā)現(xiàn)，HRAS 在胃癌中顯著高表達，促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和促進血管生成，還能激活PI3K/AKT 信號通路促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。有研究[39]發(fā)現(xiàn)，金釵石斛的主要活性成分毛蕊花苷能通過抑制HRAS/PI3K/AKT 信號通路來抑制胃癌前病變（PLGC）。絲裂原活化蛋白激酶1 又稱MAPK1、p42MAPK和ERK2，是MAPK家族的成員之一，是一種由MAPK1 基因編碼的酶[40]。MAPK 是一個重要的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)，在細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展也起著重要作用，MAPK通路的異常激活主要是由于RAS和RAP蛋白的突變激活導致細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）通路激活的結(jié)果[40]。研究[41]發(fā)現(xiàn)，Ras-MAPK 信號通路（也稱為RAS-RAF-MEK-ERK 通路）可整合細胞外信號，抑制細胞增殖和分化。

通過對黃芪甲苷治療胃癌的潛在作用靶點的GO功能及KEGG 通路富集分析顯示，黃芪甲苷通過PI3K/AKT、MAPK、Ras和Rap1等信號通路參與胃癌的蛋白激酶信號通路、氧化、化學應(yīng)激等生物過程。PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路和Rap1 信號通路之間相互關(guān)聯(lián)，RAS 和RAP 蛋白的突變激活會導致細胞MAPK 通路的異常激活[42]；HRAS 是RAS 家族的致癌基因，同時也是PI3K/AKT信號通路的上游調(diào)控基因，HRAS 的突變也會導致PI3K/AKT 信號通路的異常激活[38]；Ras 蛋白是連接PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路和Ras信號通路的樞紐，共同參與黃芪甲苷調(diào)控胃癌的蛋白磷酸酶、磷酸酶、激素受體和激活轉(zhuǎn)錄因子、核受體、橫跨膜受體蛋白酪氨酸激酶、橫跨膜受體蛋白激酶和酪氨酸激酶等分子功能，以及參與胃癌的蛋白激酶信號通路、氧化和化學應(yīng)激等生物過程。

綜上所述，黃芪甲苷可能一方面通過下調(diào)PIK3CA、PIK3R1、HSP90AA1 和HRAS 蛋白表達直接或間接調(diào)控PI3K/AKT 信號通路，另一方面通過下調(diào)HRAS 和MAPK1 蛋白表達，調(diào)控MAPK 信號通路，通過多靶點、多通路干預(yù)胃癌的蛋白激酶信號通路、氧化、化學應(yīng)激等生物過程。本研究初步篩選了黃芪甲苷治療胃癌的核心靶點及調(diào)控通路，但相關(guān)結(jié)果仍有待進一步的生物學驗證。